De la Unitatea de Cercetare Ateroscleroza, Institutul de Cercetare King Gustaf V, Departamentul de Medicină, Spitalul Karolinska, Institutul Karolinska, Stockholm, Suedia.

De la Unitatea de Cercetare Ateroscleroza, Institutul de Cercetare King Gustaf V, Departamentul de Medicină, Spitalul Karolinska, Institutul Karolinska, Stockholm, Suedia.

De la Unitatea de Cercetare Ateroscleroza, Institutul de Cercetare King Gustaf V, Departamentul de Medicină, Spitalul Karolinska, Institutul Karolinska, Stockholm, Suedia.

De la Unitatea de Cercetare Ateroscleroza, Institutul de Cercetare King Gustaf V, Departamentul de Medicină, Spitalul Karolinska, Institutul Karolinska, Stockholm, Suedia.

Abstract

Trigliceridele sunt transportate în lipoproteinele plasmatice pentru a furniza energie țesuturilor periferice. În esență, lipoprotein lipaza (LPL) hidrolizează trigliceridele de bază în acizi grași liberi, fie pentru utilizare imediată în mușchi, fie pentru depozitare în țesutul adipos. Cu toate acestea, cealaltă față a monedei poate fi acumularea de particule lipoproteice rămase potențial aterogene. 1 Lipoproteinele cu densitate foarte mică (VLDL) sintetizate în ficatul uman au apoB-100 ca componentă proteică majoră spre deosebire de chilomicronii secretați din intestin după aportul de grăsimi, care au ca proteină structurală apoB-48. Cele două specii de lipoproteine ​​care conțin apoB împărtășesc și concurează pentru aceeași cale lipolitică 2, dar trigliceridele intestinale par a fi substratul preferat pentru LPL. ApoB-48 în chilomicroni și rămășițele acestora se găsesc la o concentrație plasmatică foarte scăzută atât în ​​starea de post cât și în cea postprandială, în timp ce VLDL apoB-100 crește semnificativ după aportul de grăsime, probabil din cauza hidrolizei întârziate. De fapt, o proporție majoră a lipoproteinemiei găsite după aportul de grăsimi este reprezentată de VLDL. Cu toate acestea, s-a demonstrat recent că o creștere a trigliceridelor VLDL reprezintă doar aproximativ 20% din trigliceridele postprandiale. 5

Ingerarea vitaminei A cu grăsimi dă naștere la marcarea esterului de retinil al chilomicronilor. 6 Prin urmare, suplimentarea mesei de test cu vitamina A a fost folosită în mod obișnuit ca mijloc de cuantificare a lipoproteinelor de origine intestinală în starea postprandială. 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Cu toate acestea, precizia utilizării vitaminei A în acest context a fost pusă la îndoială. 18 Palmitatul de retinil (RP) a apărut în lipoproteinele probabil endogene în puncte de timp târzii, iar vârful RP a fost întârziat comparativ cu vârfurile trigliceridelor plasmatice și apoB-48 observate după aportul de grăsime. 18

Metode

Subiecte

Bărbații sănătoși cu vârsta cuprinsă între 35 și 45 de ani au fost recrutați dintr-un sondaj de populație care a inclus 160 de subiecți de origine nord-europeană. Un total de 129 din cei 160 de bărbați abordați au fost de acord să dea probe de sânge pentru determinarea de rutină a lipoproteinelor plasmatice în repaus alimentar. Pentru a permite identificarea unui grup omogen de subiecți normolipidemici, s-a efectuat fenotiparea apoE 19, iar percentilele 90 pentru concentrațiile plasmatice de trigliceride VLDL și colesterolul cu lipoproteine ​​cu densitate mică (LDL) au fost utilizate pentru fenotiparea lipoproteinelor. După ce au fost selectați subiecți homozigoti pentru alela ε3 cu trigliceride VLDL plasmatice normale de post și colesterol LDL (sub 1,95 și respectiv 4,70 mmol/L), au rămas un total de 58 de subiecți. Dintre aceștia, 38 au fost selectați aleatoriu pentru prezentul studiu și li s-a cerut să vină pentru un test oral de toleranță la grăsime. Dintre cei 38, 9 au refuzat participarea și 2 nu au putut participa în cele din urmă, ceea ce a lăsat 27 de subiecte pentru prezentul raport.

Sarcina de grăsime orală

Prelevarea de sânge

Probele de sânge venos au fost extrase în tuburi sterile pre-răcite (Vacutainer, Becton Dickinson) conținând Na2EDTA (concentrație finală, 4 mmol/L), care au fost introduse instantaneu în apă cu gheață și protejate de lumină. Plasma a fost apoi recuperată în decurs de 30 de minute prin centrifugare cu viteză redusă (1.750g, 20 minute, 1 ° C) și menținut la această temperatură pe parcursul procedurilor de preparare. Fluorura de fenilmetilsulfonil (10 mmol/L, dizolvată în izopropanol) și aprotinina (1400 μg/ml) (Trasylol, Bayer) au fost adăugate imediat în plasma izolată înainte de fracționarea lipoproteinelor bogate în trigliceride la concentrații finale de 10 μmol/L și 28 μg/ml, respectiv.

Fracționarea lipoproteinelor

Determinarea ApoB-48 și ApoB-100

Determinarea RP

Plasma și fracțiile de lipoproteine ​​bogate în trigliceride au fost protejate de lumină pe tot parcursul procedurii de preparare. Volumele cuprinse între 100 și 250 μL plasmă și fracțiuni lipoproteice bogate în trigliceride au fost extrase cu 4 ml metanol și 4 ml hexan. Faza superioară a fost îndepărtată și solventul a fost evaporat cu un curent ușor de N2. Lipida a fost dizolvată în 200 μL metanol/cloroform (3: 1) și injectată într-un sistem de cromatografie lichidă de înaltă performanță (System Gold, Beckman). RP a fost eluat izocratic cu metanol, iar vârfurile au fost înregistrate prin absorbție UV la 326 nm. Vârfurile au fost integrate cu software-ul System Gold, iar concentrația a fost determinată cu o curbă standard de cinci diluții (7,6 până la 38 nmol) de RP foarte purificat (Sigma R-3375). Recuperarea medie a PR în fracții comparativ cu plasma a fost de 89 ± 15% la 3 ore și 86 ± 17% la 6 ore. La analiza aceluiași eșantion în triplicat, coeficienții de variație au fost de 1,8% pentru o plasmă cu un conținut ridicat (eșantion de 6 ore) și 5,8% pentru o eșantion de plasmă cu un conținut redus (eșantion de 9 ore).

Cifra de afaceri a lipoproteinelor marcate cu RP

Pentru a studia cifra de afaceri a lipoproteinelor bogate în trigliceride marcate cu RP, a fost utilizată o tehnică dezvoltată de Berr și Kern 24 25 cu modificări minore. Cinci bărbați sănătoși au ingerat masa amestecată suplimentată cu vitamina A. Plasmafereza a fost efectuată 4 ore mai târziu pentru a izola aproximativ 0,5 L de plasmă postprandială conținând lipoproteine ​​bogate în trigliceride marcate cu RP. Punga de plasmă a fost depozitată la 4 ° C pe o tavă cu agitare lentă și reinjectată intravenos la 24 de ore după plasmafereză. Subiecții au fost instruiți să ingereze un mic dejun ușor la 7 dimineața, iar perfuzia a avut loc la 11 la 11:30 în acea zi. Infuzia a fost finalizată în decurs de 4 până la 5 minute. Probele de sânge au fost prelevate înainte (trei probe timp de 7,5 minute) și 1, 2,5, 5, 7,5, 10, 15, 20, 30, 45, 60, 90, 120, 180, 240 și 360 de minute după terminarea perfuziei. Plasma a fost izolată din probe de sânge și pungi de plasmă, iar concentrația RP în fracțiuni de lipoproteine ​​Sf> 400, Sf 60 până la 400 și Sf 20 până la 60 a fost determinată așa cum s-a descris anterior. Tabelul 1 enumeră caracteristicile celor cinci subiecți supuși plasmaferezei și reinjectării plasmei postprandiale marcate cu RP.

Lipoproteine ​​plasmatice majore

Principalele lipoproteine ​​plasmatice în post (VLDL, LDL și lipoproteine ​​cu densitate mare [HDL]) au fost determinate de o combinație de ultracentrifugare preparativă și precipitare a lipoproteinelor care conțin apoB, urmată de analiza lipidelor. 26 Colesterolul total 27 și trigliceridele 28 au fost determinate în triplicat în plasmă și în fracțiile lipoproteice. Lipidele au fost extrase mai întâi cu cloroform/metanol. 29 Colesterolul și trigliceridele au fost apoi determinate pe un Ultrolab (LKB).

Analize statistice

S-au folosit metode convenționale pentru a calcula mediile și SD-urile. SD este dat în text; SEM este dat în figuri. Coeficienții de variație între test și intra-test au fost calculați conform procedurilor standard. 30 Coeficientul de variație a fost dat ca SD în procente. Asocierile dintre parametrii lipoproteinelor au fost determinate prin calcularea coeficienților de corelație a rangului Spearman.

Considerații etice

Protocolul de studiu a fost aprobat de comitetul local de etică de la Spitalul Karolinska. Toți subiecții au dat consimțământul informat.

Rezultate

Caracteristici de bază

La momentul încărcării orale de grăsimi, un total de 24 de bărbați aveau niveluri plasmatice de trigliceride VLDL și colesterol LDL în jeun sub percentilele 90 ale segmentului de vârstă al populației. Trei subiecți au prezentat hipertrigliceridemie ușoară până la moderată (trigliceride VLDL de 2,10, 2,81 și respectiv 4,95 mmol/L) și au fost analizați separat. Patru din cei 24 de bărbați normotrigliceridemici și 1 din cei 3 bărbați hipertrigliceridemici au fost fumători. Indicele de masă corporală a fost sub 28,0 kg/m 2 la toți subiecții (medie ± SD, 24,1 ± 2,2 și 24,6 ± 2,7 kg/m 2 la subiecții normotrigliceridemici și respectiv hipertrigliceridemici). Tabelul 2 prezintă concentrațiile plasmatice de post ale colesterolului și trigliceridelor în fracțiunile majore de lipoproteine. Subiecții hipertrigliceridemici au avut niveluri de colesterol LDL în același interval cu subiecții normotrigliceridemici (2,71 până la 3,84 mmol/L), în timp ce nivelurile lor de colesterol HDL au fost mai mici (0,66 până la 1,17 mmol/L).

Trigliceridele plasmatice au crescut de la 0,99 ± 0,35 la 2,31 ± 1,11 mmol/L la 4 ore și au revenit la valoarea inițială la 8 ore după aportul oral de grăsime la subiecții normotrigliceridemici (Fig. 1). Valoarea maximă pentru cei trei subiecți hipertrigliceridemici a fost atinsă la 4 ore și a revenit la valoarea inițială în decurs de 9 ore (Fig 1).

Concentrații de plasmă de post ApoB-48 și ApoB-100

A existat o eterogenitate considerabilă în răspunsurile la aportul de grăsimi al trigliceridelor plasmatice, apoB-48 și apoB-100 în subfracțiuni de lipoproteine ​​bogate în trigliceride, în ciuda faptului că au fost studiați subiecți sănătoși normolipidemici cu fenotip apo ε3/ε3. Creșterea relativă mediană a trigliceridelor plasmatice întregi între 0 și 3 ore a fost de 117% (interval, 20% până la 316%); cifra corespunzătoare pentru Sf 60 până la 400 apoB-100 a fost de 81% (interval, -20 până la 1912%). Interesant, creșterea relativă a Sf 60 la 400 apoB-48 a fost de 79% (3% până la 168%). Aceasta indică faptul că concentrația postprandială Sf 60 până la 400 apoB-100 a fost cea mai eterogenă variabilă.

Indicele masei corporale nu s-a corelat semnificativ cu creșterea apoB-100 în fracțiunile Sf 20 până la 60 și Sf 60 până la 400 între 0 și 3 ore sau cu creșterea corespunzătoare între 0 și 6 ore (datele nu sunt prezentate).

Relațiile dintre post și postprandial Concentrațiile ApoB-48 și ApoB-100

Cifra de afaceri a lipoproteinelor bogate în trigliceride postprandiale marcate cu RP

Discuţie

Prezentul studiu s-a referit la metabolismul lipoproteinelor bogate în trigliceride postprandiale la bărbații sănătoși după administrarea unei încărcări standardizate de grăsime pe cale orală. Concentrații foarte scăzute de lipoproteine ​​care conțin apoB-48 au fost găsite în starea de repaus alimentar, iar creșterile chilomicronilor și a resturilor lor după aportul de grăsimi au fost mici în termeni absoluți. În schimb, s-a observat o creștere substanțială a VLDL mare (Sf 60 până la 400 apoB-100), în timp ce concentrația plasmatică a VLDL mic (Sf 20 până la 60 apoB-100) nu a fost afectată de încărcătura de grăsime orală. Am descris anterior un răspuns similar la aportul de grăsime într-un studiu cuprinzând pacienți selectați normotrigliceridemici și hipertrigliceridemici bărbați tineri postinfarct și un grup mic de bărbați cu control normolipidemic. 4

Nivelurile plasmatice de apoB-100 și în special apoB-48 în diferitele fracții de lipoproteine ​​au fost oarecum mai mici în studiul de față decât în ​​studiul nostru anterior al unui grup mic de bărbați sănătoși. 4 Aceasta poate avea mai multe explicații. În primul rând, subiecții de control descriși anterior au fost cu aproximativ 10 ani mai în vârstă. În al doilea rând, o metodă îmbunătățită pentru cuantificarea apoB-48 și apoB-100 a fost utilizată în prezentul studiu, care a fost validată împotriva analizei aminoacizilor proteinelor respective. 23 Metoda anterioară s-a bazat pe cromogenitățile relative ale apoB-48 și apoB-100 în fracțiuni de lipoproteine ​​bogate în trigliceride pe geluri cu tije SDS-PAGE. Această ultimă procedură poate avea probleme metodologice inerente dacă gelurile sunt supraîncărcate. 23

Nivelurile plasmatice de post și postprandiale ale apoB-48 și apoB-100 în fracțiuni de lipoproteine ​​Sf> 400, Sf 60 până la 400 și Sf 20 până la 60 au arătat o eterogenitate considerabilă în ciuda faptului că subiecții normolipidemici neobezi sănătoși care au fost homozigoti pentru alela ε3 au fost selectate. Răspunsul postprandial de 3 ore al VLDL mare (Sf 60 până la 400 apoB-100) la aportul de grăsime a fost extrem de variabil, variind de la o scădere mică la o creștere de 20 de ori. Acest lucru a fost în contrast cu trigliceridele plasmatice întregi și resturile de chilomicron, a căror creștere a variat de la 20% la 300%.

În ciuda procedurii de selecție, 3 din cei 27 de subiecți au prezentat trigliceride plasmatice crescute în post la momentul testului de toleranță la grăsime pe cale orală. În studiile noastre recente asupra persoanelor hipertrigliceridemice cu ateroscleroză coronariană manifestă și cu un infarct miocardic anterior, a fost evident un tipar de eliminare întârziată atât a trigliceridelor plasmatice postprandiale, cât și a VLDL mare. Prin urmare, a fost de interes să remarcăm faptul că cei trei subiecți hipertrigliceridemici din prezentul studiu ar putea crește în mod clar lipoproteinele postprandiale la fel de eficient ca bărbații normotrigliceridemici. Sunt necesare studii suplimentare pentru a stabili dacă există o diferență în compoziția și metabolismul lipoproteinelor bogate în trigliceride postprandiale între subiecții hipertrigliceridemici cu și fără ateroscleroză coronariană manifestă.

În ciuda a peste 30 de ani de cercetări epidemiologice și clinice, relațiile dintre hipertrigliceridemie, lipoproteine ​​bogate în trigliceride și boli coronariene rămân obscure și mult dezbătute. 34 Din nivelurile plasmatice bazale respective și amplitudinile răspunsurilor la aportul de grăsime observate pentru resturile de chilomicron și VLDL în prezentul studiu, s-ar putea ipoteza că chilomicronii și resturile acestora sunt implicați în aterogeneză prin împiedicarea catabolismului normal al VLDL mediat de LPL.

lipoproteinelor

figura 1. Graficul liniar al trigliceridelor plasmatice după aportul de grăsime la subiecții normotrigliceridemici (n = 24, grafic inferior) și hipertrigliceridemic (n = 3, graficul superior). Valorile sunt medii ± SEM, cu SEM indicat prin bare.

Figura 3. Ploturi de linie de apoB-100 și apoB-48 în Sf 60 până la 400 și Sf 20 până la 60 fracțiuni lipoproteice de trei subiecți hipertrigliceridemici. Nivelurile corespunzătoare pentru grupul normolipidemic (subiecți martori) sunt indicate prin linii punctate. Valorile de control sunt medii ± SEM, cu SEM indicat prin bare.

Figura 5. Grafic liniar comparând concentrația plasmatică de retinil palmitat (RP, () și apoB-48 incremental în fracția de lipoproteine ​​Sf> 12 (•) după aportul de grăsime. Valorile sunt medii ± SEM, cu SEM indicat prin bare.

tabelul 1. Caracteristicile subiecților supuși studiilor de rulare in vivo a retinil palmitatului - lipoproteine ​​bogate în trigliceride și condiții experimentale de bază

RP indică palmitat de retinil; Sf, rata de flotație a lui Svedberg.

1 Volumul de plasmă postprandială care conține lipoproteine ​​bogate în trigliceride marcate cu RP obținute prin plasmafereză în momentul lipemiei alimentare maxime și reinjectate 24 de ore mai târziu.

masa 2. Concentrațiile de colesterol și trigliceride în jeun în plasmă și în fracțiunile majore de lipoproteine

VLDL indică lipoproteine ​​cu densitate foarte mică; LDL, lipoproteine ​​cu densitate mică; și HDL, lipoproteine ​​de înaltă densitate. Valorile sunt medii ± SD; n = 24.

Tabelul 3. Concentrațiile plasmatice de post ale ApoB-48 și ApoB-100 în fracțiuni de lipoproteine ​​Sf> 400, Sf 60 până la 400, Sf 20 până la 60 și Sf 12 până la 20

Sf indică rata de flotație a lui Svedberg; T, cantitatea de urme (1 Nivel de apoB-48 în această fracție a fost

Tabelul 4. Relațiile dintre post și postprandial (3, 6 și 9 ore) Nivelurile plasmatice ale ApoB-48 și ApoB-100 în fracțiunile de lipoproteine ​​Sf 60 până la 400 și Sf 20 până la 60

Sf indică rata de flotație a lui Svedberg. Valorile sunt coeficienți de corelație a rangului Spearman.

1 P 2 P

Tabelul 5. Număr calculat de molecule de palmitat de retinil per ApoB-48 - care conține particule lipoproteice în fracțiuni postprandiale Sf> 400, Sf 60 până la 400 și Sf 20 până la 60 de fracții lipoproteice

Sf indică rata de flotație a lui Svedberg. Valorile sunt medii ± SD.

Figura 2. Sus, grafic liniar al concentrațiilor de apoB-48 în fracțiuni lipoproteice Sf> 400 (•), Sf 60 până la 400 (▪) și Sf 20 până la 60 (▴) după aportul de grăsime. Conținutul de ApoB-48 al fracției Sf 12-20 nu este prezentat deoarece valorile au fost foarte scăzute și nu s-au modificat ca răspuns la încărcătura de grăsime orală. Valorile sunt medii ± SEM, cu SEM indicat prin bare. Partea inferioară, graficul liniar al concentrațiilor de apoB-100 în fracțiuni de lipoproteine ​​Sf 60 până la 400 (▪), Sf 20 până la 60 (▴) și Sf 12 până la 20 (○) după aportul de grăsimi. Conținutul de ApoB-100 al fracțiunii Sf> 400 nu este prezentat deoarece valorile au fost foarte mici și nu s-au modificat ca răspuns la încărcătura de grăsime orală. Valorile sunt medii ± SEM, cu SEM indicat prin bare.

Figura 4. Graficul liniar al concentrațiilor de palmitat de retinil (RP) în SF> 400 (•), Sf 60 la 400 (▪) și Sf 20 la 60 (▴) fracțiuni lipoproteice după aportul de grăsime. Conținutul de PR al fracțiunii Sf 12-20 nu este prezentat deoarece valorile au fost foarte scăzute și nu s-au modificat ca răspuns la încărcătura orală de grăsime. Valorile sunt medii ± SEM, cu SEM indicat prin bare.

Figura 6. Scatterplots care prezintă degradarea palmitatului de retinil (RP) în fracțiuni Sf> 400, Sf 60 până la 400 și Sf 20 până la 60 după injectarea plasmei postprandiale marcate cu RP la cinci subiecți. Timpul 0 este după perfuzia completă de plasmă.

Acest studiu a fost susținut de subvenții de la Consiliul Suedez pentru Cercetări Medicale (8691), Fundația Suedeză Heart-Lung, Fundația Marianne și Marcus Wallenberg, Fondul Regelui Gustaf V 80, Fondul Profesor Nanna Svartź, Fundația Nordic pentru Insulină, Fondul suedez pentru industria margarinei pentru cercetare în nutriție și Fundația Thuring. Dr. Hamsten este investigator de carieră al Fundației suedeze Heart-Lung. Îi suntem recunoscători lui Karin Danell-Toverud, Ninna Eriksson și Anita Larsson pentru asistență tehnică de specialitate.