Departamentul de afiliere pentru medicină internă, Universitatea din Campinas, Campinas, Brazilia

bogată

Departamentul de afiliere pentru medicină internă, Universitatea din Campinas, Campinas, Brazilia

Departamentul de afiliere pentru medicină internă, Universitatea din Campinas, Campinas, Brazilia

Departamentul de afiliere pentru medicină internă, Universitatea din Campinas, Campinas, Brazilia

Departamentul de afiliere pentru medicină internă, Universitatea din Campinas, Campinas, Brazilia

Departamentul de afiliere pentru medicină internă, Universitatea din Campinas, Campinas, Brazilia

Departamentul de afiliere pentru medicină internă, Universitatea din Campinas, Campinas, Brazilia

Departamentul de afiliere pentru medicină internă, Universitatea din Campinas, Campinas, Brazilia

Departamentul de Afiliere pentru Anatomie, Universitatea din Campinas, Campinas, Brazilia

Departamentul de afiliere pentru medicină internă, Universitatea din Campinas, Campinas, Brazilia

Departamentul de afiliere pentru medicină internă, Universitatea din Campinas, Campinas, Brazilia

  • Juliana C. Moraes,
  • Andressa Coope,
  • Joseane Morari,
  • Dennys E. Cintra,
  • Erika A. Roman,
  • José R. Pauli,
  • Talita Romanatto,
  • José B. Carvalheira,
  • Alexandre L. R. Oliveira,
  • Mario J. Saad

Cifre

Abstract

Consumul de grăsimi alimentare se numără printre cei mai importanți factori de mediu care duc la obezitate. La rozătoare, consumul de diete bogate în grăsimi bluntă semnalizarea anorexigenică a leptinei și insulinei în hipotalamus printr-un mecanism dependent de activarea in situ a inflamației. Deoarece transducția semnalului inflamator poate duce la activarea căilor de semnalizare apoptotice, am evaluat efectul hrănirii cu conținut ridicat de grăsimi asupra inducerii apoptozei celulelor hipotalamice. Aici, arătăm că consumul de grăsimi dietetice induce apoptoza neuronilor și o reducere a intrărilor sinaptice în nucleul arcuat și hipotalamusul lateral. Acest efect depinde de compoziția dietei și nu de aportul caloric, deoarece hrănirea în pereche nu este suficientă pentru a reduce expresia markerilor apoptotici. Prezența unui receptor TLR4 intact protejează celulele de alte semnale apoptotice. În inflamația hipotalamusului indusă de dietă, TLR4 exercită o dublă funcție, pe o parte activând căi pro-inflamatorii care joacă un rol central în dezvoltarea rezistenței la leptină și insulină și, pe de altă parte, limitând alte daune prin controlul apoptoticului activitate.

Citare: Moraes JC, Coope A, Morari J, Cintra DE, Roman EA, Pauli JR, și colab. (2009) Dieta bogată în grăsimi induce apoptoza neuronilor hipotalamici. PLOS ONE 4 (4): e5045. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005045

Editor: Xin-Yun Lu, Universitatea din Texas Health Science Center, Statele Unite ale Americii

Primit: 28 octombrie 2008; Admis: 2 martie 2009; Publicat: 2 aprilie 2009

Finanțarea: Această lucrare a fost susținută de subvenții de la Fundația 395 Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo și Conselho Nacional de 396 Desenvolvimento Científico e Tecnológico. Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Obezitatea rezultă dintr-un dezechilibru între aportul caloric și consumul de energie. Modificările stilului de viață, care au dus la creșterea consumului de grăsimi dietetice și la reducerea activității fizice au contribuit la epidemia mondială de obezitate [1]. Studii recente au arătat că consumul de grăsimi dietetice promovează rezistența hipotalamică la principalii hormoni anorexigenici, leptină și insulină, ducând la pierderea progresivă a echilibrului între consumul de alimente și termogeneză și, prin urmare, rezultând în creșterea masei corporale [2] - [4] ]. Rezistența funcțională la leptină și insulină în hipotalamus este o consecință a activării induse de dietă a semnalizării inflamatorii, în mod specific în acest loc al creierului, ceea ce duce la afectarea moleculară a leptinei și a transducției semnalului insulinei prin cel puțin patru mecanisme distincte; inducerea expresiei de semnalizare 3 a citokinelor (SOCS3) [5], activarea kinazei C-Jun N-terminale (JNK) și I kappa kinazei (IKK) [3] și inducerea proteinelor tirozin fosfatazei 1B (PTP1B) [6] ].

Căile inflamatorii și apoptotice sunt strâns legate, iar modificările subtile ale unora dintre factorii determinanți respectivi pot face ca echilibrul să ajungă la unul sau alt rezultat [7]. De exemplu, activarea căilor de transducție a semnalelor de către citokine precum TNF-α și IL-1β poate duce fie la efecte pro, fie anti-apoptotice pe lângă activitatea lor inflamatorie clasică [8], [9].

Deoarece echilibrul dintre supraviețuire și pierderea neuronilor hipotalamici poate avea un impact asupra controlului coordonat al hrănirii și al termogenezei [10], [11], am decis să evaluăm dacă consumul de cantități mari de grăsimi dietetice poate induce apoptoza celulelor în această regiunea anatomică. Rezultatele noastre arată că apoptoza neuronală este indusă de dieta bogată în grăsimi și că prezența unui receptor funcțional TLR4 protejează celulele hipotalamice de leziunile apoptotice.

Materiale și metode

Anticorpi, substanțe chimice și tampoane

Model experimental și protocoale de hrănire

Canulația intracerebroventriculară (icv) și analiza acțiunii leptinei și insulinei în hipotalamus

Pentru evaluarea inhibării induse de leptină și insulină a aportului alimentar, șobolanii au fost instrumentați stereotaxic folosind un aparat stereotaxic Stoelting, conform unei metode descrise anterior [12], [13]. Coordonatele au fost: anteroposterior, 0,2 mm/lateral, 1,5 mm/adâncime, 4,0 mm. Eficiența procedurii a fost testată la o săptămână după canulare prin evaluarea răspunsului la consumul de alcool provocat de icv angiotensina II [12]. După experimente, plasarea canulei a fost, de asemenea, evaluată prin histologie. Pentru determinarea aportului de alimente, șobolanii au fost lipsiți de alimente timp de 6 ore (de la 12 la 18 ore), iar la 18 ore au fost tratați cu insulină (2,0 µl, 10 −6 M), leptină (2,0 µl, 10 −6 M), sau soluție salină (2,0 pl). Ingerarea alimentelor a fost determinată în următoarele 12 ore, în timpul ciclului întunecat.

PCR în timp real și matrice de PCR

Extracția țesuturilor, imunoprecipitarea și imunoblotarea

Șobolanii au fost anesteziați și hipotalama a fost disecată și omogenizată imediat în tampon de solubilizare la 4 ° C [1% Triton X-100, 100 mM Tris - HCI (pH 7,4), 100 mM pirofosfat de sodiu, 100 mM fluorură de sodiu, 10 mM EDTA, 10 mM ortovanadat de sodiu, 2,0 mM PMSF și 0,1 mg aprotinin/ml] cu un generator Polytron PTA 20 S (model PT 10/35; Brinkmann Instruments, Westbury, NY, SUA). Materialul insolubil a fost îndepărtat prin centrifugare timp de 20 minute la 9000 × g într-un rotor 70. Ti (Beckman, Fullerton, CA, SUA) la 4 ° C. Concentrația de proteine ​​a supernatantelor a fost determinată prin metoda de legare a colorantului Bradford. Alicote ale supernatantelor rezultate care conțin 2,0 mg de proteine ​​totale au fost utilizate pentru imunoprecipitare cu anticorpi împotriva TLR4, Myd88, FADD, Apaf1 și IκB la 4 ° C peste noapte, urmate de SDS - PAGE, transfer în membranele de nitroceluloză și ștergere cu anti-Myd88, TLR4, caspase-8, caspase-9 și respectiv NFκB. În experimente imunoblot directe, 0,2 mg de extracte de proteine ​​au fost separate prin SDS - PAGE, transferate în membranele nitrocelulozice și șterse cu anticorpi anti-pJNK, PERK, pPERK, eIF2α, peIF2α, PARP, Bax, Bcl2.

Imunohistochimie

Hipotalamii fixați în paraformaldehidă au fost secționați (5,0 µm) și utilizați în colorarea obișnuită cu imunofluorescență unică sau dublă folosind Bax, Bcl2, pBad, pJNK, pPERK, PERK, eIF2α, peIF2α, TLR4, F4/80, AgRP, POMC, NeuN, anticorpii caspază-3 și sinaptofizină, așa cum s-a descris anterior [14], [15]. Analiza și documentarea rezultatelor au fost efectuate cu ajutorul unui microscop Leica FW 4500 B. Hipotalama a fost secționată de la Bregma -1,6 până la -4,2 mm. A fost analizată fiecare secundă din toate secțiunile consecutive. Corelațiile anatomice au fost făcute în funcție de reperele date într-un atlas stereotaxic [13]. Punctele de vedere topografice ale regiunilor care urmează să fie studiate au fost obținute prin colorarea hematoxilin-eozină a secțiunilor consecutive.

Microscopie electronică de transmisie (TEM)

Hipotalamia de la șobolani hrăniți cu diete martor și HF au fost disecate și menținute peste noapte la 4 ° C în fixativ conținând 2,5% glutaraldehidă și 0,5% paraformaldehidă în tampon fosfat (pH 7,4). Probele au fost apoi tăiate, deshidratate și încorporate în Durcupan (Fluka-Sigma-Aldrich, Seelze, Germania). Secțiunile ultra-subțiri din nucleul arcuit au fost colectate pe rețele de cupru acoperite cu formvar, contracolorate cu acetat de uranil și citrat de plumb și examinate la microscopul electronic cu transmisie (Leo906, Zeiss) operat la 60 KV. Micromediul hipotalamusului a fost analizat și neuronii cu morfologie normală și apoptotică au fost identificați și fotografiați utilizând un sistem digital de achiziție de imagini (Morada, Zeiss).

TUNEL

A fost utilizată o analiză terminală de etichetare dUTP nick-mediată de deoxinucleotidil-transferază (TUNEL) pentru a identifica fragmentarea ADN-ului cu dublă catenă. Pe scurt, lamelele de țesut au fost deparafinizate, tratate cu proteinază K (20 μg/ml) timp de 15 minute la temperatura camerei și apoi stinse în peroxid de hidrogen 2,0%. După clătire în soluție salină tamponată cu fosfat (PBS), pH 7,4, probele au fost incubate în 1 × tampon de echilibrare timp de 10-15 s. Lamelele au fost apoi incubate cu deoxinucleotidil transferază terminală (TdT) timp de 1,0 h la 37 ° C, blocate cu tampon de oprire/spălare și incubate cu anticorp peroxidază timp de 30 min la temperatura camerei. Controlul negativ pentru testul TUNEL a fost confirmat prin colorarea țesuturilor în același mod fără anticorp primar. Procentele de neuroni TUNEL-pozitivi au fost determinate în cel puțin 10 câmpuri optice. Analiza a fost efectuată în cinci secțiuni non-consecutive de 5,0 um din fiecare hipotalamus.

analize statistice

Datele din matricea PCR în timp real au fost analizate folosind motorul furnizat de producător. Doar ARNm care suferă o variație de cel puțin 2,0 ori față de martor au fost considerați modulați semnificativ de dietă. Benzile specifice din imunobloti au fost scanate și supuse unei analize cantitative utilizând software-ul Scion Image (Scion Corp., Frederick, MD, SUA). Au fost numărate celulele TUNEL pozitive, celulele apoptotice detectate în TEM cu mărire redusă și terminalele nervoase pozitive ale sinaptofizinei. Toți acești parametri și datele metabolice obținute de la animale au fost analizate prin testul t Student.

Rezultate

Inițial, am evaluat efectul dietei HF asupra inducerii apoptozei în celulele hipotalamice. Șobolanii masculi Wistar au fost hrăniți cu diete martor (4% grăsimi saturate, 15,8 kJ/g) sau HF (36% grăsimi saturate, 24,5 kJ/g) din a 8-a și a 16-a săptămână de viață. Dieta HF a produs o creștere a masei corporale cu 36 ± 7% (69 ± 3 vs. 94 ± 4 g), comparativ cu martorul (p Figura 1. Rezistența la leptină/insulină și markeri inflamatori în hipotalamusul șobolanilor hrăniți cu dieta grasa.

(A) Variația masei corporale (g) a șobolanilor Wistar hrăniți cu diete martor (CT) sau bogate în grăsimi (HF) timp de 8 w. (B - C) Doisprezece ore de consum alimentar spontan (g) de șobolani Wistar hrăniți cu diete CT sau HF timp de 8 w și tratate cu icv cu o singură doză (2,0 µl) de soluție salină (-), leptină (+, în B) sau insulină (+ și C). (D) Imunobloturi (IB) din extracte de proteine ​​hipotalamice obținute de la șobolani Wistar hrăniți cu diete CT sau HF. (E) Analiza PCR în timp real a cantității de transcript F4/80 în probe obținute din hipotalamia șobolanilor Wistar hrăniți cu diete CT sau HF. În toate experimentele n = 5. În A, D și E, * p Figura 2. Testul TUNEL descrie apoptoza în hipotalamusul șobolanilor hrăniți cu dietă bogată în grăsimi.

(A) Microfotografii reprezentative ale detectării fragmentării ADN de către TUNEL (colorate în galben) în probe din nuclee arcuate (Arc) și hipotalamice laterale (LH), de la șobolani Wistar hrăniți cu diete de control (CT) sau cu conținut ridicat de grăsimi (HF); săgețile indică celule pozitive TUNEL. (B - C) Celulele pozitive TUNEL din Arc (B) și LH (C) sunt exprimate ca% din totalul celulelor pe câmp. În toate experimentele n = 5. În A, mărire, × 200 (bară de scară, 20 µm). În B și C, * p Figura 3. Neuronii apoptotici din hipotalamusul șobolanilor hrăniți cu dietă bogată în grăsimi.

(A - F) Imagini cu microscopie electronică de transmisie ale neuronilor apoptotici tipici (A - E) și a unui neuron normal (F) în nucleul arcuit al șobolanilor Wistar hrăniți cu conținut ridicat de grăsimi (A, C - E) și control (B, F ), respectiv, diete. Săgețile indică neuroni tipici apoptotici. (G) Neuronii apoptotici au fost numărați în câmpuri cu mărire redusă a analizei microscopiei electronice de transmisie din nucleul arcuit al șobolanilor Wistar hrăniți cu diete bogate în grăsimi (HF) și de control (CT), rezultatele sunt prezentate ca% din CT. (H) Colorarea reprezentativă a imunofluorescenței sinaptofizinei a probelor din nucleele arcuate (Arc) și hipotalamice laterale (LH), de la șobolani Wistar hrăniți cu diete CT sau HF. (I) Terminalele nervoase sinaptofizin pozitive au fost numărate în câmp și rezultatele sunt prezentate ca% din CT. (J) colorare reprezentativă NeuN (rodamină) și Bax (fluoresceină) cu imunoflorescență dublă a probelor din hipotalamusul șobolanilor Wistar hrăniți cu diete CT și HF; săgețile portocalii descriu neuroni fără expresie Bax, săgețile galbene prezintă neuroni dublați pozitivi NeuN/Bax. A - F sunt reprezentative pentru n = 3; mărire, × 100 (bară de scară, 20 µm), A - B; și × 20.000 (bară de scală, 0,2 µm), C - F. G, numărarea câmpului a fost efectuată în cinci câmpuri distincte de la n = 3; * p Tabelul 2. Genele pro-apoptotice modulate prin dieta HF.

Proteinele din căile apoptotice extra- și intracelulare au fost afectate de dieta HF. Expresia hipotalamică a lui Bax și asocierea APAF1 cu caspaza-9 (Fig. 4A), ambele implicate în mod frecvent în căile de apoptoză intracelulară, și asocierea FADD cu caspaza-8 (Fig. 4A), frecvent implicată în inducerea apoptozei pe calea extracelulară au fost crescute în hipotalamusul șobolanilor HF. Alte dovezi ale activității apoptotice sau dăunătoare în hipotalamus au fost prezentate prin expresia crescută a PARP1 și prin fosforilarea proteinelor implicate în stresul reticulului endoplasmatic, eIF2α și PERK (Fig. 4A).

(A și C) Imunobloturi (IB) de extracte de proteine ​​hipotalamice obținute de la șobolani hrăniți cu control (CT), cu conținut ridicat de grăsimi (HF) (A) sau dieta HF în hrănirea în pereche (PF) (C); în unele cazuri, probele au fost supuse imunoprecipitării (IP) înainte de IB. (B) Variația masei corporale (g) a șobolanilor Wistar hrăniți cu dietă CT sau HF în hrănirea în pereche (PF) timp de 8 w. În toate experimentele, n = 5; * p Figura 5. Diferențele în apoptoza subpopulației neuronale în obezitatea indusă de dietă.

(A) AgRP reprezentativ (rodamină) și Caspase-3 (Casp3, fluoresceină) (panouri superioare) sau POMC (rodamină) și Caspază-3 (Casp3, fluoresceină) (panouri inferioare) colorare imunoflorescentă dublă a probelor din hipotalamusul șobolanilor Wistar hrăniți pe o dietă bogată în grăsimi; săgețile în fuziune prezintă neuroni dublu pozitivi; inserția descrie situl aproximativ în nucleul arcuat care a fost evaluat în detaliu. (B - E) Analiza PCR în timp real a cantităților de transcrieri NPY (B și D) și POMC (C și E) în probe obținute din hipotalamia șobolanilor Wistar (B - C) și a șoarecilor elvețieni (D - E) hrăniți cu control (CT) sau dietele bogate în grăsimi (HF). În toate experimentele n = 5. În A, mărire inserată, × 20 și mărire subtitrare, × 400 (bară de scară, 10 µm), nucleele sunt colorate în albastru de DAPI; Al treilea v, al treilea ventricul. În B - E, * p Figura 6. TLR4 protejează împotriva apoptozei induse de dietă a neuronilor hipotalamici.