Departamentul de fiziologie și biofizică și Centrul de excelență în cercetarea cardiovasculară-renală, Universitatea din Mississippi Medical Center, Jackson.

dieta

Departamentul de fiziologie și biofizică și Centrul de excelență în cercetarea cardiovasculară-renală, Universitatea din Mississippi Medical Center, Jackson.

Departamentul de fiziologie și biofizică și Centrul de excelență în cercetarea cardiovasculară-renală, Universitatea din Mississippi Medical Center, Jackson.

Departamentul de fiziologie și biofizică și Centrul de excelență în cercetarea cardiovasculară-renală, Universitatea din Mississippi Medical Center, Jackson.

Abstract

Deși dieta HS s-a dovedit a fi asociată cu creșteri semnificative ale presiunii arteriale la modelele de animale însărcinate, în special cele cu presiune de perfuzie uterină redusă, 17,18 mecanismele vasculare implicate sunt neclare. Scopul prezentului studiu a fost de a determina (1) dacă reactivitatea vasculară la fenilefrina agonistă α-adrenergică este îmbunătățită la șobolanii însărcinați sau RUPP în timpul unei diete HS; (2) dacă relaxarea vasculară dependentă de endoteliu este redusă la șobolanii gravide și RUPP în timpul unei diete HS; și (3) dacă modificările relaxării vasculare și ale reactivității vasculare asociate cu o dietă HS în timpul sarcinii implică modificări ale căii NO-cGMP dependente de endoteliu. Ultima întrebare a fost un obiectiv al prezentului studiu deoarece NO este un factor major de relaxare derivat din endoteliu și deoarece sarcina normală este asociată cu o creștere semnificativă a producției de NO.

Metode

Animale

Șobolani Sprague-Dawley (12 săptămâni) virgine și însărcinate cu timpul (12 săptămâni) au fost adăpostiți individual și menținuți pe chow standard de șobolan ad libitum și apă de la robinet pe un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore/12 ore. Șobolanii au fost împărțiți în 6 grupuri cu câte 12 șobolani fiecare: dieta virgină cu sare normală (NS), virgină pe dieta HS, gravidă normală/NS, gravidă normală/HS, RUPP/NS și RUPP/HS. Șobolanii NS au fost hrăniți cu o dietă conținând 1% clorură de sodiu. Grupurile HS au fost hrănite cu o dietă conținând 8% clorură de sodiu. Șobolanii au fost ținuți în dietele respective timp de 7 zile. Aportul de apă a fost mai mare la șobolanii HS comparativ cu grupurile NS, reflectat de o creștere de 4 până la 5 ori a volumului de urină.

Toate procedurile au fost efectuate în conformitate cu liniile directoare ale Comitetului de îngrijire și utilizare a animalelor de la Centrul Medical al Universității din Mississippi.

Protocol pentru RUPP

Măsurarea presiunii arteriale medii

Toți șobolanii au fost anesteziați cu izofluran și au fost supuși unei proceduri chirurgicale pentru implantarea unui cateter arterial PE-50 în artera carotidă pentru măsurarea presiunii arteriale medii. Cateterul a fost umplut cu heparină și exteriorizat în partea din spate a gâtului. Șobolanii au fost adăpostiți individual în cuști metabolice și li s-a permis să se recupereze timp de 48 de ore. În ziua experimentului (de obicei ziua 19 de gestație sau echivalentul la șobolani virgini), fiecare șobolan a fost plasat într-un dispozitiv de reținere din plexiglas. Cateterul arterial carotid a fost conectat la un traductor de presiune Statham, iar presiunea arterială la șobolanii conștienți a fost înregistrată pe un poligraf Grass (Model 7D, Astro-Med).

Pregătirea țesuturilor

În ziua experimentului, șobolanii au fost anesteziați prin inhalarea izofluranului. Aorta toracică a fost excizată, plasată în soluție oxigenată de Krebs și curățată de țesut conjunctiv. Aorta a fost tăiată transversal în benzi de 3 mm lățime. Pentru a obține benzi aortice intacte din endoteliu, a fost acordată o atenție extremă pe tot parcursul procedurii pentru a evita rănirea endoteliului. Pentru benzile aortice denudate de endoteliu, endoteliul a fost îndepărtat prin frecare ușoară a vasului cu hârtie de filtru umedă.

Contracția izometrică

Un capăt al benzii aortice a fost atașat la un cârlig de sticlă folosind o buclă de fir, iar celălalt capăt a fost conectat la un traductor de forță Grass (FT03). Fâșiile aortice au fost întinse la Lmax (1,5 × lungimea inițială descărcată, L). Fâșiile au fost lăsate să se echilibreze timp de 1 oră într-o baie de țesut acoperită cu apă, acoperită cu temperatură, umplută cu 50 ml soluție Krebs barbotată continuu cu 95% O2/5% CO2 la 37 ° C. Modificările contracției izometrice au fost înregistrate pe un poligraf Grass (Model 7D).

Au fost efectuate mai întâi două contracții de fenilefrină martor (Phe, 10 -5 mol/L) urmate de clătire cu soluție Krebs 3 × 10 minute. Au fost aplicate concentrații crescânde de Phe și s-au construit curbe de concentrație-contracție. În alte țesuturi, a fost provocată o contracție la concentrația submaximală de Phe (3 × 10 −7 mol/L). S-a adăugat acetilcolină (ACh) sau nitroprusidă de sodiu și s-a măsurat relaxarea vasculară. În alte experimente, țesuturile au fost pretratate timp de 30 de minute cu ester metilic NG-nitro-l-arginină (L-NAME, 10-4 mol/L), pentru a inhiba NO sintaza, sau 1H- [1,2,4] oxadiazolo [4,3] -chinoxalin-1-onă (ODQ, 10-6 mol/L), pentru a inhiba producția de cGMP în mușchiul neted, iar efectele asupra contracției induse de Phe și asupra relaxării induse de ACh a contracției Phe au fost observat.

Producția de nitriți/nitrați

Fâșiile aortice intacte de endoteliu au fost plasate în eprubete conținând 2 ml Krebs aerate cu 95% O2/5% CO2 la 37 ° C și soluția a fost schimbată la fiecare 30 minute timp de 1 oră. Au fost luate mai întâi probe pentru acumularea bazală de nitriți formați din NO eliberat. Soluția Krebs a fost înlocuită și benzile de țesut au fost stimulate cu ACh timp de 5 minute. Fâșiile au fost îndepărtate rapid, uscate cu hârtie de șervețel și cântărite. Soluțiile de incubație au fost testate pentru produsul final stabil de NO, NO2 -. Pe scurt, probele de soluție de incubație (50 μL, în triplicat) au fost amestecate într-o placă de microtitrare cu 96 de godeuri cu 100 μL de reactiv Griess. Cromoforul generat de reacția cu nitrit a fost detectat spectrofotometric (550 nm) folosind un cititor de plăci de microtitrare (BioTek). Concentrația de nitriți a fost calculată utilizând o curbă de calibrare cu concentrații cunoscute de NaNO2. 20

Soluții și produse chimice

Krebs normal conținea următoarele (în mmol/L): NaCI 120, KCI 5,9, NaHCO3 25, NaH2PO4 1,2, dextroză 11,5, MgCl2 1,2 și CaCl2 2,5 la pH până la 7,4. L-fenilefrina, acetilcolina, nitroprusida de sodiu și L-NAME (Sigma) au fost preparate în apă distilată. ODQ (Calbiochem) a fost dizolvat în dimetil sulfoxid (concentrație finală, 2) folosind ecuația: stres = [forță/zona secțiunii transversale], unde aria secțiunii transversale = [greutate umedă/(densitatea țesutului × lungimea benzii)] și țesutul densitate = 1.055 g/cm 3. Datele au fost analizate și exprimate ca medie ± SEM. Datele au fost comparate utilizând ANOVA cu criterii de clasificare multiple (tip șobolan [NS versus HS, gravidă normală versus RUPP], starea endoteliului [intact versus denudat] și tratament (netratat versus pretratat cu L-NAME sau ODQ)) urmat de postarea lui Bonferroni test pentru a compara grupurile selectate sau testul post Dunnet pentru a compara toate grupurile cu grupul gravidă/NS. Diferențele au fost considerate semnificative statistic dacă P −4 mol/L) timp de 30 de minute pentru a inhiba NO sintaza ameliorează semnificativ stresul indus de Phe la șobolanii virgin/NS și virgin/HS (Figura 2A). L-NAME a sporit stresul indus de Phe la șobolani gravide/NS, dar nu și la șobolani gravide/HS (Figura 2B). În schimb, L-NAME nu a îmbunătățit contracția indusă de Phe la șobolanii RUPP/NS sau RUPP/HS (Figura 2C).

Figura 2. Efectul L-NAME și ODQ asupra contracției induse de Phe în benzi aortice intacte de endoteliu de șobolani virgine (A), gravide normale (B) și RUPP (C) pe dietele NS și HS. Fâșiile aortice au fost netratate sau pretratate cu L-NAME (10-4 mol/L) sau ODQ (10-6 mol/L) timp de 30 de minute apoi stimulate cu Phe. Punctele de date reprezintă media ± SEM a măsurătorilor în 12 până la 18 benzi aortice de la 6 șobolani din fiecare grup.

figura 1. Contracția indusă de fe la șobolani virgini, însărcinați normali și RUPP din dietele NS și HS. Fâșiile aortice endoteliale intacte (+ Endo) și endoteliul denudate (-Endo) au fost stimulate cu concentrații crescute de Phe. Contracția Phe a fost măsurată și prezentată ca stres activ (A, B și C) sau ca procent din contracția Phe maximă (D, E și F). Punctele de date reprezintă media ± SEM a măsurătorilor în 12 până la 24 de benzi aortice de la 6 la 8 șobolani din fiecare grup.

În mod similar, în benzi intacte de endoteliu, pretratarea cu ODQ (10-6 mol/L) timp de 30 de minute pentru a inhiba producția de cGMP în mușchiul neted 21 a îmbunătățit semnificativ stresul indus de Phe la șobolanii virgin/NS și virgin/HS (Figura 2A) . ODQ a îmbunătățit stresul indus de Phe la șobolani gravide/NS, dar nu și la șobolani gravide/HS (Figura 2B), RUPP/NS sau RUPP/HS (Figura 2C).

În fâșiile aortice intacte de endoteliu de șobolan virgin, gravid normal și RUPP, ACh a determinat relaxarea dependentă de concentrație a contracției Phe (3 × 10 −7 mol/L) (Figura 3A). Relaxarea indusă de ACh a fost semnificativ mai mare la șobolanii însărcinați normali decât la șobolanii RUPP. Deoarece benzile aortice ale șobolanilor RUPP au prezentat o reactivitate vasculară mai mare decât șobolanii gravide normali, s-au efectuat experimente de control pe benzi de șobolani RUPP: concentrația inițială de Phe a fost redusă la 10-7 mol/L pentru a produce o contracție submaximală care este aproximativ egală în magnitudine la contracția observată în fâșiile de șobolani gravide precontractate cu 3 × 10 −7 mol/L Phe. ED50 de ACh în benzi aortice de șobolani RUPP precontractați cu 10-7 mol/L Phe (1,1 ± 0,1 × 10-6 mol/L) nu a fost semnificativ diferit de cel din benzi precontractate cu 3 × 10-7 mol/L Phe (1,2 ± 0,1 × 10 −6 mol/L).

Figura 3. Relaxarea indusă de ACh a contracției Phe (3 × 10 −7 mol/L) (A) și a producției bazale și induse de ACh de nitriți/nitrați (B) în benzi aortice intacte de endoteliu de șobolani virgini, gravide normale și șobolani RUPP pe Dietele NS și HS. Punctele de date reprezintă media ± SEM a măsurătorilor în 12 până la 20 de benzi aortice de la 6 la 10 șobolani din fiecare grup.

Relaxarea ACh nu a fost semnificativ diferită între șobolanii virgin/HS și virgin/NS, dar a fost semnificativ redusă la șobolanii gravide/HS comparativ cu șobolanii gravizi/NS și la șobolanii RUPP/HS comparativ cu șobolanii RUPP/NS. Pre-tratarea benzilor intacte de endoteliu cu L-NAME (10 −4 mol/L) sau ODQ (10 −6 mol/L) a inhibat semnificativ relaxarea indusă de ACh a contracției Phe la șobolanii virgin/NS și virgin/HS. L-NAME și ODQ au inhibat relaxarea ACh în mod semnificativ la șobolanii gravide/NS, dar doar ușor la șobolanii gravide/HS. L-NAME și ODQ nu au afectat semnificativ relaxarea ACh la șobolanii RUPP/NS sau RUPP/HS. Îndepărtarea endoteliului a inhibat complet relaxarea indusă de ACh a contracției Phe la șobolani virgini, însărcinați normali și RUPP pe o dietă NS sau HS (datele nu sunt prezentate).

În benzile intact de endoteliu, producția bazală de nitriți/nitrați a fost semnificativ mai mare la șobolanii virgin/HS decât la șobolanii virgin/NS, dar producția de nitriți/nitrați indusă de ACh nu a fost semnificativ diferită (Figura 3B). Nitritul/nitratul bazal și indus de ACH au arătat o reducere semnificativă a șobolanilor gravide/HS comparativ cu șobolanii gravide/NS, dar nu la șobolanii RUPP/HS comparativ cu șobolanii RUPP/NS (Figura 3B).

În benzile aortice denotate de endoteliu nitroprusidă de sodiu, un donator exogen de NO și un activator standard de guanilat ciclază, 22 au determinat relaxarea dependentă de concentrație a contracției Phe (Figura 4). Relaxarea indusă de nitroprusidă de sodiu a contracției Phe nu a fost semnificativ diferită între șobolanii virgin/HS și virgin/NS (Figura 4A) sau între șobolanii gravide/HS și gravide/NS (Figura 4B), dar a fost redusă semnificativ la șobolanii RUPP/HS comparativ cu Șobolani RUPP/NS (Figura 4C).

Figura 4. Efectul nitroprusidului de sodiu (SNP) asupra contracției Phe la șobolani virgine (A), gravide normale (B) și RUPP (C) de șobolani endoteliali denotați de endoteliu pe dietele NS și HS. A fost provocată contracția Phe (3 × 10-7 mol/L); s-au adăugat concentrații în creștere de SNP; iar procentul de relaxare a contracției Phe a fost măsurat. Punctele de date reprezintă media ± SEM a măsurătorilor în 12 până la 18 benzi aortice de la 6 șobolani din fiecare grup.

Discuţie

Principalele constatări ale acestui studiu sunt că (1) presiunea arterială este semnificativ mai mare la șobolanii însărcinați și la șobolanii RUPP care urmează o dietă HS decât cei care urmează o dietă NS; (2) reactivitatea vasculară este mai mare la șobolanii însărcinați și RUPP pe o dietă HS comparativ cu cei pe o dietă NS; (3) relaxarea vasculară dependentă de endoteliu este redusă la șobolanii gravide/HS comparativ cu șobolanii gravide/NS și redusă în continuare la șobolanii RUPP/HS comparativ cu șobolanii RUPP/NS.

Am constatat că o dietă HS la șobolanii virgini Sprague-Dawley a cauzat modificări minime ale presiunii arteriale. Acest lucru este în concordanță cu rapoartele conform cărora hrănirea șobolanilor Dahl rezistenți la sare o dietă HS este asociată cu o creștere modestă a tensiunii arteriale. 23 Presiunea arterială a fost semnificativ mai mare la șobolanii RUPP decât la șobolanii însărcinați normali, ceea ce este în concordanță cu rapoartele anterioare conform cărora presiunea arterială este crescută la modelele animale de hipertensiune în timpul sarcinii târzii. 3,6,13-16,24,25 Observațiile că reactivitatea vasculară la Phe a fost mai mare la șobolanii RUPP decât la șobolanii însărcinați normali, că îndepărtarea endoteliului a îmbunătățit contracția Phe la șobolanii însărcinați normali, dar nu la șobolanii RUPP și Relaxarea indusă de ACh a fost redusă la șobolanii RUPP comparativ cu șobolanii însărcinați normali sunt în concordanță cu constatările noastre anterioare și sugerează că o cale de relaxare dependentă de endoteliu este intactă la șobolanii gravizi normali, dar este afectată la șobolanii RUPP. 15.16

Presiunea arterială a crescut semnificativ la șobolanii gravide/HS comparativ cu șobolanii gravide/NS și la șobolanii RUPP/HS comparativ cu șobolanii RUPP/NS. Acest lucru este în concordanță cu rapoartele conform cărora o dietă HS este asociată cu creșteri semnificative ale presiunii arteriale la iepurii gravidați normali 17 și la oile însărcinate cu RUPP. 18 În căutarea posibilelor mecanisme vasculare implicate în presiunea arterială crescută observată la șobolanii gravide și RUPP, pe o dietă HS, am constatat că reactivitatea vasculară la Phe este îmbunătățită la șobolanii gravide/HS și RUPP/HS comparativ cu gravidele/NS și Șobolani RUPP/NS, respectiv. Îndepărtarea endoteliului a îmbunătățit contracția Phe în mod semnificativ la șobolanii gravide/NS, dar nu la șobolanii gravide/HS și a avut un efect minim la șobolanii RUPP/NS și RUPP/HS. De asemenea, relaxarea indusă de ACh a fost redusă semnificativ la șobolanii gravide/HS în comparație cu șobolanii gravide/NS și la șobolanii RUPP/HS comparativ cu șobolanii RUPP/NS. Aceste date sugerează că o cale de relaxare dependentă de endoteliu este afectată la șobolanii însărcinați care urmează o dietă HS și este afectată în continuare la șobolanii RUPP care urmează o dietă HS.

Endoteliul vascular eliberează mai multe substanțe vasodilatatoare, inclusiv NO. 26-28 Relaxarea redusă indusă de ACh la șobolanii gravide/HS și RUPP/HS ar putea fi cauzată de o scădere a sintezei/eliberării de NO din celulele endoteliale sau de o scădere a sensibilității mușchiului neted vascular la relaxare cu NO. Am constatat că pretratarea benzilor vasculare cu L-NAME, care blochează sinteza NO, a inhibat relaxarea indusă de ACh și a îmbunătățit semnificativ reactivitatea vasculară la Phe la șobolani gravide/NS, dar nu la șobolani gravizi/HS și a avut efecte minime la șobolani RUPP pe o dietă NS sau HS. Aceste rezultate sugerează că sinteza NO de către celulele endoteliale este intactă la șobolanii gravide/NS, dar este afectată de o dietă HS la șobolanii însărcinați normali și RUPP. Acest lucru este susținut de observația că producția bazală și indusă de ACh indusă de nitriți/nitrați a fost redusă la șobolanii gravide/HS comparativ cu șobolanii gravizi/NS. Sinteza/eliberarea NO părea a fi inhibată maxim la șobolanii RUPP/NS, deoarece nu a fost observată nicio scădere suplimentară a producției de nitriți/nitrați la șobolanii RUPP/HS comparativ cu șobolanii RUPP/NS.

NO produs de celulele endoteliale promovează relaxarea vasculară prin activarea guanilat ciclazei și creșterea cGMP în mușchiul neted vascular. 28 Am constatat că ODQ, care inhibă guanilat ciclaza și scade cGMP în mușchiul neted, 21 a inhibat relaxarea indusă de ACh și a îmbunătățit semnificativ reactivitatea vasculară la Phe în benzi intacte de endoteliu de șobolani gravizi/NS, dar nu și la șobolani gravizi/HS și au avut efecte minime la șobolanii RUPP asupra unei diete NS sau HS. Aceste rezultate susțin în continuare că producția/eliberarea de NO de către celulele endoteliale și, prin urmare, activitatea căii de relaxare NO-cGMP în mușchiul neted vascular, este redusă la șobolanii gravide/HS comparativ cu șobolanii gravizi/NS. Calea NO-cGMP pare a fi inhibată maxim la șobolanii RUPP/NS, deoarece ODQ nu a provocat o reducere suplimentară a relaxării ACh sau îmbunătățirea contracției Phe la șobolanii RUPP/HS comparativ cu șobolanii RUPP/NS.

Se pune întrebarea despre modul în care relaxarea indusă de ACh a fost inhibată în continuare la șobolanii RUPP/HS comparativ cu șobolanii RUPP/NS în absența unei diferențe semnificative în producția de nitriți/nitrați. Acest lucru poate fi legat de sensibilitatea mușchiului neted vascular la relaxare prin NO. Observația că relaxarea benzilor vasculare denotate de endoteliu de către nitroprusidă de sodiu nu a fost semnificativ diferită între șobolanii gravide/HS și gravide/NS, dar a fost semnificativ redusă la șobolanii RUPP/HS comparativ cu șobolanii RUPP/NS sugerează că sensibilitatea mușchiului neted vascular la relaxarea cu NO este afectată la șobolanii RUPP pe o dietă HS. Cauza relaxării vasculare scăzute de NO la șobolanii RUPP pe o dietă HS nu este clară în prezent, dar ar putea fi legată de anomalii ale cantității sau activității guanilat ciclazei sau a sistemului kinazei dependente de cGMP (protein kinază G) sau la modificările structurale din peretele arterial și ar trebui să reprezinte domenii importante pentru investigații viitoare.

În concluzie, o dietă HS la șobolani însărcinați și RUPP normali este asociată cu creșteri ale reactivității vasculare. Reactivitatea vasculară îmbunătățită cu o dietă HS poate fi legată de anomalii în producția/eliberarea de NO din endoteliu la șobolanii însărcinați normali; și o scădere suplimentară a sensibilității mușchiului neted, la relaxare cu NO la șobolanii gravide cu presiune de perfuzie uterină redusă.

Această lucrare a fost susținută de subvenții de la American Heart Association (Grant-in-Aid, Southeast Affiliate) și Institutul Național de Inimă, Plămân și Sânge (HL-33849, HL-51971 și HL-52696).