Toate procedurile care implică subiecți de animale au fost efectuate în conformitate cu reglementările instituționale CINVESTAV-IPN ghidate pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator. Aprobarea protocolului a fost obținută de la Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor (numărul de protocol 0081-14). Pentru efectuarea studiului, au fost angajați 25 de șobolani femele de 5 luni Wistar la începutul experimentului. Șobolanii au fost obținuți de la Fondul Instituțional pentru Animale (IAF) și distribuiți în 3 grupuri. Animalele au fost ținute în condiții de lumină, aer și umiditate controlate și au primit hrană și apă ad libitum. Șobolanii au fost repartizați aleatoriu în grupurile experimentale după cum urmează: dieta de control (n = 8), dieta cu acizi grași (n = 8), dieta bogată în colesterol (n = 9). Animalele au fost hrănite cu 10 săptămâni cu diferite diete, care componente sunt descrise în Tabelul 1. Greutatea corporală a fost înregistrată săptămânal. Au fost respectate toate reglementările instituționale și internaționale pentru a evita suferința animalelor și pentru a reduce numărul animalelor angajate în studiu.

grăsimi

2.2. Profil de probe de sânge și lipide

În săptămâna 0, toate animalele au fost duse în camera experimentală și au fost anesteziate cu 5% izofluran pentru inducție și 3% pentru întreținere într-o cameră de anestezie (Vetequip Impac6). Odată ce animalele s-au simțit sub efectul anesteziei, labele joase au fost ras și sângele a fost colectat cu o canulă din vena femurală. Probele de sânge au fost păstrate în tubul Eppendorf cu heparină și depozitate la temperatura camerei. După această procedură, animalele au fost returnate în cuștile de acasă, probele de sânge au fost centrifugate și plasma a fost colectată pentru analize ulterioare. Parametrii studiați au fost: colesterol total, trigliceride, lipide cu densitate ridicată (HDL) și lipide cu densitate mică (LDL). Probele au fost trimise la un laborator veterinar clinic pentru analiză. Animalele au postit 24 de ore înainte de recoltarea probelor de sânge pentru a evita efectele imediate ale dietei.

Tabelul 1. Compoziția nutrițională a peletelor.

2.3. Injecții BrdU

Până în a șasea săptămână de tratament, animalele au primit o doză unică de 5-Bromo-2'Deoxiuridină (BrdU) (50 mg/Kg greutate corporală, B5002_SIGMA) pentru a eticheta celulele proliferante în girusul dentat hipocampic.

2.4. Elevated Plus Labirint

Pentru a analiza posibile modulații emoționale induse de dietă, șobolanii au fost testați cu testul de labirint crescut plus (EPM), până la a 3-a săptămână după injecția cu BrdU. Acesta este un test de anxietate utilizat pe scară largă, care explorează comportamente determinate filogenetic. Acesta profită de aversiunea naturală a șobolanilor în spații deschise/înalte și testează modul în care animalele pot face față unui nivel de stres [20]. Testul a fost efectuat după cum sa raportat în Leal-Galicia și colab., [15]. Aparatul este o suprafață ridicată cu formă de cruce unde două brațe sunt închise de pereți și două sunt deschise. Animalul este plasat în centrul crucii cu fața spre brațul închis și este lăsat acolo pentru a explora liber 300 de secunde. Animalele cu anxietate scăzută vor petrece mai mult timp în brațe deschise. Au fost măsurate numărul de treceri între brațele deschise și cele închise, precum și timpul petrecut explorând brațele deschise.

2.5. Memorie de recunoaștere a obiectelor noi

2.6. Pregătirea țesuturilor

2.7. Analiza destinului celular

Pentru a cuantifica numărul de celule pozitive BrdU și DCX în zona sub-granulară și în stratul celular granular al girusului dentat, celulele fluorescente de-a lungul întregii întinderi rostro-caudale ale hipocampului au fost numărate folosind un microscop confocal convențional. Metoda disectorului optic a fost utilizată conform descrierii anterioare în Kempermann și colab., [23]. Pe scurt, una din fiecare 6 secțiuni a fost colectată pentru a fi procesată prin imunohistochimie plutitoare liberă împotriva BrdU și DCX. După efectuarea imunocolorării (așa cum a fost descris anterior), secțiunile au fost montate în lamele de acoperire și fiecare celulă colorată pentru BrdU sau DCX a fost numărată exhaustiv în fiecare secțiune. Numărul total de celule BrdU pozitive pe animal a fost obținut după multiplicarea cu 50 a numărului de celule pozitive numărate.

2.8. Analize statistice

Analizele statistice au fost efectuate cu GraphPad Prism 6. Datorită faptului că datele comportamentale nu au o distribuție normală, datele au fost analizate cu testul Kruskal-Wallis urmat de testul multiplu de comparație al lui Dunn, datele referitoare la măsurătorile fiziologice au fost analizate cu analize factoriale de varianță (ANOVA ) urmat de testul post hoc Bonferroni, după caz. Semnificația statistică este evidențiată cu un simbol atunci când p ≤ 0,05; 2 simboluri când p ≤ 0,01; 3 simboluri când p ≤ 0,001; 4 simboluri când p ≤ 0,0001. * se referă în comparație cu controlul și se referă în comparație cu grupul FAD. Toate valorile sunt date ca medii ± SEM, cu n = 8 până la 9 animale în fiecare stare. Pentru relația dintre greutatea corporală și indicele de explorare, greutatea câștigată pe animal în comparație cu scorul său în indicele de explorare a fost grafică.

3.1. FAD induce o creștere a greutății corporale

FAD induce o creștere a greutății corporale la șobolanii femele începând cu săptămâna 4 de tratament, în comparație cu animalele martor și CED și astfel de diferențe sunt menținute până la sfârșitul tratamentului (F (10, 88) = 4.217, p ≤ 0.0001) (˚ C ). În plus, induce o creștere a greutății epidermice a grăsimii în comparație cu controlul și tratamentul CED (F (2, 22) = 3,576, p = 0,0452) (Figura 1 (b)).

3.2. FAD și CED induc modificări în prelucrarea lipidelor

Animalele hrănite cu CED arată o creștere semnificativă menținută a nivelului colesterolului total din plasmă, care a fost foarte mare la sfârșitul tratamentului (F (2, 20) = 35,76, p ≤ 0,0001 semnificația grupului considerată ca #) (Figura 2 (a) considerat ca #). Acest tip de dietă induce, de asemenea, o creștere semnificativă a nivelurilor de LDL și trigliceride (F (2, 23) = 11,31, p = 0,0004 semnificația grupului considerată ca #) și (F (2, 20) = 35,76, p ≤ 0,0001) (Figura 2 (d) și Figura 2 (b) semnificația grupului considerată ca #), respectiv. Grupul hrănit cu FAD prezintă o creștere foarte semnificativă a nivelului colesterolului total din plasmă până în a treia săptămână de tratament. Cu toate acestea, la sfârșitul experimentului, nivelurile de colesterol au fost similare cu cele observate în grupul martor (F (2, 20) = 35,76, p ≤ 0,0001 semnificația grupului considerată ca &). În plus, această dietă induce, de asemenea, o creștere a nivelurilor LDL până în a treia săptămână (F (2, 21) = 4,1777, p = 0,0297 semnificația grupului semnalată ca &), dar nu induce modificări semnificative ale nivelurilor de trigliceride din sânge. S-a observat în grupul de control o creștere menținută a nivelului total de colesterol și LDL, dar aceasta este mai mică decât cele observate în grupul CED (F (2, 21) = 9.730, p ≤ 0,0010 semnificația grupului considerată ca *).

3.3. Dieta cu colesterol induce comportamente asemănătoare anxietății și FAD și CED induc un deficit de memorie pe termen scurt

EPM este un test utilizat pe scară largă pentru a evalua capacitatea rozătoarelor de a face față unui factor de stres mai scăzut și de a profita de comportamentul natural de explorare al șobolanilor.,