Manish Kumar

1 Departamentul de Biologie și Inginerie Biologică, Universitatea de Tehnologie Chalmers, SE41128 Gothenburg, Suedia

Boyang Ji

1 Departamentul de Biologie și Inginerie Biologică, Universitatea de Tehnologie Chalmers, SE41128 Gothenburg, Suedia

Paris Babaei

1 Departamentul de Biologie și Inginerie Biologică, Universitatea de Tehnologie Chalmers, SE41128 Gothenburg, Suedia

Promi Das

1 Departamentul de Biologie și Inginerie Biologică, Universitatea de Tehnologie Chalmers, SE41128 Gothenburg, Suedia

Dimitra Lappa

1 Departamentul de Biologie și Inginerie Biologică, Universitatea de Tehnologie Chalmers, SE41128 Gothenburg, Suedia

Girija Ramakrishnan

5 Departamentul de Medicină/Divizia de Boli Infecțioase, Universitatea din Virginia, Charlottesville, VA, SUA

Todd E. Fox

6 Departamentul de farmacologie, Universitatea din Virginia, Charlottesville, VA, SUA

Rashidul Haque

7 Centrul internațional de cercetare a bolilor diareice, Dhaka, Bangladesh

William A. Petri, Jr.

5 Departamentul de Medicină/Divizia de Boli Infecțioase, Universitatea din Virginia, Charlottesville, VA, SUA

Fredrik Bäckhed

3 Laboratorul Wallenberg, Departamentul de Medicină Moleculară și Clinică, Universitatea din Gothenburg, 41345, Gothenburg, Suedia

4 Centrul Fundației Novo Nordisk pentru Cercetări Metabolice de Bază, Secția pentru Receptologie Metabolică și Enteroendocrinologie, Facultatea de Științe ale Sănătății, Universitatea din Copenhaga, 2200 Copenhaga, Danemarca

Jens Nielsen

1 Departamentul de Biologie și Inginerie Biologică, Universitatea de Tehnologie Chalmers, SE41128 Gothenburg, Suedia

2 New Nordisk Foundation Center for Biosustainability, Universitatea Tehnică din Danemarca, DK2800 Lyngby, Danemarca

M.K., B.J. și J.N. a conceput și proiectat studiul, cadrul de calcul și analizele. M.K., B.J. și P.B. a implementat cadrul și a efectuat analize. D.L. a dezvoltat o conductă pentru îmbunătățirea adnotărilor modelului. P.D., F.B. și J.N. a conceput și proiectat experimentele de fermentare. P.D. a efectuat experimentele. R.H., W.A.P.J. și J.N. a conceput și conceput studiul metabolomicii. G.R. și T.F. a efectuat experimentele de metabolomică. M.K. a analizat datele metabolomice. M.K., P.B. și J.N. a scris manuscrisul.

Date asociate

Abstract

INTRODUCERE

Malnutriția este o boală severă netransmisibilă în țările cu venituri mici și medii, care include două forme, și anume subnutriția (stunting and wasting) și overnutrition (obezitatea). Potrivit unui raport recent al Organizației Mondiale a Sănătății (OMS), cascadarea și risipa au afectat 160 de milioane și, respectiv, 50 de milioane de copii, în întreaga lume (Chan, 2017). Singurul creșterea copilului a afectat 22,6% dintre copiii cu vârsta sub 5 ani la nivel global în 2016 (UNICEF și colab., 2017). OMS recomandă alăptarea până la vârsta de 6 luni pentru o creștere sănătoasă a sugarilor. Mai mult, în cazul malnutriției, se recomandă untul de arahide și alimentele terapeutice gata de utilizare pe bază de lapte uscat degresat (RUTF) (Briend et al., 2015). Deși s-au înregistrat progrese semnificative în ultimele decenii în reducerea prevalenței cascadării, intervențiile aplicate pentru tratarea cascadării copiilor nu au avut întotdeauna succes (Bhutta și colab., 2008; Ramakrishnan și colab., 2009). Recent, au fost efectuate mai multe studii pentru a înțelege efectul intervenției nutriționale, cum ar fi suplimentele nutritive pe bază de lipide sau RUTF, micronutrienți, cum ar fi vitamina A, zinc, fier, individual sau în combinații multiple, asupra copiilor care suferă de creștere (Ashorn et al., 2015a; Mayo-Wilson și colab., 2014; Ramakrishnan și colab., 2009). Rezultatele acestor studii au sugerat că intervențiile nu au reușit să inverseze deficitul de creștere liniar al stuntingului.

În afară de nutrienții din dietă, sa constatat că microbiota intestinală a omului este asociată cu malnutriția (Blanton și colab., 2016; Smith și colab., 2013; Subramanian și colab., 2014). Intestinul uman adăpostește miliarde de celule microbiene, care acționează în mod colectiv ca un bioreactor pentru fermentarea macronutrienților dietetici către metaboliți care promovează sănătatea, de exemplu, acizii grași cu lanț scurt (SCFA) (De Vadder și colab., 2014; Louis și Flint, 2017), aminoacizi (AA) (Husted și colab., 2017; Metges, 2000; Shoaie și colab., 2015) și vitamine (Degnan și colab., 2014; Gominak, 2016; Östman și colab., 2001). Mai mult, studiile anterioare au demonstrat interacțiunea microbiotei intestinale cu metabolismul acidului biliar, care poate avea un impact semnificativ asupra metabolismului gazdei (Wahlström și colab., 2016).

MATERIALE ȘI METODE

Analiza datelor despre abundența relativă microbiană intestinală

Datele relative privind abundența taxonomică relativă a bacteriilor intestinale au fost obținute din trei studii publicate bazate pe grupuri de copii din trei țări diferite (Malawi, Bangladesh și Suedia) (Bäckhed și colab., 2015; Smith și colab., 2013; Subramanian și colab., 2014 ). S-au folosit doar abundențe relative la nivel de specie pentru a selecta cele mai abundente 20 de specii bacteriene din microbiota intestinală a copiilor sănătoși și subnutriți pentru a reconstitui GEM-urile. Această presupunere a fost făcută pentru a simplifica cadrul de modelare pentru a înțelege capacitățile metabolice ale celei mai dominante părți a microbiomului intestinal al copilului în sănătate și malnutriție. Au fost selectate în total 68 de specii. Abundențele taxonomice relative ale speciilor selectate pot fi văzute în Tabelul S1 și Figura S2.

Raportul Firmicutes/Bacteroidetes a fost calculat pentru copiii sănătoși și subnutriți utilizând date privind abundența taxonomică relativă din patru studii publicate (Bäckhed și colab., 2015; Blanton și colab., 2016; Smith și colab., 2013; Subramanian și colab., 2014). Dintre cele patru seturi de date, două erau de la copii din Malawi (Blanton și colab., 2016; Smith și colab., 2013), iar restul de doi erau din Bangladesh (Subramanian și colab., 2014) și copii suedezi (Bäckhed și colab., 2015) . Datele relative privind abundența taxonomică a copiilor suedezi au fost disponibile numai pentru copiii sănătoși. Alte seturi de date despre abundența speciilor au fost utilizate pentru a determina indicele diversității Shannon sau indicele Shannon-Wiener al microbiotei intestinale pentru fiecare grup de copii. Indicele Shannon-Wiener este definit după cum urmează (Hurlbert, 1971):

Unde, Pi este abundența relativă a speciilor i. S este numărul de specii din comunitatea microbiană. funcția de diversitate a pachetului vegan a fost implementată pentru a obține acest indice în versiunea R 3.3.0.

Reconstrucții ale modelelor metabolice la scară genomică

Datorită secvențierii parțiale și adnotării sau lipsei disponibilității în bazele de date publice a genomului a zece specii, proiectele GEM au fost reconstruite pentru 58 de specii (Tabelul S2). Aceste modele sunt reprezentate de o matrice stoichiometrică (S), care încorporează informații despre conversia metabolică și echilibrarea masei reacțiilor biochimice (enzimatice și de transport) în rețeaua metabolică a organismului și creșterea este determinată de reacția de biomasă, care este legată de alte reacții biochimice din reţea. Genomurile adnotate pe baza adnotării rapide utilizând tehnologia subsistemului (RAST) sever (Aziz și colab., 2008) au fost utilizate pentru reconstituirea proiectului GEM-urilor pe platforma KBase (Departamentul SUA de baze de cunoștințe despre biologia sistemelor energetice, https://kbase.us/) . Platforma KBase folosește conducta modelSEED (Henry și colab., 2010) pentru generarea GEM-urilor.

Pentru a umple golurile din GEM-uri, am folosit conducta KBase/modelSEED pentru a adăuga automat un set minim de reacții la proiectul de rețele pentru a produce biomasă (Henry și colab., 2010). Actualizarea conductei KBase/modelSEED folosește o metodă publicată anterior pentru umplerea golurilor (Latendresse, 2014). GEM-urile, care conțineau cel puțin 75% reacții pe baza adnotărilor genetice disponibile, au fost luate în considerare pentru analize ulterioare, pentru a diminua influența posibilă a reacțiilor automate cu lacune. Pentru detalii despre pașii urmați în curățarea GEM-urilor, consultați Textul suplimentar. Toate cele 58 de GEM-uri sunt disponibile pe GitHub (https://github.com/SysBioChalmers/ChildrenGutMicrobialGEMs). În pasul următor, am comparat GEM-urile pentru a determina diferențele metabolice între ele. Disimilitatea modelelor a fost examinată în termeni de distanțe metabolice între modele pe baza listei lor de reacții. Distanța metabolică a fost calculată utilizând coeficientul Jaccard, ca distanță metabolică = 1 - Coeficientul Jaccard (Levandowsky, 1971) (Figura 2B și Tabelul S4). Dacă A este setul de reacții ale modelului a și B este setul de reacții ale modelului b, atunci distanța metabolică dintre a și b este definită ca 1 - | A∩B |/| АЮБ |.

intestinale

(A) Proporția reacțiilor asociate cu adnotări genetice (bara violetă) și adăugate în timpul umplerii golului (bara roz). (B) Numărul de metaboliți și reacții în GEM ale bacteriilor intestinale și distanțele metabolice dintre modele bazate pe reacții comune și unice, care a fost calculat utilizând coeficientul Jaccard (Procedura experimentală). Modelele care reprezintă același filum au mai multe reacții decât modelele din specii taxonomice distincte. funcția heatmap.2 a pachetului gplots și funcțiile dist și hclust ale lui R au fost utilizate pentru generarea heatmap și, respectiv, dendrogramă, în versiunea R 3.3.0. (C) Validarea GEM-urilor. Predicțiile privind rata de creștere a GEM-urilor a șase specii bacteriene intestinale au fost validate cu observații experimentale pe mediu YCFA cu rate diferite de absorbție a glucozei (mmol gDW-1 h-1) în condiții de creștere anaerobă (Tabelul 1). Speciile implicate în această analiză au fost Bacteroides thetaiotaomicron (M6), Bifidobacterium adolescentis (M9), Eubacterium rectale (M29), Faecalibacterium prausnitzii (M31), Prevotella copri (M41) și Roseburia inulinivorans (M43).

Simulează model

Reconstrucția modelelor metabolice comunitare pentru microbii intestinali

Modelele metabolice comunitare (CMM) au fost reconstituite folosind GEM-uri cu o singură specie, urmând o metodă publicată anterior pentru generarea de modele de saci mixți pentru comunitățile microbiene (Henry și colab., 2016). În acest scop, au fost selectate cinci comunități microbiene intestinale bazate pe cinci grupuri diferite de copii, și anume copii din Malawi (sănătoși), copii din Bangladesh (sănătoși), copii din Suedia (sănătoși), copii din Malawi (subnutriți) și copii din Bangladesh (subnutriți) au fost selectați S5).

Interacțiuni perechi între specii

Simulările în perechi au fost efectuate prin formularea unei programări liniare în care metaboliții media au fost setați ca fiind singurele resurse disponibile pentru modele. Dacă ambele modele ar solicita un metabolit, o constrângere ar presupune că suma consumului de flux asociat ar fi mai mică sau egală cu cantitatea disponibilă în mass-media. Orice metaboliți produși de membrii comunității care au fost folosiți de celălalt membru au fost sub o constrângere care implică faptul că fluxul consumat este mai mic sau egal cu fluxul produs. Funcția obiectivă pentru simularea creșterii în perechi și producția potențială a metabolitului au fost suma reacțiilor de biomasă și suma reacțiilor de schimb care produc metabolitul de interes, respectiv. Pentru identificarea tipului de efect asupra creșterii, rata de creștere în simulări perechi a fost scăzută din rata de creștere în optimizarea unei singure specii și în funcție de modificarea ratelor de creștere, tipul de efect a fost clasificat.

Validarea modelelor

GEM-urile Bacteroides thetaiotaomicron (M6), Bifidobacterium adolescentis (M9), Eubacterium rectale (M29), Faecalibacterium prausnitzii (M31), Prevotella copri (M41) și Roseburia inulinivorans (M43) au fost utilizate pentru a prezice ratele de creștere și au fost date experimentale valide pe mono-culturi. În configurația experimentală, Bifidobacterium adolescentis L2-32, Eubacterium rectale A1-86 (DSM 17629), Faecalibacterium prausnitzii A2-165 (DSM 17677) și Roseburia inulinivorans A2–194 (DSM 16841) au fost furnizate de Dr. Karen Scott, Institutul Rowett de Nutriție și Sănătate, Aberdeen. Bacteroides thetaiotaomicron ATCC 29148 și Prevotella copri DSM 18205 au fost obținute din colecția American Type Culture Collection (ATCC) și, respectiv, din Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ). Inițial, toate tulpinile de mai sus au fost izolate de habitatul lor fecal uman. B. adolescentis, B. thetaiotaomicron, E. rectale, F. prausnitzii și R. inulinivorans au fost menținute în tubul Hungate (Ochs Laborbedarf, Germania) în mediu YCFA (proceduri experimentale suplimentare) într-un mediu anaerob folosind CO2 fără oxigen Ze și colab., 2012). Cu toate acestea, P. copri a fost menținut în mediu PYG (Media 104 din catalogul DSMZ).

O cameră anaerobă (Coy Lab Products, Grass Lake, MI, SUA) a fost utilizată pentru a menține un mediu fără oxigen pentru subcultivarea fiecărei bacterii pe o placă de agar care conține mediu YCFA. Pentru prepararea inoculului, o singură colonie a fost transferată în mediu YCFA lichid (7,5 ml în fiecare tub Hungate) și incubată timp de 12-15 ore. Mai mult, sticle de ser de 100 ml (Ochs Laborbedarf, Germania) cu 50 ml volum de lucru din mediu YCFA autoclavizat au fost utilizate pentru efectuarea experimentelor de fermentare într-un mediu anaerob care a fost menținut de CO2 fără oxigen. Fiecare sticlă a fost inoculată cu 2% (v/v) inocul și incubată timp de maximum 30 de ore. Toate experimentele au fost efectuate în trei exemplare.

Pentru simularea GEM-urilor speciilor menționate mai sus, toate componentele mediului YCFA au fost separate în metaboliți individuali (Procedura Experimentală Suplimentară și Tabelul S7) care au fost folosite ca input pentru GEM-uri. Viteza de absorbție a glucozei (mmol gDW −1 h −1) a fost limitată, măsurată prin observații experimentale (Tabelul 1). Ratele de absorbție a metaboliților medii rămași au fost menținute fără restricții (Tabelul S7). Producția de biomasă a fost stabilită ca o funcție obiectivă pentru simularea acestor GEM.

Tabelul 1:

Comparație între ratele de creștere prognozate și ratele experimentale de creștere (n = 3)