Kathleen M. S. E. Reyskens

1 Grup de cercetare cardio-metabolică (CMRG), Departamentul de Științe Fiziologice, Universitatea Stellenbosch, Stellenbosch 7600, Africa de Sud,

proteazei

Tarryn-Lee Fisher

1 Grup de cercetare cardio-metabolică (CMRG), Departamentul de Științe Fiziologice, Universitatea Stellenbosch, Stellenbosch 7600, Africa de Sud,

Jonathan C. Schisler

2 McAllister Heart Institute, Departamentul de patologie și medicină de laborator, Universitatea din Carolina de Nord, Chapel Hill, Carolina de Nord, SUA,

Wendi G. O'Connor

2 McAllister Heart Institute, Departamentul de patologie și medicină de laborator, Universitatea din Carolina de Nord, Chapel Hill, Carolina de Nord, SUA,

Arlene B. Rogers

2 McAllister Heart Institute, Departamentul de patologie și medicină de laborator, Universitatea din Carolina de Nord, Chapel Hill, Carolina de Nord, SUA,

Monte S. Willis

2 McAllister Heart Institute, Departamentul de patologie și medicină de laborator, Universitatea din Carolina de Nord, Chapel Hill, Carolina de Nord, SUA,

Cynthia Planesse

3 Grup de studiu pentru Cronica inflamației și a obezității (GEICO), Platforme CYROI, Universitatea din La Reunion, Saint Denis de La Reunion, Franța,

Florence Boyer

3 Grup de studiu privind Cronica inflamației și a obezității (GEICO), Platforme CYROI, Universitatea din La Reunion, Saint Denis de La Reunion, Franța,

Philippe Rondeau

3 Grup de studiu privind Cronica și Obezitatea Inflamării (GEICO), Platformele CYROI, Universitatea din La Reunion, Saint Denis de La Reunion, Franța,

Emmanuel Bourdon

3 Grup de studiu privind Cronica inflamației și a obezității (GEICO), Platforme CYROI, Universitatea din La Reunion, Saint Denis de La Reunion, Franța,

M. Faadiel Essop

1 Grup de cercetare cardio-metabolică (CMRG), Departamentul de Științe Fiziologice, Universitatea Stellenbosch, Stellenbosch 7600, Africa de Sud,

Conceput și proiectat experimentele: KMSER MFE. Au efectuat experimentele: KMSER TLF JCS WGO ABR CP EB PR. Am analizat datele: KMSER TLF MSW EB MFE. Reactivi/materiale/instrumente de analiză contribuite: MSW EB MFE. Am scris lucrarea: KMSER MFE.

Abstract

Introducere

Virusul imunodeficienței umane (HIV) a infectat peste 40 de milioane de persoane în ultimul deceniu, peste 5 milioane locuind în Africa subsahariană [1], [2]. Deși terapia antiretrovirală foarte activă (HAART) sporește speranța de viață și calitatea persoanelor infectate [3], [4], se pune un accent sporit pe tulburările metabolice mediate de HAART [5] și riscul său potențial de boli cardiovasculare (BCV) pe termen lung -termen.

Inhibitorii de protează (IP) fac parte integrantă din HAART și efectele secundare includ dezvoltarea dislipidemiei, adică producție mai mare de trigliceride și lipide plasmatice împreună cu un profil de colesterol advers [6] - [8]. Împreună, astfel de tulburări provoacă inflamații, stresează miocardul (9) și pot prevedea apariția rezistenței la insulină (IR) [10], [11] și a disfuncției cardiace (11). IP-urile sunt, de asemenea, legate de un risc crescut de infarct miocardic [13] și de anomalii cardiovasculare [14], [15], cu multe modificări asemănătoare bolii coronariene [16]. Nu este clar dacă efectele secundare metabolice ale IP sunt legate independent și/sau cauzal de perturbări cardiovasculare. Mai mult, efectele IP-urilor per se asupra inimii în acest context sunt, de asemenea, slab înțelese. Prin urmare, un accent emergent este identificarea căilor metabolice și transcripționale cheie care pot media fiziopatologia cardio-metabolică indusă de PI. De exemplu, am descoperit recent că șobolanii expuși la 8 săptămâni de tratament PI au prezentat disfuncție cardiacă [17]. Mai mult, persoanele infectate cu HIV tratate cu PI prezintă o producție crescută de specii reactive de oxigen (ROS) [18] - [20] care pot declanșa activarea căilor de semnalizare dăunătoare și a morții celulare [21].

Materiale și metode

Model animal

Lopinavir/Ritonavir (KaletraTM, Abbott Laboratories, Abbot Park IL) a fost zdrobit și dizolvat într-o soluție de etanol 1% (vehicul) la concentrația plasmatică la starea de echilibru uman (7,1 ± 2,9 µg/ml), steril filtrat și injectat într-un mini - pompa osmotică (Alzet, Cupertino CA). Șobolanii masculi Wistar (180-220 g) au primit fie: intervenție chirurgicală simulată (simulare), pompă care conține vehicul sau PI pentru un total de 8 săptămâni (n = 8 per grup) așa cum s-a descris anterior [17]. Consumul de alimente a fost măsurat prin cântărirea săptămânală a alimentelor (în cuști) și exprimat ca mâncare medie consumată pe șobolan. Toate animalele au fost tratate în conformitate cu Ghidul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator ale Academiei Naționale de Științe (publicația NIH nr. 85–23, revizuită în 1996) și efectuate cu aprobarea Comitetului de etică animală a Universității Stellenbosch (Sud Africa).

Evaluarea funcției cardiace de bază

După 8 săptămâni, șobolanii au fost eutanasiați cu pentobarbiton-sodiu (10 mg/kg, ip) și inimile au fost excizate rapid, cântărite și plasate în tampon Krebs-Henseleit (KH) rece ca gheața înainte de canulare pe o platformă de perfuzie Langendorff așa cum s-a descris anterior [17] . Canularea și perfuzia au avut loc în termen de 2) după scăderea fundalului și s-au normalizat la β-actină sau pata Ponceau pentru a corecta variațiile de încărcare. Anticorpii primari (iepure sau șoarece) au fost cumpărați de la Santa Cruz Biotechnologies (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz CA) sau Cell Signaling (Cell Signaling, Danvers MA) pentru a fi utilizați la diluție 1: 1000 cu anticorpul secundar corespunzător (anti-iepure sau anti -soricel anticorpi legați de HRP la diluție 1: 4000).

Evaluarea stresului oxidativ miocardic

Activitatea superoxid dismutazei (SOD) (Enzo Life Sciences, Farmingdale NY) a fost măsurată în preparate mitocondriale (preparate conform Boudina și colab. [38]) urmând instrucțiunile producătorului. Testul activității catalazei se bazează pe proprietățile enzimei catalazei de a reduce peroxidul de hidrogen (H2O2) în oxigen (O2) și apă (H2O) [39]. Testele au fost efectuate pe aproximativ 80 μg de lizat proteic în 25 mM Tris - HCI (pH 7,5). Blankurile au fost măsurate la 240 nm chiar înainte de a adăuga 80 uL de H2O2 (10 mM final) pentru a începe reacția. Activitatea catalazei a fost determinată prin măsurarea scăderii absorbantei H2O2 la 240 nm. Descompunerea peroxidului de hidrogen este un tip de reacție de ordinul întâi după concentrația de H2O2 și constanta de viteză K pentru reacția generală este dată de:

Fiecare măsurare a fost luată în considerare cu 4 replici și datele sunt exprimate ca unitate catalitică (U) per mg de proteină totală. Carbonilarea proteinelor a fost efectuată pe țesuturile cardiace așa cum s-a descris anterior [40].

Determinarea activării căii neoxidative

Pe scurt, țesuturile cardiace colectate au fost omogenizate cu tampon RIPA rece cu gheață modificat, supernatantul a fost centrifugat de două ori la 13.000 g timp de 10 minute la 4 ° C apoi depozitat la -80 ° C până la utilizarea ulterioară. Am folosit o analiză Western blot pentru a determina expresia totală a O-GlcNAc ca un marker pentru activarea miocardică a HBP și concentrațiile de metilglioxal pentru a evalua activarea căii AGE (OxiSelect ™ MG ELISA Kit; Cell Biolabs, San Diego CA). Derivații de metilglioxal se formează din reacția non-enzimatică a glucidelor reducătoare precum glucoza și compușii carbonilici (gliceraldehidă) în reacția Maillard - produsele acestei reacții se numesc AGE. Nivelurile de MG au fost calculate din curba standard și sunt exprimate ca nmol per mg de proteină. Testul PKC a fost efectuat utilizând o metodă bazată pe ELISA, așa cum este detaliat în manualul de instrucțiuni al kitului (Enzo Life Sciences, Farmingdale NY). Activitatea PKC a fost determinată din curba standard și exprimată ca ng/min/ml.

D-sorbitol, un intermediar al căii poliolului a fost măsurat ca un indice de activare a căii. Nivelurile de D-sorbitol au fost măsurate conform detaliilor din instrucțiunile unui kit obținut comercial (BioVision K 631-100, Mountain View CA). Am calculat concentrația de sorbitol (C) a probelor folosind cantitatea de probă (nmol) din curba standard (Sa), volumul probei (μL) utilizat (Sv) și factorul de diluare (D); C = Sa/Sv * D. Am folosit un protocol modificat (EC 2.2.1.1) de la Sigma Aldrich (St. Louis MO) pentru a determina activitatea transketolazei ca marker al ramurii neoxidative a căii pentozfosfatului (PPP). Pe scurt, 5-fosfatul de xiluloză și 5-fosfatul de ribuloză sunt transformate de transketolază în prezența ionilor de magneziu și tiamin pirofosfatului în gliceraldehidă 3-fosfat și sedoheptuloză 7-fosfat. G 3-P este apoi transformat în continuare de triosefosfat izomerază în dihidroxiacetonă fosfat și cu adăugarea de β-NADH și α-glicerofosfat dehidrogenază pentru a produce α-glicerol fosfat și β-NAD pentru a fi măsurate spectrofotometric la 340 nm. Acest protocol a fost adaptat din de la Haba și colab. (1955) [41].