Departamentul de Biochimie și Biologie Moleculară, Universitatea Monash, Clayton, Victoria 3148; și

Departamentul de Biochimie și Biologie Moleculară, Universitatea Monash, Clayton, Victoria 3148; și

Departamentul de Medicină, Spitalul Royal Melbourne, Parkville, Victoria 3050, Australia

Departamentul de Biochimie și Biologie Moleculară, Universitatea Monash, Clayton, Victoria 3148; și

Abstract

obezitatea este o problemă majoră de sănătate publică în majoritatea țărilor dezvoltate. De exemplu, în Australia, aproape unul din cinci adulți este obez, ceea ce îi face extrem de sensibili la diabet, boli coronariene și hipertensiune arterială, precum și la o sănătate psihologică redusă (1). Obezitatea este tratată în mod normal prin dietă și exerciții fizice, dar încercările de a susține o pierdere semnificativă în greutate prin dietă și exerciții fizice se întâlnesc aproape întotdeauna cu eșec (6). Există o mare nevoie de a dezvolta o farmacoterapie mai bună pentru obezitate (18). Aici, începem o evaluare a utilizării potențiale a AOD-9401, un fragment al hormonului de creștere uman (hGH), în tratamentul obezității.

Acest studiu își propune să extindă aceste constatări examinând dacă administrarea orală a acestui fragment de hGH poate reduce și greutatea corporală și poate afecta metabolismul lipidelor. Acest studiu a avut trei părți. În primul rând, am investigat eficacitatea administrării orale a AOD-9401 în ceea ce privește reducerea greutății corporale, echilibrul energetic, lipoliza și lipogeneza în C57BL/6J obez (ob/ob) șoareci. Apoi, am examinat activitatea de oxidare in vitro antilipogenă, lipolitică și de grăsime a AOD-9401 în țesuturile adipoase periferice de la rozătoarele obeze. În cele din urmă, pentru a evalua fezabilitatea tratamentului uman, a fost examinată acțiunea in vitro a AOD-9401 asupra lipolizei și lipogenezei în țesutul adipos din țesutul adipos uman obez.

Sinteza chimică a domeniului funcțional hGH (AOD-9401).

AOD-9401, un fragment sintetic de hGH format din resturile de aminoacizi 177–191, a fost preparat cu o procedură de sinteză în fază solidă și purificat cu o metodă HPLC în fază inversă în laboratoarele noastre de la Universitatea Monash (9). Structura analogului peptidic a fost verificată cu spectrometrie de masă și analiză de aminoacizi.

Testele in vitro pentru degradarea neenzimică și enzimatică a AOD-9401.

AOD-9401 a fost testat pentru stabilitatea sa in vitro împotriva potențialei degradări gastro-intestinale, în conformitate cu protocoalele standard de digestie enzimatică pentru proteine ​​(26). Procedura lui De Laureto și colab. (4) a fost utilizat pentru a evalua rata de degradare prin măsurarea peptidei reziduale cu tehnici RP-HPLC, precum și analiza aminoacizilor.

Animale experimentale și tratament oral.

Optsprezece bărbați C57BL/6J (ob/ob) șoareci cu vârsta cuprinsă între 10-12 săptămâni și cântărind 46,4 ± 1,1 (SE) g au fost utilizați în acest studiu. Animalele au fost împărțite în soluție salină (n = 8) sau grupuri de tratament AOD-9401 (n = 10) și au fost potrivite pentru greutatea corporală și sex. Animalele au fost adăpostite într-un ciclu normal de lumină-întuneric de 12: 12 ore la o temperatură constantă a camerei de 23 ° C în Casa Departamentală pentru Animale de la Universitatea Monash. Animalele au fost hrănite ad libitum cu o dietă standard nepurificată de laborator (Clark King, Melbourne, Australia) și au permis accesul gratuit la apă în orice moment. Șoarecilor li s-au administrat zilnic doze orale de AOD-9401 (500 μg/kg corp greutate) dizolvate în 0,3 ml soluție salină sau numai soluție salină cu volum echivalent timp de 30 de zile. Dozarea precisă a fost facilitată de un ac de gavaj din oțel inoxidabil (7,5 × 0,1 cm diametru). Doza a fost administrată lent pentru a evita refluxul.

Măsurători ale creșterii în greutate corporală, consumului de alimente, consumului de energie și activității fizice.

Greutatea corporală a șoarecilor a fost măsurată înainte de tratament și apoi la fiecare 2 zile până la sfârșitul studiului. Consumul de alimente a fost măsurat la fiecare 2 zile după începerea tratamentului și calculat în medie pentru a se obține o măsurare zilnică. Gramele de dietă nepurificată consumate au fost înmulțite cu 2,85 pentru a da aport caloric în kilocalorii pe zi și apoi înmulțite cu 4,184 pentru a se transforma în kilojoule pe zi. Cheltuielile de energie au fost măsurate la sfârșitul perioadei de tratament cu un calorimetru indirect (Columbus Instruments, Columbus, Ohio).

Amestecuri de gaze standard determinate gravimetric de 20,48% O2 și 0,5% CO2 au fost utilizate pentru calibrarea mașinii înainte de utilizare (BOC Gases Australia, Preston, Victoria, Australia). După gavaj, șoarecii au fost posti timp de 2 ore și apoi plasați într-o cutie de Perspex de 20 × 13 × 11 cm prin care a fost aspirat aer proaspăt la o rată de 0,65 l/min. Ratele medii de CO2 produse și consumate de O2 au fost calculate la fiecare 3 minute pe o perioadă de 30 de minute. Ratele cheltuielilor energetice (kcal/min) au fost calculate utilizând datele din ultimele 15 minute, după asumarea unei excreții urinare de azot de 0,84 mg · min -1 kg greutate corporală -1 (27). În ultimele 3 zile ale perioadei de tratament, nivelurile de activitate fizică voluntară au fost măsurate, de asemenea, la acești șoareci prin utilizarea de roți de rulare cu diametrul de 15 cm. Monitorizarea continuă 24 de ore a utilizării roților rulante a fost realizată cu ajutorul unui contor computerizat (7).

Efectul acut al AOD-9401 asupra oxidării grăsimilor in vivo.

Efectul acut al AOD-9401 asupra ratelor de oxidare a grăsimilor și glucozei a fost evaluat la încheierea perioadei de tratament oral de 30 de zile la obezi. ob/ob șoarecii după consumul de alimente, activitatea fizică și studiile privind cheltuielile de odihnă au fost finalizate. În dimineața ultimei zile a studiului, un grup de trei șoareci tratați cu soluție salină și patru șoareci tratați cu AOD-9401 au fost lipsiți de alimente timp de 1 oră; apoi oxidarea bazală a grăsimilor, oxidarea glucozei și cheltuielile de energie au fost măsurate timp de 10 minute cu procedura de calorimetrie indirectă descrisă anterior. Șoarecii au primit apoi o injecție intraperitoneală de ser fiziologic (în grupul tratat cu soluție salină) sau AOD-9401 (250 μg/kg în grupul tratat cu AOD), iar ratele de oxidare a grăsimilor, oxidarea glucozei și a cheltuielilor de energie au fost măsurate pentru încă 18 min.

Izolarea țesuturilor adipoase.

Grupuri de șoareci au fost uciși cu o doză letală de pentobarbitonă (0,2 ml) la 24 de ore după ultimul tratament cu AOD-9401 oral pe ziua 30. Măsurătorile cheltuielilor de energie după dozarea intraperitoneală AOD-9401 nu au fost efectuate la acești șoareci. Tampoanele de grăsime epididimale de la șoareci masculi au fost izolate ca în studiile noastre anterioare (14). Țesuturile au fost spălate în soluție salină la temperatura camerei înainte de a fi cântărite în bucăți de ± 200 mg pentru teste ex vivo. Pentru testele in vitro, masculin C57BL/6J (ob/ob) s-au folosit șoareci. Șobolani Zucker masculi (200-300 g, vârsta de 12 săptămâni) au fost folosiți pentru a evalua ratele de oxidare a grăsimilor țesutului adipos in vitro ca răspuns la AOD-9401. Țesutul adipos abdominal subcutanat uman a fost obținut cu consimțământul unei paciente supraponderale (vârstă: 42 de ani; indicele de masă corporală: 28,4) care nu a avut alte complicații medicale cunoscute și care a suferit o intervenție chirurgicală de reducere a grăsimii din motive cosmetice.

Test pentru activitatea lipogenică în țesutul adipos.

Rata de încorporare a glucozei [14 C] exogene în lipidele totale din țesutul adipos a fost utilizată ca indice de activitate lipogenică. Țesuturile au fost plasate în 2 ml de tampon Krebs-Ringer bicarbonat (KRB) (pH 7,4) conținând 2% BSA degresat și 0,1 mg/ml glucoză și apoi au fost gazate cu 95% O2-5% CO2 într-o baie de apă agitată, cu temperatură controlat la 37 ° C. După 30 de minute de preincubare, țesuturile au fost transferate la alți 2 ml de mediu proaspăt conținând [14 C] glucoză (activitate specifică finală de 0,05 μCi/μmol) pentru încă 90 de minute (aceleași condiții ca mai sus). Țesuturile au fost apoi îndepărtate și clătite bine în soluție salină, iar lipida a fost extrasă cu un amestec de cloroform-metanol (2: 1). Radioactivitatea 14 C a fost numărată pe un contor de scintilație lichid Wallac 1410 (Turku, Finlanda). Ratele sintezei lipidelor totale au fost exprimate ca picomoli de glucoză încorporată în grăsimi pe miligram de țesut pe oră.

Test pentru activitatea lipolitică în țesutul adipos.

Rata activității lipolitice a fost măsurată prin eliberarea glicerolului în mediul de incubație. Bucățile de țesut au fost plasate în tampon KRB de 2 ml cu 2% BSA și 0,1 mg/ml glucoză și incubate timp de 60 min (aceleași condiții ca mai sus). Țesuturile au fost apoi îndepărtate și aruncate, iar cantitatea de glicerol prezentă în mediul de incubație a fost testată enzimatic folosind reacții de glicerol fosfat oxidază (Sigma Diagnostics, nr. Catalog GPO-337; St Louis, MO). Glicerolul a fost determinat cu un spectrofotometru și transformat în micromoli de glicerol eliberat pe gram de țesut pe oră.

Măsurători plasmatice.

Probele de sânge au fost colectate din vena cozii animalelor anesteziate în tuburi capilare după tratament cronic. Plasma a fost depozitată la -20 ° C până la utilizare. Glucoza a fost măsurată folosind un analizor de glucoză 2300 STAT. Acizii grași liberi (FFA) au fost determinați prin metoda dezvoltată din Noma (15). Trigliceridele (TG) au fost măsurate cu un kit conform recomandărilor producătorului (Sigma).

Test de oxidare FFA in vitro.

analize statistice.

Studentii t-testul a fost folosit pentru a analiza rezultatele. Toate datele sunt exprimate ca mijloace ± SE. P valori ale

orale

FIG. 1.Rezultate din digestia in vitro a AOD-9401 în prezența tripsinei și pepsinei. Condițiile pentru digestie sunt cele descrise de Stone și Williams (26).

Efect in vivo al AOD-9401 asupra echilibrului energetic la șoareci obezi (ob/ob).

Figura 2 arată schimbarea greutății corporale după ce șoarecii au fost tratați oral cu AOD-9401 sau soluție salină timp de 30 de zile. Rata creșterii în greutate a fost cu 58% mai mică la șoarecii tratați cu AOD-9401 dinziua 16 de tratament în continuare (0,33 până la 0,14 g/zi,P

FIG. 2.Efectul AOD-9401 asupra creșterii cumulative în greutate corporală (înseamnă ± SE) a obezilorob/ob) șoareci în perioada de tratament de 30 de zile. Animalele au fost gavate zilnic fie cu 0,3 ml soluție salină (●)n = 8) sau AOD-9401 (500 μg · kg corp greutate -1 -1 zi -1, ○)n = 10) printr-un ac de gavaj P

Reducerea creșterii în greutate corporală la șoarecii obezi tratați cu AOD-9401 nu s-a datorat scăderii consumului de alimente. Figura 3 arată că aportul caloric mediu zilnic din ziua 2 la ziua 30 a fost la fel în grupurile tratate cu soluție salină și AOD-9401. Nici reducerea creșterii în greutate corporală nu s-a corelat cu creșterea cheltuielilor energetice de repaus măsurate la 2 ore după tratamentul cu gavaj (0,00525 ± 0,00028 față de 0,00518 ± 0,00042 kcal/min la șoareci tratați cu AOD-9401 și, respectiv, cu soluție salină). Cheltuielile de energie de repaus au fost aceleași la șoarecii tratați cu AOD-9401 și cu soluție salină, chiar și atunci când au fost normalizați pentru greutatea corporală (0,103 ± 0,004 față de 0,101 ± 0,009 kcal · min −1 · kg −1 la șoareci tratați cu AOD-9401 și cu soluție salină, respectiv). AOD-9401 nu a crescut activitatea roții de rulare la obezi ob/ob șoareci (datele nu sunt prezentate). Tulpina șoarecelui este foarte inactivă în comparație cu alte tulpini de șoareci și rămâne așa chiar și după tratamentul cu AOD-9401.

FIG. 3.Consumul mediu zilnic de alimente (kJ/zi) al obezilorob/ob) șoareci în timpul perioadei de tratament de 30 de zile după administrarea de soluție salină (●) sau AOD-9401 (○). Rezultatele sunt exprimate ca medii ± SE. Nu s-a observat nicio semnificație statistică pe toată durata tratamentului.

Efectul ex vivo al AOD-9401 asupra lipogenezei și lipolizei.

Datele din Fig. 4A arată că AOD-9401 a crescut rata lipolitică de la 0,63 ± 0,20 μmol · g țesut -1 -1 h h -1 la animalele martor la 1,02 ± 0,25 μmol · g țesut -1 -1 h h -1 (P −1 · h −1, P 14 C] glucoză în lipide. Aceste modificări ale metabolismului lipidelor sunt în concordanță cu scăderea observată a creșterii cumulative în greutate corporală a animalelor tratate.

FIG. 4.Activitate lipogenică ex vivo (A) și activitate lipolitică (B) în țesuturile adipoase ale obezului (ob/ob) șoareci după administrarea orală de 30 de zile de AOD-9401. Datele sunt exprimate ca mijloace ± SE de control (n = 10) și tratatn = 10) țesuturi. * P

Pe lângă aceste observații, au fost observate și efecte asupra metaboliților plasmatici (Tabelul 1). Rezultatele indică faptul că, după administrarea cronică de AOD-9401, se poate înregistra o creștere semnificativă a FFA plasmatice. Nivelurile de glucoză și TG sunt ușor mai mici la animalele tratate, dar nu diferă semnificativ de martorii.

Tabelul 1. Efectele tratamentului AOD-9401 asupra glucozei și lipidelor plasmatice

Valorile glucozei și lipidelor plasmatice sunt prezentate aici ca mijloace ± SE de control (n = 5) și tratate cu AOD-9401 (n = 7) ob/ob șoareci după administrare orală cronică (* P

FIG. 5.Măsurători ale cheltuielilor energetice bazale (A), oxidarea grăsimilor (B) și oxidarea glucozei (C) înainte și după injectarea ip de AOD-9401 (250 μg/kg,n = 4) sau soluție salină (n = 3) și umerașeob/ob) șoareci. Rezultatele sunt exprimate ca mijloace ± SE (* P

Efect in vitro al AOD-9401 asupra lipogenezei, lipolizei și oxidării grăsimilor.

Efectul AOD-9401 asupra lipogenezei și lipolizei este, de asemenea, evident in vitro. Figura 6 prezintă un efect clar al dozei dependente de AOD-9401 asupra lipogenezei (Fig. 6A) și lipoliză (Fig. 6B). Țesut adipos epididimal periferic de la masculul C57BL/6J (ob/ob) șoarecii au fost incubați în prezența AOD-9401 timp de 1 oră.

FIG. 6.Lipogeneza in vitro (A) și lipoliză (B) în țesutul adipos epididimal de la obezi (ob/ob) șoareci în prezență salină (martor) sau diferite concentrații de AOD-9401. Fiecare bară reprezintă media ± SE a 6 determinări (* P

Efectul AOD-9401 asupra oxidării grăsimilor a fost, de asemenea, măsurat, de data aceasta la șobolanii obezi Zucker masculi. AOD-9401 a acționat în mod dependent de doză pentru a crește rata de oxidare a grăsimilor (Fig. 7), cu o creștere semnificativă de 25% a oxidării grăsimilor observată la concentrații de 1,0 μM AOD-9401P

FIG. 7.Ratele in vitro de oxidare a grăsimilor la țesutul adipos epididimal de șobolan Zucker mascul incubat în prezența diferitelor concentrații de AOD-9401. Barele exprimă media ± SE de 6 determinări. (* P

Efect in vitro al AOD-9401 asupra țesutului adipos uman.

AOD-9401 și analogii sintetici au potențialul de a fi dezvoltat pentru aplicații terapeutice, inclusiv pentru gestionarea obezității umane. Astfel, am evaluat și efectul AOD-9401 asupra țesutului adipos subcutanat uman. Tabelul 2 indică faptul că AOD-9401 a îmbunătățit lipoliza în țesutul adipos uman, rezultând o creștere de trei ori a eliberării glicerinei și a scăzut activitatea lipogenică cu 50%, similar cu constatările noastre in vitro din ob/ob țesut de șoarece.

Tabelul 2. Lipoliza in vitro și antilipogeneza în țesutul adipos subcutanat uman prin AOD-9401