Abstract

Utilizarea sărurilor de hipoclorit pentru dezinfectare datează de la mijlocul secolului al XVIII-lea. Din acel moment, clorarea a fost cel mai utilizat tratament bactericid pentru dezinfectarea convențională a apei potabile municipale pentru prevenirea bolilor epidemice, cum ar fi holera și tifoida, și este în continuare cea mai utilizată metodă de dezinfectare a apei (18). Hipocloritul este, de asemenea, utilizat în mod obișnuit ca dezinfectant pentru uz casnic, precum și în fabricile de procesare a alimentelor pentru a elimina contaminanții de suprafață care pot modifica calitatea alimentelor sau pot duce la boli de origine alimentară (2, 3, 23, 29).

suprafeței

Se știe că hipocloritul este un agent foarte eficient pentru uciderea bacteriilor; chiar și concentrațiile micromolare sunt suficiente pentru a reduce semnificativ populațiile bacteriene (27). Cu toate acestea, se știe puțin despre mecanismele exacte ale uciderii bacteriene de către acest dezinfectant. Când sunt diluate în apă, sărurile de hipoclorit utilizate [NaOCl, Ca (OCl) 2, LiOCl și KOCl] conduc la formarea HOCl, a cărei concentrație este corelată cu activitatea bactericidă (27). Uciderea bacteriană prin HOCl se poate datora cel puțin parțial deteriorării letale a ADN-ului (13, 42). Cu toate acestea, HOCl în sine este atât de reactiv încât este puțin probabil să pătrundă în celule și să ajungă la ADN; mai degrabă, se pare că activitatea bactericidă se datorează formării de produse secundare, deoarece acidul hipocloros reacționează avid cu o mare varietate de compuși subcelulari (membrane, proteine ​​etc.) (10, 18). În special, HOCl reacționează cu NH4 + și aminele organice pentru a forma cloramine foarte toxice, care sunt, de asemenea, compuși puternici de oxidare și clorurare și care ar putea fi agenții de ucidere. Aceste cloramine sunt specii foarte difuzibile care pot pătrunde în celule prin membrane și pot reacționa cu componentele intracelulare, inclusiv ADN (10, 32, 33, 35).

În studiile privind interacțiunile plante-bacterii, este uneori necesară utilizarea modelelor monoxenice în care o plantă sterilizată la suprafață este asociată cu o tulpină bacteriană. Agenții oxidativi precum înălbitorul de uz casnic, care este compus din hipoclorit de sodiu, sunt agenții cei mai frecvent utilizați pentru sterilizare. Semințele sunt clătite înainte de inocularea bacteriană. În această situație paradoxală, dezinfectantul este de așteptat să fie suficient de puternic pentru a ucide toți contaminanții și suficient de ușor pentru a permite colonizarea ulterioară de către un microorganism inoculat.

În cursul unui studiu al interacțiunilor dintre orez și bacteria care promovează creșterea plantelor Burkholderia vietnamiensis TVV75 (37), am abordat întrebarea dacă sterilizarea suprafeței semințelor prin dezinfectanți oxidativi este inofensivă. Am testat un tratament utilizat în mod obișnuit, în care H2O2 și hipocloritul sunt combinate și au atât efect bactericid, cât și efect fungicid, dar fără efect asupra germinării cariopsei (29).

Efectele au fost caracterizate pe baza comportamentului celulelor inoculate la diferite niveluri, inclusiv capacitatea de creștere (număr CFU), starea fiziologică a supraviețuitorilor (respirație) și efectul genotoxic (mutageneză). Am cuantificat două mutații, una care conferă rezistență la rifampicină și una care conferă rezistență la acid nalidixic și am studiat următoarele ținte clasice ale acestor mutații: pentru rezistența la rifampicină, o regiune centrală scurtă conservată a rpoB care codifică subunitatea ARN polimerază β (7, 19, 34, 41); și pentru rezistența la acid nalidixic, o regiune mică la capătul 5 ′ al gyrA, așa-numita regiune determinantă a rezistenței la chinolone (QRDR) (această regiune este foarte conservată în toate gyraze bacteriene cunoscute, iar mutațiile Nal r afectează echivalentul reziduurilor de aminoacizi la Ala-67 prin Gln-106 codificat de gena Escherichia coli [44]).

În acest studiu, am constatat că utilizarea hipocloritului pentru dezinfectarea semințelor de orez stresează puternic inoculul bacterian și că bacteriile supraviețuitoare au o sarcină mutațională crescută.

MATERIALE ȘI METODE

Reactivi.

Toate substanțele chimice utilizate au fost de calitate analitică. Acidul nalidixic, rifampicina și clorura de 2- (4-iodofenil) -3- (4-nitrofenil) -5-feniltetrazolium (INT) au fost achiziționate de la Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Germania. H2O2 a fost obținut de la Prolabo, Fontenay sous Bois, Franța; tiosulfatul de sodiu a fost obținut de la Merck, Darmstadt, Germania; cristale verzi de malachit au fost obținute de la Réactifs RAZ, Clichy, Franța; iar hipocloritul de calciu (~ 35% Cl disponibil) a fost achiziționat de la BDH Laboratory Supplies, Poole, Anglia.

Dezinfectarea semințelor de orez.

Pentru a facilita contactul bacteriilor cu dezinfectantul, semințele de orez (cv. Cigalon) au fost decorticate înainte de sterilizare. Semințele (200 de semințe la 100 ml) au fost scufundate de două ori timp de 10 minute într-o soluție de H2O2 10% și apoi timp de 1 oră într-o soluție de hipoclorit de calciu filtrată 1%, preparată extemporan, cu agitare. După fiecare imersiune, semințele au fost clătite de cinci ori cu apă sterilă demineralizată (5 min pe clătire). La sfârșitul procesului de dezinfecție, semințele au fost clătite de 10 ori cu apă sterilă demineralizată. Într-un control, etapa de hipoclorit a fost omisă. Într-un alt control, a fost utilizată o soluție de tiosulfat de sodiu 2% în loc de cinci clătiri cu apă la mijlocul ultimei proceduri de clătire, pentru a îndepărta capacul de clor rămas pe suprafața semințelor prin dezinfectarea hipocloritului (16). Semințele de orez au fost apoi șterse pe foi de hârtie de filtru Whatman sterile înainte de a fi plasate în godeurile plăcilor de cultură cu 12 godeuri (10 semințe pe godeu). Au existat, de asemenea, tratamente de control în care semințele au fost ucise înainte de dezinfectare prin încălzirea lor într-un cuptor uscat la 100 ° C timp de 30 de minute.

Inocularea bacteriană și măsurarea frecvenței mutanților.

Bacteriile au fost inoculate imediat în plăcile de cultură cu 12 godeuri. S-a folosit tipul de tulpină de B. vietnamiensis, TVV75 (= LMG 10929). Celulele au fost cultivate mai întâi în mediu lichid Luria-Bertani (LB) timp de 18 ore. O diluție de 10 -2 a fost apoi transferată în mediu lichid M9 (24) suplimentat cu 0,1% extract de drojdie. După 48 de ore de cultivare (densitate optică la 600 nm, 1), celulele au fost diluate în mediu M9 suplimentat cu extract de drojdie pentru a obține o concentrație de 106 CFU/ml. Alicote (800 μl) au fost apoi inoculate în godeurile plăcilor de cultură care conțin semințe de orez dezinfectate. Controalele au fost preparate fără semințe în puțuri sau cu semințe de orez ucise la căldură. Timp de 2 zile, creșterea bacteriană a fost monitorizată prin numărarea periodică a CFU pe plăcile medii LB, iar frecvența rezistenței a fost măsurată prin placarea probelor pe plăcile medii LB suplimentate cu rifampicină (50 μg/ml) sau acid nalidixic (150 μg/ml).

Măsurători de viabilitate bacteriană.

Procentul de celule care respiră a fost monitorizat cu un microscop folosind INT, un derivat al clorurii de feniltetrazolium care formează cristale dense roșu închis atunci când este redus de către electroni metabolici (45); S-au adăugat 70 pl dintr-o soluție INT de 0,2% la conținutul unei godeuri (700 pl de cultură celulară) și, după 1 oră de incubație în întuneric, s-au adăugat 14 pl dintr-o soluție de formaldehidă 37%. După centrifugare, frotiurile au fost preparate pe lamele și contracolorate cu o soluție de 0,05% verde de malachit. În toate cazurile, celulele au fost numărate în cinci câmpuri aleatorii cu un microscop (mărire, × 1.200).

Analize de concurs.

Stabilitatea mutanților obținuți în urma tratamentului cu semințe cu hipoclorit a fost evaluată prin cocultivarea mutanților cu tipul sălbatic. Tulpinile au fost cultivate mai întâi în mediu LB lichid timp de 18 ore și apoi diluate (1/100) în mediu M9 modificat, așa cum s-a descris mai sus. După 48 de ore de cultivare (densitate optică la 600 nm, 1), culturile au fost diluate în mediu M9 modificat pentru a obține o concentrație de 5 × 104 CFU/ml. În fiecare godeu, s-au coculturat 400 pl dintr-un mutant și 400 pl din tulpina de tip sălbatic. Creșterea bacteriană totală a fost monitorizată prin numărarea CFU numai pe mediu LB și CFU a tulpinii rezistente la antibiotice pe mediu LB suplimentată cu rifampicină (50 μg/ml) sau acid nalidixic (150 μg/ml). Creșterea tulpinii de tip sălbatic a fost apoi calculată prin scăderea numărului de CFU care s-a dezvoltat pe plăci suplimentate cu antibiotice din numărul total de CFU pe plăci medii LB.

Primeri ADN utilizați pentru analiza mutanților Rif r și Nal r.

Mutanții Rif și Nal r au fost analizați prin amplificarea genelor țintă corespunzătoare, respectiv rpoB și gyrA. Am aliniat secvențele gyrA și rpoB disponibile în baza de date GenBank (Tabelul (Tabelul 1) 1) utilizând algoritmul ClustalW cu aliniere multiplă (36). În regiunile conservate, primerii F872 (GCAACCGCCGAGTACG) și F873 (CTGGCCTGACGTTGCAT) au fost proiectați pentru a detecta fragmentul central scurt al rpoB, în timp ce F874 (CACCGGCGCGTACTGTA) și F875 (TGTGCGGCGGGGATRTmTrT Primerii ADN au fost proiectați utilizând software-ul OLIGO (31), iar specificitatea a fost testată cu date GenBank utilizând programul BLASTn (1). Fragmentele de ADN așteptate au corespuns pozițiilor nucleotidice 1346-2069 ale genei E. coli rpoB și pozițiilor nucleotidice 133 până la 556 ale genei E. coli gyrA. Primerii oligonucleotidici au fost sintetizați de Eurogentec (Seraing, Belgia).

TABELUL 1

Secvențe de ADN bacteriene utilizate pentru proiectarea primerilor PCR pentru a amplifica zonele de mutație țintă a antibioticului B. vietnamiensis gyrA și rpoB