Tsutomu Shimada

1 Institutul de Cercetări în Științe Farmaceutice, Universitatea Musashino, Shinmachi Nishitokyo-shi, Tokyo 202-8585, Japonia

Mitsutaka Kosugi

2 Departamentul de farmacie clinică, Școala postuniversitară de știință și tehnologie naturală, Universitatea Kanazawa, Kakuma-machi Kanazawa-shi, Ishikawa, Japonia

Daisuke Tokuhara

3 Spitalul Tomei Atsugi, orașul Atsugi, Kanagawa, Japonia

Masahito Tsubata

4 Toyo Shinyaku Co. Ltd., Tosu-Shi, Saga, Japonia

Tomoyasu Kamiya

4 Toyo Shinyaku Co. Ltd., Tosu-Shi, Saga, Japonia

Mayu Sameshima

4 Toyo Shinyaku Co. Ltd., Tosu-Shi, Saga, Japonia

Rika Nagamine

4 Toyo Shinyaku Co. Ltd., Tosu-Shi, Saga, Japonia

Kinya Takagaki

4 Toyo Shinyaku Co. Ltd., Tosu-Shi, Saga, Japonia

Ken-ichi Miyamoto

2 Departamentul de farmacie clinică, Școala postuniversitară de științe și tehnologie naturală, Universitatea Kanazawa, Kakuma-machi Kanazawa-shi, Ishikawa, Japonia

Masaki Aburada

1 Institutul de Cercetări în Științe Farmaceutice, Universitatea Musashino, Shinmachi Nishitokyo-shi, Tokyo 202-8585, Japonia

Abstract

1. Introducere

Obezitatea, în special acumularea de grăsime viscerală, este asociată cu un potențial de vătămare și oferă o bază patologică pentru diferite boli metabolice, dezvoltarea diabetului/metabolismul lipidic anormal/hipertensiunea și alte complicații metabolice începând cu rezistența la insulină și progresând spre arterioscleroză și cerebral ischemic/boli cardiace. Cercetările exploratorii prioritare au căutat materiale pentru dezvoltarea medicamentelor pentru a preveni și trata aceste tulburări.

Extractul de scoarță de pin (Flavangenol), obținut din pinii care cresc pe coasta de vest a Franței (Pinus maritima), conține complexe oligomerice de proantocianidină (oligomeri de catehină) ca ingredient major. Extractul de scoarță de pin a fost raportat ca fiind un antioxidant [1] și antiinflamator [2], cu capacitatea de a îmbunătăți leziunile microvasculare diabetice [3], funcția celulelor endoteliale vasculare [4-6] și leziunea renală indusă de ischemie/reperfuzie [7]. Studiile clinice indică faptul că extractul este eficient în tratamentul insuficienței venoase cronice și a micro-hemoragiilor retiniene [8].

Principalele cauze ale obezității și ale bolilor metabolice bazate pe obezitate includ factorii genetici [9-11] și factorii de mediu (supraalimentare, stres, dezvoltarea mijloacelor de transport). Am dezvoltat anterior un model animal al bolii, Tsumura Suzuki Obese Diabetes (TSOD), care dezvoltă în mod spontan diferite caracteristici similare cu cele ale bolilor metabolice umane și am confirmat că acesta este un model de șoarece obez spontan de diabet de tip II [12-14] . În plus, Izumi și colab. au analizat șoareci TSOD prin metoda de cartografiere QTL și au raportat că acesta este un model multi-factorial de obezitate ereditară/boală metabolică cu mutații în locurile genetice care controlează greutatea corporală, nivelul insulinei, nivelul grăsimilor și mărimea adipocitelor [15, 16].

În acest studiu, șoarecii TSOD cu gene pentru boli metabolice au primit o dietă occidentală (WTD) ca factor de mediu, iar efectele preventive ale Flavangenolului asupra diferitelor caracteristici ale bolii metabolice au fost investigate. Mai mult, pentru a clarifica mecanismul de acțiune al flavangenolului, am investigat efectul flavangenolului asupra absorbției lipidelor derivate din masă.

2. Metode

2.1. Materiale experimentale

Flavangenolul utilizat în acest studiu a fost furnizat de Toyo Shinyaku Co. Ltd (Prefectura Saga) și conține 72,5% polifenol (determinat prin metoda Folin-Denis), inclusiv 5% proantocianidină B1, 2,98% catehină și 0,23% epicatechină.

WTD, F2WDT (Oriental Yeast Co., Ltd, Tokyo), conține 19,82% cazeină, 0,3% l-cistină, 3,7458% amidon de porumb, 1,25% α-amidon de porumb, 34% zaharoză, 1,0% ulei de soia, 5,0% pulbere de celuloză, 1,0% amestec de vitamine AIN-93, 3,5 AIN-93G amestec mineral, 0,25% bitratrat de colină, 0,0042% t-butilhidrochinonă, 20,0% grăsime din lapte (unt etc.), 9,98% maltodextrină și 0,15% colesterol. Caloriile totale ale elementelor nutriționale au fost de 450,8 kcal/100 g, iar procentele de calorii au fost de 17,8% pentru proteine, 20,0% pentru lipide și 49,0% pentru carbohidrați. Ca dietă de control, MF (Oriental Yeast Co. Ltd) a fost utilizat ca „dietă obișnuită”: calorii totale ale elementelor nutriționale: 360 kcal/100 g, procente calorice: 23,6% pentru proteine, 5,3% pentru lipide și 6,1% pentru glucide).

2.2. Animale experimentale

Șoarecii TSOD și șoarecii de control Tsumura Suzuki Non-Obesity (TSNO) (derivați din aceeași ascendență, dar care nu au dezvoltat nicio boală metabolică), au fost achiziționați de la Institutul pentru Reproducerea Animalelor (Prefectura Ibaraki) la vârsta de 3 săptămâni. Pe de altă parte, șoareci ddY de 5 săptămâni au fost cumpărați de la Tokyo Laboratory Animals Science Co. Ltd. (Tokyo). Șoarecii au fost acomodați timp de o săptămână la temperatura de 23 ± 2 ° C și umiditatea de 55 ± 10% și li s-a dat o dietă obișnuită cu pulbere MF și apă purificată ad libitum. După aclimatizare, șoarecii TSOD și TSNO au fost cântăriți și repartizați în cinci grupuri (grupul TSNO-MF: șoareci TSNO cărora li s-a administrat MF; grupul TSOD-MF: șoareci TSOD cărora li s-a administrat MF; grupul TSOD-WTD: șoarecii TSOD au primit WTD; Grupul TSOD-WTD-Flavangenol 3%: șoareci TSOD cărora li s-a administrat WTD conținând 3% Flavangenol; Flavangenolul a fost amestecat bine cu WTD astfel încât conținutul să fie uniform de 3 sau 5%. În timpul experimentului de 8 săptămâni, fiecărui grup i s-a dat apă și fiecare dietă definită ad libitum. Toate procedurile de experimentare pe animale au fost efectuate în conformitate cu Regulile etice ale experimentului pe animale de la Universitatea Musashino.

2.3. Componente examinate în timpul experimentului pe animale

Toate animalele au fost cântărite o dată pe săptămână, iar aportul de alimente a fost determinat o dată la două săptămâni [17-20]. Pentru investigarea evoluției în timp a modificărilor cantităților de grăsime viscerală și subcutanată, cantitățile de grăsime viscerală și subcutanată au fost determinate la începutul experimentului și la următoarele 4 și 8 săptămâni, în total de trei ori, cu raze X tomografie computerizată (CT; Latheta, Aloka Co. Ltd. Tokyo) cu scanare de la procesul ensiform la osul sacral la distanțe de 1,5 mm sub anestezie cu Nembutal (50 mg/kg ip).

2.4. Test de încărcare a glucozei și determinarea tensiunii arteriale

Testul de încărcare a glucozei și determinarea tensiunii arteriale au fost efectuate la 8 săptămâni după începerea experimentului. În testul de încărcare a glucozei, fiecărui șoarecel după post pentru o noapte i s-a administrat glucoză orală (2 g/kg); prelevarea de probe de sânge din plexul venos orbital a fost efectuată la momentele definite în condiții neanesteziate. Probele de plasmă obținute prin centrifugare au fost depozitate la -80 ° C până la determinarea concentrațiilor de glucoză.

Tensiunea arterială a fost determinată cu un contor de tensiune neinvaziv (Softron Co. Ltd, Tokyo) prin fixarea fiecărui șoarece într-un aparat de fixare (Softron Co. Ltd) în condiții non-anesteziate. Manșeta a fost așezată la rădăcina cozii pentru a determina presiunea sanguină sistolică/diastolică/medie.

2.5. Componente examinate la sfârșitul experimentului

În condiții fără post, fiecare șoarece a fost anesteziat cu eter și sângele a fost extras din vena cavă abdominală. Probele de plasmă obținute prin centrifugare au fost depozitate la -80 ° C până când s-au putut efectua teste biochimice de sânge. La momentul autopsiei, ficatul, grăsimea mezenterică, grăsimea perinefrică, grăsimea epididimală și grăsimea retroperitoneală au fost izolate și cântărite. Folosind probele de plasmă obținute, nivelurile de glucoză, colesterol total, triacilglicerol și acizi grași liberi au fost determinate cu kituri de testare biochimice obținute de la Wako Pure Chemical Industries Ltd (Tokyo). Nivelul de insulină a fost determinat cu Rebis Insulin-Mouse-T (Shibayagi Co. Ltd, Gunma Prefecture), nivelul de adiponectină cu Mouse Adiponectin/Acrp30 Immunoassay (R&D Systems) și nivelul TNF-α cu TNF-α ELISA Ltd., Tokyo ).

2.6. Test de încărcare a uleiului de măsline și testul de inhibare a lipazei pancreatice

Testul de încărcare a uleiului de măsline a fost efectuat conform metodei Ninomiya și colab. [21]. După post pentru o noapte, șoarecii ddY de 6 săptămâni au fost administrați oral cu Flavangenol (0,5 sau 1 g/kg) și 30 de minute mai târziu, cu ulei de măsline (5 ml/kg). Prelevarea de sânge din plexul venos orbital a fost efectuată la momentele definite în condiții neanesteziate. Probele de plasmă obținute prin centrifugare au fost depozitate la -80 ° C până la determinarea concentrațiilor de triacilglicerol.

Testul de inhibare a lipazei pancreatice a fost efectuat conform metodei Ninomiya și colab. [21], folosind un kit general (Lipase Kit S: Dainippon Sumitomo Pharma Co. Ltd, Osaka) și lipaza pancreatică porcină (L3126 Tip II, Sigma-Aldrich, St Louis, MO).

2.7. Analize statistice

Datele au fost afișate ca medie ± deviație standard (SD). În fiecare experiment, diferența dintre grupuri a fost testată pentru semnificație prin procedura de comparație multiplă a lui Dunnett, cu un nivel de semnificație de 0,05.

3. Rezultate

3.1. Modificări ale greutății corporale și ale consumului de alimente

Greutatea corporală în grupul TSOD-MF a fost semnificativ mai mare decât în ​​grupul TSNO-MF ca grup de control și a devenit și mai mare în grupul TSOD-WTD alimentat cu WTD. În grupurile TSOD-WTD-Flavangenol, s-a observat un efect supresor semnificativ dependent de doză asupra greutății corporale din prima săptămână după începerea experimentului, în comparație cu grupul TSOD-WTD și cu o greutate corporală mai mică decât în ​​TSOD -Grupul MF a fost văzut la 4 săptămâni după începerea experimentului (Figura 1). Tabelul 1 prezintă aportul de alimente și energie din fiecare grup la 8 săptămâni după începerea experimentului. Aportul de alimente și energie din grupul TSOD-MF a fost semnificativ mai mare decât în ​​grupul TSNO-MF, arătând că șoarecii TSOD mănâncă în exces și ingeră energie excesivă. Aportul alimentar a fost semnificativ mai mic în grupul TSOD-WTD decât în ​​grupul TSOD-MF, dar aportul de energie nu a fost diferit. Pe de altă parte, aportul de alimente și energie nu a fost diferit între grupul TSOD-WTD și grupul TSOD-WTD-Flavangenol. Datele privind consumul de alimente și energie obținute la 2, 4 și 6 săptămâni după începerea experimentului în fiecare grup au fost aproape aceleași cu datele obținute după 8 săptămâni.

extractului

Efectul Flavangenolului asupra greutății corporale la șoareci. Diamant închis: TSNO-MF; pătrat închis: TSOD-MF; triunghi închis: TSOD-WTD; pătrat deschis: TSOD-WTD-Flavangenol 3%; triunghi deschis: TSOD-WTD-Flavangenol 5%. Datele reprezintă media ± SD a 8-9 animale. ** P ## P Figura 2 (a) este o imagine CT din jurul celei de-a șasea vertebre lombare a unui șoarece reprezentativ care arată greutatea corporală medie a fiecărui grup determinată la 8 săptămâni după începerea experimentului. Circumferința abdominală a crescut mai mult în grupul TSOD-MF decât în ​​grupul TSNO-MF și a crescut în mod semnificativ în grupul TSOD-WTD. Pe de altă parte, în grupurile tratate cu Flavangenol, creșterea extremă a circumferinței abdominale observată în grupul TSOD-WTD a fost prevenită. Cantitatea de grăsime viscerală și subcutanată a fost semnificativ mai mare în grupul TSOD-MF decât în ​​grupul TSNO-MF și în continuare semnificativ mai mare în grupul TSOD-WTD alimentat cu WTD (Figura 2 (b)). Atât cantitățile acumulate de grăsime viscerală, cât și cea subcutanată au prezentat valori semnificativ mai mari de la 4 săptămâni după începerea experimentului. Pe de altă parte, în grupurile TSOD-WTD-Flavangenol, s-a observat un efect supresiv semnificativ asupra acumulării atât a grăsimii viscerale, cât și a celei subcutanate de la 4 săptămâni după începerea experimentului, comparativ cu grupul TSOD-WTD, de grăsime viscerală și subcutanată în grupurile TSOD-WTD-Flavangenol a scăzut decât în ​​grupul TSOD-MF.