Seul Gi Lee

1 Departamentul de Știința Alimentelor și Biotehnologie, Universitatea Națională Kyungpook, Daegu 41566, Coreea; moc.revan@974001gsl

frunze

Yoon Jeong Lee

2 Departamentul de Științe ale Vieții, Universitatea Yeungnam, Gyeongsan 38541, Coreea; ten.liamnah@7447-eeljy

Myeong-Hwan Jang

3 Punggi Ginseng Research Institute Gyeong Buk A.R.E.S, Gyeongsangbuk-do Cercetare agricolă și servicii de extindere, Daegu 41404, Coreea; rk.aerok@jmnawh (M.-H.J.); rk.aerok@7711nowkrt (T.R.K.)

Tae Ryong Kwon

3 Punggi Ginseng Research Institute Gyeong Buk A.R.E.S, Gyeongsangbuk-do Cercetare agricolă și servicii de extindere, Daegu 41404, Coreea; rk.aerok@jmnawh (M.-H.J.); rk.aerok@7711nowkrt (T.R.K.)

4 Division of Agriculture Environment Research, Gyeongsangbuk-do Agricultural Research & Extension Services, Daegu 41404, Korea

Ju-Ock Nam

1 Departamentul de Știința Alimentelor și Biotehnologie, Universitatea Națională Kyungpook, Daegu 41566, Coreea; moc.revan@974001gsl

5 Institutul de Știință și Tehnologie Agricolă, Universitatea Națională Kyungpook, Daegu 41566, Coreea

Date asociate

Abstract

1. Introducere

Obezitatea este o problemă majoră de sănătate publică și este asociată cu o incidență crescută a bolilor metabolice la nivel mondial [1,2]. Este cauzată de un dezechilibru între aportul de energie și consumul de energie, care generează țesut adipos excesiv [3,4]. Masa țesutului adipos poate fi reglată prin procesul de adipogeneză sau prin diferențierea adipocitelor, care a fost studiat pe larg pentru tratamentul sau prevenirea obezității [5,6]. Deși multe studii au investigat potențialele tratamente pentru obezitate, dezvoltarea medicamentelor pentru tratamentul obezității pe termen lung nu a avut prea mult succes [7]. Prin urmare, strategiile pentru prevenirea obezității folosind alimente funcționale pentru sănătate sunt considerate importante.

Rădăcina ginsengului este folosită în mod tradițional pentru prevenirea și tratarea diferitelor boli de peste 2000 de ani. S-a raportat că extractele de rădăcină de ginseng coreean (Panax ginseng C.A. Meyer) prezintă activitate anti-adipogenă în adipocitele 3T3-L1; s-a constatat că aceste extracte conțin cantități cuantificabile de ginsenozide, cum ar fi ginsenozida Rg1, Re, Rf, Rb1 și Rc [8]. Cu toate acestea, părțile aeriene ale ginsengului nu au fost utilizate în mod eficient. Studiile anterioare au raportat că frunza de ginseng este bogată în compuși bioactivi și că conținutul unor ginsenozide din acesta este mai mare decât cel găsit în rădăcini [9]. În plus, s-a demonstrat că extracte din tulpină, frunză și boabe de ginseng american (Panax quinquefolium) prezintă activități anti-obezitate in vivo [10,11,12].

Un studiu anterior a demonstrat că frunzele mature (în vârstă) de ginseng american au un conținut mai mare de ginsenozide totale decât cel din frunzele tinere [13]. Frunzele vechi de o lună conțineau un conținut total de ginsenoside de 1,33-2,64 g/100 g, în timp ce frunzele vechi de patru luni conțineau un conținut total de ginsenozide de 4,14-5,58 g/100 g.

Cu toate acestea, există o lipsă de rapoarte privind efectele farmacologice ale părților aeriene ale ginsengului coreean în comparație cu ginsengul american, iar efectele anti-obezitate ale extractelor de frunze din ginsengul coreean nu au fost încă investigate.

Prin urmare, am examinat efectele anti-obezitate ale extractelor de frunze din ginsengul coreean într-un șobolan obez indus de o dietă bogată în grăsimi (HFD). În plus, efectele extractelor de frunze vechi și tinere au fost comparate. Rezultatele au arătat că extractele din frunze de ginseng coreean au efecte anti-obezitate in vivo și in vitro; cu toate acestea, mecanismele de acțiune au fost presupuse a fi diferite pentru extracte.

2. Materiale și metode

2.1. Pregătirea extractelor de frunze de ginseng

Extractele de frunze de ginseng (în vârstă de trei ani) au fost furnizate de serviciile de cercetare și extindere agricolă din Gyeongsangbuk-do (Coreea). În acest studiu, extractele de frunze tinere și bătrâne sunt denumite extract de frunze verzi (GL) și respectiv frunze uscate (DL). Două tipuri diferite de frunze au fost colectate și uscate la 50 ° C timp de 24 de ore. Apoi, probele de frunze au fost extrase cu apă distilată (un raport de probă uscată/apă de 10: 3 (greutate/greutate)) la 90 ° C timp de 72 ore și depozitate la 4 ° C pentru utilizare ulterioară.

2.2. Animale

Șobolani masculi Sprague-Dawley (SD) de cinci săptămâni au fost cumpărați de la Hyochang Science (Coreea). După o perioadă de adaptare de o săptămână, animalele au fost repartizate aleatoriu în următoarele grupuri, fiecare format din șapte animale: (1) dieta normală (ND); (2) HFD; (3) suplimentarea HFD + GL (3,3 mg/kg); și (4) suplimentarea cu HFD + DL (3,3 mg/kg). Compoziția HFD este prezentată în Tabelul S1 și toți șobolanii au fost menținuți într-un ciclu de lumină-întuneric de 12 ore. GL și DL au fost administrate oral în fiecare zi a perioadei experimentale. După finalizarea tratamentului, s-au colectat probe de sânge și țesuturi adipoase pentru analize ulterioare. Toate protocoalele care implică experimente pe animale au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire a animalelor de la Universitatea Națională Kyungpook (numărul de aprobare: KNU 2017-13 și data aprobării: 2 februarie 2017).

2.3. Analiza biochimică

În ultima zi a experimentelor, sângele a fost colectat în tuburi de colectare a serului și centrifugat la 3000 rpm timp de 15 minute pentru a obține supernatantul plasmatic. Nivelurile markerului plasmatic pentru nefrotoxicitate, test de hepatotoxicitate și profilarea lipidelor au fost determinate folosind un analizor automat.

2.4. Cultura și diferențierea celulară

Celulele de preadipocite de șoarece 3T3-L1 au fost achiziționate de la Korea Cell Line Bank (KCLB, Seoul, Coreea) și cultivate în mediul Eagle modificat de Dulbecco (DMEM; GIBCO, Grand Island, NY, SUA) suplimentat cu 10% ser bovin de vițel; GIBCO ). Pentru a induce diferențierea, adipocitele 3T3-L1 au fost cultivate până la post-confluență (denumite Ziua 0) timp de 2 zile și mediul a fost înlocuit cu DMEM conținând 10% ser fetal bovin (FBS; GIBCO) și soluție MDI (compoziție: 0,5 mM IBMX, 1 μM DEXA, 0,125 mM indometacină și 10 μg/ml insulină) timp de 2 zile. Ulterior, celulele au fost menținute în mediu suplimentat cu 10% FBS și 10 μg/ml insulină timp de 4 zile. Pentru a examina efectele anti-adipogene ale extractelor, celulele supuse diferențierii au fost tratate cu GL și DL în toate etapele diferențierii.

2.5. Test de colorare roșie cu ulei și trigliceridă (TG)

Colorarea cu roșu uleios (ORO) și testul TG au fost efectuate așa cum s-a descris anterior [14]. Pe scurt, celulele care au fost supuse diferențierii în adipocite mature au fost spălate, fixate și colorate cu soluție Oil Red O pentru a detecta picăturile de lipide. Toate imaginile au fost obținute folosind un microscop (Leica, Wetzlar, Germania). Testul TG a fost efectuat în conformitate cu instrucțiunile producătorului.

2.6. Viabilitatea celulară (testul MTT)

Preadipocitele 3T3-L1 au fost însămânțate în plăci cu 96 de godeuri și tratate cu GL sau DL la o concentrație de 0,15 sau 0,3 mg/ml timp de 48 de ore. Pentru a examina efectul GL sau DL asupra adipocitelor mature, celulele 3T3-L1 au fost însămânțate și tratate cu MDI și cu GL sau DL pentru întreaga perioadă de diferențiere. La sfârșitul tratamentului, mediul a fost îndepărtat și înlocuit cu soluție MTT (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolium) și incubat timp de 3 ore la 37 ° C. După incubare, formazanul precipitat a fost dizolvat cu alcool izopropilic (Duksan Pure Chemicals, Seoul, Coreea).

2.7. Reacție în lanț cu transcripție inversă-polimerază (RT-PCR)

ARN a fost izolat utilizând reactiv RNAiso Plus (TaKaRa Bio, Shiga, Japonia). ADN-ul complementar a fost sintetizat folosind kitul de reactivi Prime Script RT (TaKaRa Bio) în conformitate cu protocolul producătorului. Au fost proiectați primerii specifici pentru șobolani și șoareci, care sunt prezentați în Tabelul S2. Expresia ARNm în adipocitele 3T3-L1 și țesuturile adipoase epididimale a fost normalizată la cea a β-actinei și respectiv a GAPDH, utilizând software-ul ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, SUA).

2.8. Western Blot

Proteina totală a fost extrasă folosind tampon de liză PRO-PREP (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Coreea), care conține inhibitori de fosfatază și un cocktail de inhibitori de protează. Lizatele au fost centrifugate la 13.000 rpm timp de 15 minute. Probele de proteine ​​au fost separate prin SDS-PAGE, transferate pe membrane de nitroceluloză, blocate folosind lapte degresat fără grăsimi 5% și incubate peste noapte la 4 ° C cu anticorpi împotriva PPARγ, LPL, aP2, adiponectină (Abcam, Cambridge, Marea Britanie), C/EBPα (Cell Signaling Technology Beverly, MA, SUA) și β-actină (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, SUA).

2.9. Analize statistice

Datele sunt exprimate ca medie ± SD. Comparațiile statistice au fost efectuate utilizând ANOVA unidirecțional. Valorile lui p Figura 1 A). Masa țesuturilor adipoase abdominale și epididimale a scăzut semnificativ la șobolanii HFD-GL și HFD-DL în comparație cu cea a șobolanilor hrăniți cu HFD (Figura 1 B). În plus, șobolanii HFD-GL și HFD-DL au prezentat un raport de eficiență alimentară redus, dar diferențele nu au fost semnificative (Figura 1 C).