Zhaojie Meng 1.2 *, Yang Yu 1.3 *, Yining Zhang 4, Xuehan Yang 1, Xiaoyan Lv 5, Fengying Guan 1, Grant M. Hatch 6, Ming Zhang 1, Li Chen 1

foarte

1. Departamentul de farmacologie, Colegiul de științe medicale de bază, Universitatea Jilin, Changchun, Jilin, China.
2. Divizia de Științe Biomedice, Facultatea de Medicină, Universitatea din California, Riverside, CA, Statele Unite ale Americii.
3. Laborator cheie de biologie celulară medicală, Institutul de medicină translațională, Universitatea de medicină din China, Shenyang, provincia Liaoning, China.
4. Primul spital, Universitatea Jilin, Changchun, China.
5. Al doilea spital, Universitatea Jilin, Changchun, China.
6. Departamentul de farmacologie și terapie, Centrul de cercetare și tratament al aterosclerozei, DREAM Manitoba Institute of Child Health, Universitatea din Manitoba, Winnipeg, Manitoba, Canada.
* Acești autori contribuie în mod egal la acest studiu.

Citare:
Meng Z, Yu Y, Zhang Y, Yang X, Lv X, Guan F, Hatch GM, Zhang M, Chen L. Formularea de berberină foarte biodisponibilă îmbunătățește rezistența la insulină mediată de receptorul glucocorticoidului prin intermediul reducerea asocierii receptorului glucocorticoid cu fosfatidilinozitol-3-kinaza. Int J Biol Sci 2020; 16 (14): 2527-2541. doi: 10.7150/ijbs.39508. Disponibil de pe https://www.ijbs.com/v16p2527.htm

Cuvinte cheie: Formulare de berberină foarte biodisponibilă, dispersie solidă Huang-Gui, rezistență la insulină, fosfatidilinozitol 3-kinază, receptor glucocorticoid

Berberina (BBR) este un alcaloid natural al plantei izolat din planta chineză Rhizoma coptidis și este frecvent utilizat pentru tratamentul diareei. Multe studii au arătat că BBR prezintă proprietăți hipoglicemiante și ameliorează rezistența la insulină. Am arătat anterior că BBR a inhibat gluconeogeneza hepatică prin scăderea expresiei PEPCK prin activarea proteinei kinazei activate cu 5'-adenozină monofosfat (AMPK) [13]. În plus, s-a demonstrat că BBR reduce rezistența la insulină mediată de dexametazona (DEX) în celulele theca in vitro [14]. Prin urmare, BBR poate regla calea de semnalizare a insulinei în mușchiul scheletic prin calea GC/GR.

Biodisponibilitatea scăzută și mecanismul nedefinitiv al acțiunii BBR limitează aplicarea sa clinică ca medicament antidiabetic. Am arătat anterior că dispersia solidă Huang-Gui (HGSD), un sistem de livrare a medicamentelor ternare cu BBR, caprat de sodiu (SC, un potențial de absorbție intestinală) și PEG6000, preparat prin tehnologia de dispersie solidă, a îmbunătățit dramatic o creștere in situ perfuzie intestinală și o creștere de 5 ori in vivo biodisponibilitatea BBR [15, 16]. S-a confirmat că berberina este principalul ingredient activ în HGSD, fără nicio modificare evidentă după tratamentul cu SC [17]. Tratamentul HGSD al dietei bogate în grăsimi și al șobolanilor diabetici induși de STZ a dus la un efect hipoglicemiant semnificativ îmbunătățit comparativ cu BBR singur [15]. În studiul de față, am utilizat trei modele distincte de rezistență la insulină (dietă bogată în grăsimi, HFD) hrăniți cu șobolani tratați cu streptozotocină (STZ), celule C2C12 rezistente la insulină și șoareci tratați cu dexametazonă (DEX) pentru a examina dacă rezistența la insulină este mediat de asocierea GR cu PI3K și dacă tratamentul cu HGSD atenuează rezistența la insulină în aceste modele.

Reactivi chimici

Experimente pe animale

Șobolani Wistar masculi (200-220 g) și șoareci ICR (18-22 g) au fost obținuți de la Facilitatea Experimentală de Deținere a Animalelor de la Universitatea Jilin (numărul certificatului: scxk2013-0003). Toate animalele au fost adăpostite în cuști standard din polipropilenă (trei șobolani sau șoareci pe cușcă) și menținute într-o cameră de reproducere controlată de mediu (temperatură: 20 ± 2 ° C, umiditate: 60 ± 5%, 12 h ciclu lumină/întuneric). Animalele au fost aclimatizate timp de cel puțin 5 zile și apoi prelucrate pentru diferite experimente.

Pregătirea dispersiei solide Huang-Gui

HGSD a fost preparat cu BBR (ingredientul activ), SC și PEG6000 urmând raportul în greutate de 1: 1: 6 prin evaporarea solventului așa cum s-a descris anterior [15].

In vivo modele animale și administrarea medicamentelor

Modelul de șoarece rezistent la insulină a fost stabilit prin injectarea de DEX (i.p.) la o doză de 2 mg/kg timp de 7 zile consecutive, după cum s-a descris anterior [19, 20]. Șoarecii din grupul de control au fost injectați (i.p.) cu soluție salină într-un volum egal de 5 ml/kg. Șoarecii au fost împărțiți în 4 grupuri și tratați cu medicamentele respective prin administrare intragastrică (ig): (1) Grup de control (șoareci de control care primesc soluție salină), (2) Grup model (șoareci ai modelului de rezistență la insulină care primesc un volum de salină corespunzător ), (3) grup de tratament BBR (șoareci rezistenți la insulină din grupul model care au primit 150 mg/kg BBR), (4) grup de tratament HGSD (șoareci rezistenți la insulină din grupul model care au primit HGSD la o doză echivalentă de 150 mg/kg BBR )). Șoarecii au fost apoi sacrificați după 7 zile.

Testul de toleranță intraperitoneală la glucoză (IPGTT) sau testul de toleranță orală la glucoză (OGTT) a fost efectuat la sfârșitul administrării medicamentului in vivo modele. După un post de 12 ore, s-a administrat glucoză (2 g/kg) (i.p. la șobolani și de exemplu la șoareci). Sângele a fost colectat din vena caudală la 0, 30, 60, 90 și 120 de minute după administrarea glucozei, iar concentrația de glucoză din probele de ser a fost determinată folosind setul de glucoză oxidază.

Țesutul a fost colectat de la animale după post de 12 ore la sfârșitul fiecărui studiu. Șobolanii au fost anesteziați cu 20% uretan (100 mg/kg), iar probele de sânge au fost obținute din aorta abdominală. Probele de sânge de la șoareci au fost colectate din vena fundului. Probele de sânge au fost lăsate să se coaguleze timp de 30 min la 4 ° C și centrifugate (3.500 × g, 10 min, 4 ° C). Supernatantul a fost utilizat pentru a măsura glucoza și insulina. Glicemia a fost măsurată folosind trusa de glucoză oxidază. Insulina a fost măsurată printr-un test radioimunologic. Mușchiul scheletic al animalelor a fost apoi colectat după perfuzie și sacrificiu pentru evaluarea proteinelor. Nivelurile de proteine ​​specifice au fost determinate prin analiza Western blot.

Prepararea serului condiționat HGSD

Serul condiționat HGSD a fost preparat așa cum s-a descris anterior [21]. Pe scurt, 18 șobolani au fost împărțiți în mod aleatoriu în trei grupuri și administrați cu gavaje de HGSD, vehicul singur sau soluție salină. Șobolanii au fost hrăniți fie cu 3 ml soluție salină de două ori pe zi timp de 3 zile, fie cu HGSD de două ori pe zi timp de 3 zile la o doză echivalentă de 1000 mg/kg BBR, care a fost estimată de 10 ori doza administrată șobolanilor diabetici din studiul nostru anterior [22] . La 30 de minute după administrare în a treia zi, sângele a fost obținut din aorta șobolanilor în condiții sterile și a fost lăsat să se coaguleze la 25 ° C timp de 4 ore. Serul a fost separat prin centrifugare la 3.000 rpm timp de 20 min. După filtrare printr-o membrană de acetat de celuloză de 0,45 μm de două ori, serul a fost incubat într-o baie de apă de 56 ° C timp de 30 de minute și apoi depozitat la -80 ° C până la utilizare. Concentrația de BBR în serul condiționat HGSD detectată prin HPLC a fost de 28,46 ± 3,77 μM.

Cultura, diferențierea și identificarea celulelor C2C12

Celulele mioblaste C2C12 au fost menținute în condiții de subconfluenți în medii de creștere conținând DMEM cu 4,5 g/L glucoză, 100 U/ml penicilină, 100 μg/ml streptomicină și 10% ser fetal bovin (Gibco BRL, Grand Island, NY, SUA). Toate celulele au fost crescute într-un incubator umidificat la 37 ° C cu oxigen ambiental și 5% CO2.

Confluența de 80% a fost diferențiată prin incubare cu 2% ser de cal (HyClone, Logan City, Utah, SUA). Celulele au fost menținute timp de 3-7 zile pentru a obține miotuburi. După 5 zile, miotuburile au fost incubate cu anticorp (1: 200) la lanțul greu de miozină (MF20, Santa Cruz, SUA) și nuclee colorate cu Hoechst 33342 (1 pg/mL). Imaginile au fost obținute folosind un microscop de imunofluorescență.

Viabilitatea celulei

Viabilitatea celulară a fost determinată prin testul MTT în plăci de cultură tisulară cu 96 de godeuri, așa cum s-a descris anterior [23]. După tratament, mediul de cultură a fost îndepărtat din godeuri și 200 μL de reactiv MTT (Sigma) la o concentrație de 1 mg/ml în PBS au fost adăugați la fiecare godeu. După 4 ore de incubație la 37 ° C, reactivul MTT în PBS a fost îndepărtat și produsul formazan de culoare albastră a fost solubilizat în 0,15 ml de DMSO timp de 20 min. Absorbanța colorantului transformat a fost măsurată la o lungime de undă de 570 nm folosind un spectrofotometru.

Modelul de rezistență la insulină celulară C2C12 și tratamentul medicamentos

După diferențiere timp de 2 zile, celulele C2Cl2 au fost incubate în absența sau prezența insulinei 100 nM timp de 72 de ore pentru a induce rezistența la insulină. Celulele au fost apoi împărțite aleatoriu în grupuri: (1) Celule de control non-rezistente la insulină tratate +/- insulină, (2) celule rezistente la insulină tratate +/- insulină, (3) celule rezistente la insulină tratate +/- insulină și tratate cu 5 µM BBR, (4) celule rezistente la insulină tratate +/- insulină și tratate cu 5 μM ser condiționat HGSD, (5) celule rezistente la insulină tratate +/- insulină și tratate cu ser vehicul de control, (6) insulină- celule rezistente tratate +/- insulină și tratate cu ser alb singur. În unele experimente, celulele rezistente la insulină tratate cu +/- insulină au fost tratate cu 1 μM RU486. Toate medicamentele au fost adăugate cu 12 ore înainte de sfârșitul experimentului.

Consumul de glucoză și absorbția glucozei

Consumul de glucoză a fost măsurat așa cum s-a descris anterior [24, 25]. Celulele de mai sus au fost incubate în DMEM fără ser cu conținut scăzut de glucoză (5,5 mM) peste noapte. Celulele au fost apoi tratate cu insulină (100 nM) și medicamentele în DMEM fără ser proaspăt, cu conținut scăzut de glucoză (5,5 mM). După 12 ore de incubație, mediul a fost îndepărtat și concentrația de glucoză în mediu a fost măsurată folosind setul de glucoză oxidază. În unele experimente, celulele din fiecare grup au fost incubate cu insulină (100 nM) cu 30 de minute înainte de sfârșitul experimentului.

După diferențiere, celulele de mai sus au fost spălate de 3 ori cu KRB conținând 0,5% BSA la intervale de 40 min peste 2 ore la 37 ° C și apoi preincubate cu medicamente și insulină (100 nM) timp de 3 ore. Ulterior, celulele au fost incubate în 200 μM 2-NBD-glucoză în PBS pentru încă 30 de minute și apoi spălate de 3 ori cu PBS răcit cu gheață. Intensitatea fluorescenței celulelor a fost determinată folosind o microplacă de fluorescență. În unele experimente, celulele din fiecare grup au fost incubate cu insulină (100 nM) timp de 10 minute.

Translocare GLUT4

Densitatea suprafeței celulei GLUT4 a fost măsurată în miotuburi C2C12 fixe și nepermeabilizate utilizând un test de absorbție cuplat cu anticorpi, așa cum a fost descris anterior [26]. Pe scurt, după ce au fost tratate așa cum s-a descris mai sus, celulele au fost epuizate cu ser timp de 2 ore și apoi au fost incubate plus sau minus insulină (100 nM) timp de 10 minute. Celulele au fost apoi spălate de două ori cu PBS rece cu gheață, fixate cu 3% (v/v) paraformaldehidă la 4 ° C timp de 10 min și apoi incubate la temperatura camerei pentru încă 20 min. Toate etapele ulterioare au fost efectuate la temperatura camerei. Celulele au fost apoi incubate cu glicină 0,1 M în PBS timp de 10 min și apoi blocate cu lapte degresat 5% (g/v) în PBS timp de 10 min. Incubarea cu anticorp policlonal anti-GLUT4myc (1: 250) în lapte 5% în PBS timp de 1 oră a fost urmată de cinci spălări cu PBS și incubare cu IgG de capră anti-iepure conjugată cu HRP (1: 2000) timp de 1 oră. Celulele au fost spălate extensiv cu PBS și incubate cu 1 ml/godeu de 0,4 mg/ml reactiv dihidroclorură de o-fenilendiamină timp de până la 20 min. Reacția a fost oprită prin adăugarea a 0,25 ml de HCl 3 N. Supernatantul a fost colectat și absorbanța optică a fost măsurată la 492 nm. Absorbanța de fond obținută din godeurile de miotub C2C12 de tip sălbatic a fost scăzută din toate celelalte valori.

Analiza Western blot

Țesutul muscular scheletic (50 mg) și celulele C2C12 au fost omogenizate la 4 ° C în 1 ml sau, respectiv, 500 μL de tampon TES rece cu gheață (20 mM Tris-HCI, pH 7,4, conținând 250 mM zaharoză, 1 mM EDTA, 1 fluorură de fenilmetilsulfonil mM, 0,01 mM leupeptină și 5 μg/ml aprotinină). Lizatul a fost centrifugat la 10.000 rpm timp de 10 minute la 4 ° C. Alicote ale supernatantului au fost îndepărtate pentru analiza proteinelor prin metoda Bradford (Bio-Rad). Probele au fost denaturate prin fierbere timp de 5 minute și separate prin electroforeză pe gel de poliacrilamidă SDS 10% și apoi electroblotate pe membrane de difluorură de poliviniliden (Bio-Rad) la 4 ° C. După blocarea cu 5% (greutate/volum) lapte degresat timp de 2 ore la temperatura camerei, membranele au fost apoi incubate cu anticorpii primari respectivi cu agitare ușoară peste noapte la 4 ° C. Membranele au fost spălate de 3 ori timp de 10 min fiecare cu 15 ml TBST (10 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI și 0,1% (v/v) Tween-20) și apoi incubate cu anticorp secundar (1: 2000 peroxidază de hrean conjugată capră anti-iepure sau IgG de șoarece) la temperatura camerei timp de 2 ore. Benzile de proteine ​​au fost vizualizate cu ECL pe un film cu raze X și apoi scanate și cuantificate utilizând software-ul de analiză a imaginii Quantity One (Bio-Rad).

Măsurarea corticosteronului specific mușchilor scheletici

Cele 50 mg de țesut muscular scheletic au fost omogenizate și apoi sonicate în 500 μL de PBS rece. După centrifugare la 5.000 × g timp de 10 minute, o alicotă a supernatantului a fost îndepărtată pentru a determina nivelurile de corticosteron folosind kitul de imunotest enzimatic corticosteron (Nr. Catalog KGE009, Sistem R&D) conform instrucțiunilor producătorului.

Experimente de co-imunoprecipitare

50 mg de țesut muscular scheletic au fost omogenizate timp de 5 minute în Nonidet-P40 rece 1%. Amestecul a fost ținut pe gheață timp de 60 de minute înainte de centrifugare la 10.000 × g timp de 10 minute la 4 ° C. Supernatantul (alicote de 2 mg proteine) a fost incubat cu 4 μg anticorp anti-PI3K peste noapte la 4 ° C. Se adaugă apoi mărgele de agaroză de proteină A/G (25 μL) (Santa Cruz Biotechnology Inc.) și se incubează timp de 2 ore la 4 ° C. Imunoprecipitații au fost spălați de 3 ori cu tampon A și apoi omogenizați la 4 ° C în tampon TES rece cu gheață, iar nivelurile pIRS1 (1: 1000), GR (1: 1000) și GRα (1: 1000) au fost determinate prin Western blot analiza ca mai sus.

analize statistice

Date (n > 6) sunt exprimate ca medie ± eroare standard (SE). Date (n ≤ 6) sunt exprimate ca medie ± deviație standard (SD). Semnificația statistică a fost determinată cu un test Student t cu două cozi sau ANOVA unidirecțional sau bidirecțional, urmat de un test post hoc Tukey. p Tyr632, Total-IRS1, pAKT Ser473, Total-AKT, Membranele GLUT4 și GAPDH la șobolani martor și diabetici și șobolani diabetici tratați cu BBR (BBR 100 mg/kg) sau HGSD (25 mg/kg) sau HGSD (100 mg/kg) ))). Niveluri relative ale membranei GLUT4 (B), pIRS1/IRS1 (C), PACT/ACT (D) și corticosteronul muscular scheletal (E). n = 3-6. Datele sunt prezentate ca medii ± SD a două sau trei rezultate independente. * p

Primit 2019-8-20
Acceptat 2020-7-3
Publicat 2020-7-19