Medicină moleculară

Acest articol face parte din subiectul de cercetare

Mecanisme intracelulare ale procesării α-sinucleinei Vizualizați toate cele 11 articole

Editat de
Câștigător Beate

Universitatea din Erlangen Nürnberg, Germania

Revizuite de
Arun Upadhyay

Școala de medicină Feinberg, Universitatea Northwestern, Statele Unite

Christian Behl

Universitatea Johannes Gutenberg din Mainz, Germania

Afilierile editorului și ale recenzenților sunt cele mai recente oferite în profilurile lor de cercetare Loop și este posibil să nu reflecte situația lor în momentul examinării.

promovează

  • Descărcați articolul
    • Descărcați PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Suplimentar
      Material
  • Citarea exportului
    • Notă finală
    • Manager de referință
    • Fișier TEXT simplu
    • BibTex
DISTRIBUIE PE

Scurt raport de cercetare ARTICOL

  • 1 Departamentul de Medicină de Laborator și Patobiologie, Universitatea din Toronto, Toronto, ON, Canada
  • 2 Divizia de Genetică și Dezvoltare, Krembil Research Institute, Toronto, ON, Canada
  • 3 Divizia de Neurologie, Departamentul de Medicină, Universitatea din Toronto, Toronto, ON, Canada
  • 4 Divizia de Neurochirurgie, Departamentul de Chirurgie, Universitatea din Toronto, Toronto, ON, Canada

Chaperonele moleculare sunt esențiale pentru menținerea proteostazei intracelulare și s-a demonstrat că au un rol protector împotriva toxicității mediată de alfa-sinucleină. Proteinele co-chaperone reglează activitatea chaperonelor moleculare și conectează rețeaua chaperonei la căile de degradare a proteinelor și de moarte celulară. Atanogenul 5 asociat Bcl-2 (BAG5) este o co-chaperonă care modulează proteostaza prin inhibarea activității proteinei de șoc termic 70 (Hsp70) și a mai multor ligase de ubiquitină E3, rezultând o neurodegenerare îmbunătățită în modelele bolii Parkinson (PD). Aici identificăm o interacțiune nouă între BAG5 și p62/sequestozom-1 (SQSTM1), sugerând că BAG5 poate lega rețeaua chaperonei de degradarea proteinei mediată de autofagie. Am constatat că BAG5 a îmbunătățit formarea oligomerilor alfa-sinucleinici patogeni și a reglementat nivelurile și distribuția subcelulară a p62. Aceste rezultate extind rolul BAG5 în procesarea alfa-sinucleinei și proteostaza intracelulară.

Introducere

Boala Parkinson (PD) este o boală neurodegenerativă incurabilă care afectează 1-2% din populația cu vârsta peste 60 de ani (Kalia și Lang, 2015). PD se caracterizează printr-o pierdere semnificativă a neuronilor dopaminergici în substanța nigra pars compacta, precum și prin prezența corpurilor Lewy (LB), incluziuni intracelulare cuprinse în mare parte din alfa-sinucleină agregată (Kalia și colab., 2013). În timp ce mecanismele exacte sunt încă necunoscute, se crede cu tărie că speciile oligomerice de alfa-sinucleină contribuie la moartea celulară observată în PD și alte boli asociate cu LB, inclusiv demență cu LB, atrofie a sistemului multiplu și boala Alzheimer (Kim și colab., 2014).

Diversi factori modulează procesarea și agregarea alfa-sinucleinei, inclusiv chaperonele moleculare. Chaperonele servesc la împăturirea proteinelor născute, a replierii proteinelor nepliate sau a proteinelor direcționate nepliate pentru degradare fie prin sistemul ubiquitin-proteazom (UPS), fie prin calea lizozomului autofagic (ALP) (Friesen și colab., 2017). Proteina de șoc termic 70 (Hsp70) este o chaperonă care s-a dovedit a fi implicată în procesarea alfa-sinucleinei și se leagă preferențial de fibrilele alfa-sinucleinei (Aprile și colab., 2017). Hsp70 poate reduce nivelurile de alfa-sinucleină greșite și agregate și poate proteja împotriva toxicității mediate de alfa-sinucleină (Auluck și colab., 2002; Klucken și colab., 2004; Dedmon și colab., 2005; Flower și colab., 2005; Huang și colab., 2006).

BAG5 este unic printre co-chaperonii BAG prin faptul că conține cinci domenii BAG, mai degrabă decât unul. BAG5 interacționează cu Hsp70 și îi inhibă activitatea de pliere (Kalia și colab., 2004). BAG5 interacționează și inhibă activitățile ligazei ubiquitinei E3 ale parkinului și proteinei C-terminale Hsp70 care interacționează (CHIP) (Kalia și colab., 2004, 2011). Inhibarea Hsp70, parkin și CHIP de către BAG5 perturbă proteostaza, mitofagia (De Snoo și colab., 2019) și promovează formarea oligomerilor alfa-sinucleinici, precum și a altor agregate proteice, care contribuie la moartea neuronală (Kalia et. al., 2013). În concordanță cu aceste constatări, s-a constatat că BAG5 promovează moartea neuronului dopaminergic în substanța neagră la modelele de rozătoare ale PD (Kalia și colab., 2004) și interacționează cu alte proteine ​​relevante pentru PD, inclusiv LRRK2, PINK1 și DJ-1 (Beilina și colab. ., 2014; Wang și colab., 2014; Qin și colab., 2017; Tan și colab., 2019; De Snoo și colab., 2019).

Având în vedere că BAG5 reglează negativ mecanismele multiple de protecție a celulelor care implică prelucrarea intracelulară a alfa-sinucleinei, am dorit să investigăm în continuare căile moleculare în care poate funcționa BAG5 pentru a avansa înțelegerea BAG5 ca potențial modulator al sinucleinopatiilor. Prin urmare, am folosit un ecran de spectroscopie de masă pentru a găsi potențiale proteine ​​BAG5 care interacționează. Aici identificăm și validăm o interacțiune funcțională între BAG5 și p62, o proteină cu funcții importante în ALP (Gamerdinger și colab., 2009) prezentată anterior pentru a proteja împotriva patologiei alfa-sinucleinei (Tanji și colab., 2015). Ulterior, evaluăm efectele BAG5 și p62 asupra nivelurilor oligomerilor de alfa-sinucleină și constatăm că BAG5 poate îmbunătăți formarea oligomerilor, precum și regla nivelul p62 și distribuția subcelulară.

Materiale și metode

Cultură de celule

Celulele H4 și HEK293 au fost cultivate în mediul Eagle modificat al lui Dulbecco (DMEM, Gibco) suplimentat cu 10% ser fetal bovin (Gibco), 1% antibiotic/antimicotic (Gibco) și incubate la 37 ° C cu 5% CO2. Celulele H4 au fost cultivate exclusiv pe plăci de celule + (Sarstedt, Inc.).

Generarea de linii de celule stabile

Celulele neurogliomului H4 de tip sălbatic au fost transfectate stabil cu plasmide GFP, GFP-BAG5 sau GFP-BAG5DARA utilizând Lipofectamina 2000 (Thermo Fisher Scientific) conform protocolului producătorului. Plasmidele GFP-BAG5 și GFP-BAG5DARA au fost inițial dezvoltate de Kalia și colab. (2004) prin inserarea BAG5 și BAG5DARA în plasmida pEGFP-C1 (Clontech, U55763), care conține o etichetă GFP N-terminală și o genă de rezistență eucariotă G418. La 24 ore după transfecție, celulele au fost incubate în medii de selecție conținând 700 μg/ml G418 timp de 14 zile. Coloniile celulare care au atins o dimensiune de 100-200 celule au fost evaluate pentru încorporarea GFP-transgenă folosind microscopia fluorescentă. Acele colonii care exprimă în mod stabil transgenul au fost transferate pe plăci cu 96 de godeuri și propagate pentru caracterizarea ulterioară a expresiei transgenice.

Imunoprecipitarea proteinelor GFP-Fusion

Liniile celulare H4 GFP, GFP-BAG5 și GFP-BAG5DARA au fost placate în plăci de 10 cm. La 24 de ore după placare, celulele au fost spălate cu 5 ml soluție salină tamponată cu fosfat Dulbecco (PBS) fără calciu sau magneziu și lizate în tampon de testare radioimunoprecipitare (RIPA) compus din 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,5% deoxicolat de sodiu, 1% Triton X -100 și cocktail inhibitor de protează (cOmplete TM, Roche). Pentru imunoprecipitare, 1 mg de lizat proteic din fiecare linie celulară a fost combinat cu 25 μL de suspensie pre-spălată cu capcane GFP (Chromotek, gta-10) și rotită la 4 ° C timp de 2 ore. Mărgelele au fost ulterior spălate de trei ori cu 1 ml de tampon RIPA, iar probele de proteine ​​au fost transportate la SPARC BioCentre Molecular Analysis, The Hospital for Sick Children, Toronto, ON, Canada pentru analiza spectrometriei de masă.

Spectrometrie de masa

Peptidele au fost introduse prin nanoelectrospray într-un spectrometru de masă hibrid LTQ-Velos-Orbitrap Elite (Thermo Fisher Scientific). Metoda instrumentului a constat dintr-o scanare completă MS (400-1500 m/z) în analizorul de masă Orbitrap, o țintă automată de control a câștigului de 1e6 cu o injecție de ioni maximă de 100 ms, un microscan și o rezoluție de 240.000. Zece scanări MS/MS dependente de date au fost efectuate în capcana ionică liniară folosind cei mai intensi zece ioni la 35% energie de coliziune normalizată. Scanările MS și MS/MS au fost obținute în mod paralel. În modul MS/MS, obiectivele automate de control al câștigului au fost 30.000, cu un timp maxim de injecție de ioni de 50 ms. A fost necesară o intensitate ionică minimă de 1000 pentru a declanșa un spectru MS/MS. Energia de coliziune normalizată a fost setată la 35. Excluderea dinamică a fost aplicată folosind o listă de excludere maximă de 500 cu un număr de repetări cu o durată de repetare de 30 s și o durată de excludere de 15 s.

Spectrele de masă tandem au fost extrase, starea de încărcare deconvoluită și deizotopată de Xcalibur versiunea 2.2. Toate probele de MS/MS au fost analizate folosind PEAKS Studio [Bioinformatics Solutions, Inc., Waterloo, ON, Canada; versiunea 8.0 (21.06.2016)] și X! Tandem [The GPM 1; versiunea CYCLONE (2010.12.01.1)]. Datele au fost căutate cu o toleranță de masă a ionului fragment de 0,60 Da și o toleranță de ion părinte de 10,0 PPM.

Schela (versiunea Scaffold_4.8.1, Proteome Software, Inc., Portland, OR, Statele Unite) a fost utilizată pentru validarea identificărilor de peptide și proteine ​​pe bază de MS/MS. Identificările peptidice au fost acceptate dacă ar putea fi stabilite cu o probabilitate mai mare de 95,0%. Probabilități de peptide de la X! Tandem-ul a fost atribuit de algoritmul Scaffold Local FDR. Probabilitățile de peptide din PEAKS Studio au fost atribuite de algoritmul Peptide Prophet (Keller și colab., 2002) cu corecția delta-masă Scaffold. Identificările proteinelor au fost acceptate dacă ar putea fi stabilite cu o probabilitate mai mare de 95,0% și ar conține cel puțin cinci peptide identificate. Probabilitățile proteinelor au fost atribuite de algoritmul Protein Prophet (Nesvizhskii și colab., 2003). Proteinele care conțin peptide similare și nu au putut fi diferențiate doar pe baza analizei MS/MS au fost grupate pentru a satisface principiile parsimoniului. Datele proteomice de spectrometrie de masă au fost depuse la ProteomeXchange Consortium prin intermediul depozitului partener PRIDE (Perez-Riverol și colab., 2019) cu identificatorul setului de date PXD019473 și 10.6019/PXD019473.

Teste GST-Pull-Down

Lungimea completă p62-HA a fost un cadou de la Qing Zhong (plasmida Addgene # 28027) și construcții de ștergere pentru: (1) „p62-N-HA” (aa1-102 inclusiv domeniul PB1) și (2) „p62-C-HA ”[Aa103-440 incluzând regiunea de interacțiune LC3 (LIR) și domeniile asociate ubiquitinei (UBA)] au fost generate folosind Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit (NEB) conform protocolului producătorului.

S-au generat proteine ​​recombinate GST, GST-BAG5 și GST-BAG5DARA Escherichia coli folosind pGEX, pDEST-15-BAG5 și pDEST-15-BAG5DARA (sistem de clonare Gateway, Thermo Fisher Scientific), respectiv. Proteinele recombinante au fost conjugate cu perle de Glutation Sefaroză 4B (GE Healthcare) prin rotirea proteinei recombinante cu suspensie de perle peste noapte la 4 ° C în PBS.

Celulele H4 au fost transfectate tranzitoriu cu p62-HA, p62-N-HA și p62-C-HA folosind Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific) conform protocolului producătorului și lizate cu tampon RIPA. 500 μg de lizat celular au fost incubate cu 10 μg de mărgele de proteine ​​de fuziune GST conjugate peste noapte la 4 ° C cu rotație. Mărgelele au fost spălate ulterior de trei ori cu 1 ml tampon RIPA și proteina a fost recuperată din suspensia de mărgele prin adăugarea a 50 μL tampon SDS-PAGE (cu beta-mercaptoetanol) și denaturarea termică a probei la 95 ° C timp de 10 minute.

Analiza de completare a proteinelor alfa-sinucleinice

Construcțiile luciferazei alfa-sinucleinei au fost generate așa cum s-a descris anterior (Outeiro și colab., 2008; Kalia și colab., 2011). syn-N și syn-C au fost transfectate în celule HEK293 în plăci cu 6 godeuri folosind Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific) conform protocolului producătorului. După 24 de ore după transfecție, celulele au fost răzuite în 600 μL de PBS rece și 100 μL de celule au fost transferate în triplicat pe o placă opacă cu 96 de godeuri cu fund plat (Grenier). Celelalte 300 μL de celule au fost salvate pentru analize Western blot. Placa a fost apoi analizată pe un cititor de plăci CLARIOstar (BMG Labtech), care a injectat 100 μL de 40 μM de celenterazină în fiecare godeu și a scuturat placa timp de 2 sec înainte de citirea semnalului bioluminiscent. Coelenterazina (303-5) a fost obținută de la NanoLight Technology.

Western Blotting

Imunocitochimie

Rezultate

Ecran pentru proteine ​​interacționale BAG5

figura 1. Ecran de spectrometrie de masă pentru proteine ​​care interacționează cu GFP-bcl-2 athanogene 5 (BAG5) și GFP-BAG5DARA. (A) Diagrama Venn care ilustrează proteinele identificate pe ecran pentru proteinele BAG5 care interacționează în celulele H4. Au fost identificate în total 198 de proteine, 89 s-au dovedit a fi complexe cu GFP-BAG5 (roșu), 43 cu GFP-BAG5DARA (GFP-DARA, albastru) și 66 cu ambele. (B) Lista primelor 10 proteine ​​identificate pentru a co-imunoprecipita cu GFP-BAG5 singur (sus) și a primelor 10 proteine ​​identificate pentru a co-imunoprecipita atât cu GFP-BAG5, cât și cu GFP-BAG5DARA (jos).

BAG5 interacționează cu p62

p62 a fost una dintre primele 10 proteine ​​identificate atât în ​​complexele IP BAG5, cât și în BAG5DARA (Figura 1B). p62 are funcții importante în autofagie, în timp ce funcția BAG5 în autofagie este slab înțeleasă și a fost investigată doar indirect (Beilina și colab., 2014). p62 este o proteină multidomenială (Figura 2A) care conține un domeniu N-terminal Phox și Bem1p (PB1) care susține capacitatea p62 de a se auto-asocia și facilitează formarea agregatelor de proteine. Domeniile CIR-LIR și UBA ale p62 îi permit să lege agregatele de proteine ​​ubiquitinate cu mașinile autofagice pentru degradarea ulterioară (Bitto și colab., 2014; Liu și colab., 2017).

Am confirmat mai întâi interacțiunea dintre BAG5 și p62 folosind teste pull-down GST în care GST-BAG5 sau GST-BAG5DARA recombinant a fost incubat cu lizate de celule H4 transfectate cu p62 (p62-HA) marcat cu HA. Atât GST-BAG5, cât și GST-BAG5DARA, dar nu GST singur, au tras p62-HA în jos (Figura 2B). În concordanță cu descoperirile noastre anterioare (Kalia și colab., 2004, 2011) și cu analiza noastră interactomică, Hsp70 nu a fost tras în jos de GST-BAG5DARA sau GST singur (Figura 2B), demonstrând că interacțiunea BAG5-p62 nu depinde de Hsp70. Pentru a confirma interacțiunea dintre p62 și BAG5 într-un test separat, am efectuat apoi IP-uri folosind lizați din celule H4 care exprimă p62-HA cu FLAG-BAG5 și am constatat că p62-HA co-imunoprecipitat cu FLAG-BAG5 (Figura 2C).

Pentru a determina ce regiune a p62 mediază interacțiunea p62-BAG5, am generat construcții de ștergere care conțin fie domeniul PB1 singur (p62-N-HA), fie domeniile LIR și UBA cu domeniul PB1 șters (p62-C-HA) pe care le-am utilizat în testele de tip pull-down (Figura 2A). Am constatat că GST-BAG5 a tras p62-C-HA în jos, dar nu și p62-N-HA (Figura 2D). Astfel, utilizând atât testele pull-down, cât și testele de co-imunoprecipitare, am confirmat interacțiunea BAG5-p62 care a fost identificată din ecranul MS. Mai mult, am stabilit că regiunea C-terminală a p62, care conține domeniile UBA și LIR, este suficientă pentru legarea la BAG5.

BAG5 Reglează nivelurile de proteine ​​p62

Pentru a investiga consecințele funcționale ale interacțiunii dintre BAG5 și p62, am investigat efectele BAG5 asupra nivelurilor de proteine ​​p62. Nivelurile homeostatice de p62 s-au dovedit a fi importante pentru funcția sa în agregarea proteinelor și autofagie (Komatsu și colab., 2007; Gamerdinger și colab., 2009). S-a demonstrat anterior că BAG3 se asociază cu p62 și îi susține stabilitatea, ceea ce promovează proteostaza mediată de autofagie în celulele îmbătrânite (Gamerdinger și colab., 2009). În celulele H4, am constatat că knockdown-ul țintit (KD) al BAG5 folosind siRNA a redus nivelurile de proteine ​​p62 endogene cu 60,8% (SEM = 4,6%) față de siRNA de control non-targetingp Cuvinte cheie: alfa-sinucleină, chaperone, atanogen asociat bcl-2, BAG5, proteostază, p62, sequestozom-1

Citare: Friesen EL, Zhang YT, Earnshaw R, De Snoo ML, O'Hara DM, Agapova V, Chau H, Ngana S, Chen KS, Kalia LV și Kalia SK (2020) BAG5 Promovează formarea de oligomeri alfa-sinucleină și interacționează funcțional Cu Autophagy Adapter Protein p62. Față. Cell Dev. Biol. 8: 716. doi: 10.3389/fcell.2020.00716

Primit: 04 aprilie 2020; Acceptat: 13 iulie 2020;
Publicat: 04 august 2020.

Beate Winner, Universitatea din Erlangen-Nürnberg, Germania

Christian Behl, Universitatea Johannes Gutenberg din Mainz, Germania
Arun Upadhyay, Universitatea Northwestern, Statele Unite

† Acești autori au contribuit în mod egal la această lucrare