Reproducere a plantelor

Editat de
Rodomiro Ortiz

Universitatea suedeză de științe agricole, Suedia

Revizuite de
Isabelle Colas

Institutul James Hutton, Regatul Unit

Galina Suvorova

Institutul de Cercetare All-Russia pentru leguminoase și culturi de gât, Rusia

Afilierile editorului și ale recenzenților sunt cele mai recente oferite în profilurile lor de cercetare Loop și este posibil să nu reflecte situația lor în momentul examinării.

frontiere

  • Descărcați articolul
    • Descărcați PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Suplimentar
      Material
  • Citarea exportului
    • Notă finală
    • Manager de referință
    • Fișier TEXT simplu
    • BibTex
DISTRIBUIE PE

Cercetare originală ARTICOL

  • 1 Institutul Național de Biotehnologie Agroalimentară, Mohali, India
  • 2 Școala Absolventă a Agriculturii Unite, Universitatea Tottori, Tottori, Japonia
  • 3 Northwest Institute of Plateau Biology (CAS), Qinghai, China
  • 4 Indian Institute of Wheat and Orley Research, Indian Council of Agricultural Research, Karnal, India

Introducere

Materiale și metode

Materiale vegetale

Materialele vegetale utilizate în acest studiu au inclus (1) linia de adaos disomic de Th. elongatum cromozomul 1E și linia de substituție disomică a Th. elongatum cromozomul 1E cu cromozomul 1D de grâu, atât în ​​fundalul primăverii chinezești (CS), (2) stocuri genetice zero pentru cromozomul 1A și tetra pentru cromozomul 1D (N1AT1D), N1AT1B, N1BT1A, N1BT1D și N1DT1B în fundalul CS și (3) patru soiuri: AcDomain-hard canadian, Norin 61 (N61) -soft japonez, PBW343-hard indian, Cham 6-hard sirian.

Generarea unei linii de translocare specifice cromozomilor

Căutarea markerilor proteici specifici cromozomului a fost realizată din tipare electroforetice ale gluteninei și proteinelor gliadinei Th. elongatum linii de adiție și substituție și șosete genetice nulli tetra ale CS. Pentru crearea liniei de translocație, DSL-1E (1D) a fost încrucișat reciproc cu N1AT1D pentru a crea monosomice duble pentru cromozomul 1E și 1A. Generația F1 a fost încrucișată/încrucișată cu soiurile N61, CHAM6, PBW343, AcDomain și cu Ph Eu linie mutantă (promovează împerecherea și recombinarea homoeologă). Selecția s-a bazat pe prezența HMW-GS și absența gliadinelor din Th. elongatum și absența gliadinelor codificate 1AS din grâu. Confirmarea translocării a fost efectuată prin analiza GISH. Plantele cu vigoare ridicată au fost selectate și s-au efectuat cicluri suplimentare de încrucișare/încrucișare și autoing.

Caracterizarea proteinelor

Proteinele de stocare a semințelor au fost extrase secvențial în conformitate cu Smith și Payne (1984) cu modificări. Inițial, extracția gliadinei a fost realizată cu 1,5 M DMF (dimetil formamidă), urmată de extracția gluteninei cu 50% izopropanol, 50 mM TrisHCl (pH 7,5), 2% DTT. Separarea gluteninelor a fost efectuată pe gel de poliacrilamidă 10%. Gliadinele au fost separate pe geluri de poliacrilamidă 15%.

Cromatografie lichidă de înaltă performanță în fază inversă (RP-HPLC)

RP-HPLC a proteinelor gliadinei și gluteninei separate a fost efectuată în conformitate cu Mejias și colab. (2014) cu unele modificări. Separarea proteinelor a fost realizată folosind coloana analitică C8 în fază inversă Zorbax 300SB-C8 (Agilent Technologies) cu dimensiunea particulelor de 5 μm și diametrul particulelor de 300 Å, lungimea de 250 mm, diametrul intern de 4,6 mm al sistemului de cromatografie cu lichid cuaternar Agilent 1260 Infinity. Detectorul a fost un detector UV-vis cu matrice de diode și absorbanța a fost detectată la 210 nm. Volumul injecției a fost de 20 μl. Gradientul liniar a fost stabilit utilizând solvenții A (0,1% TFA în MQ) și B (0,1% TFA în Acetonitril) și temperatura coloanei a fost stabilită la 60 ° C. Gluteninele au fost separate la un gradient liniar de 25-44% B timp de 120 min, 44-50% B timp de 5 min și, în cele din urmă, 50-65% B timp de 5 min. Gliadinele au fost separate de la 20 la 65% B timp de 120 min și apoi de la 65 la 75% B timp de 20 min.

Screening de fundal

Screeningul de fundal al liniei de translocație a fost realizat prin markeri simpli de repetare a secvenței (SSR). Primeri pe bază de coșuri de ștergere 536 (Sourdille și colab., 2004; Carollo și colab., 2005) au fost sintetizați și utilizați pentru screeningul de fundal al plantelor BC4F3 (Foaie de date suplimentare) N61, CS și 1E (1D) au fost utilizate ca controale. ADN-ul genomic al probelor selectate a fost izolat folosind metoda CTAB (bromură de cetil trimetil amoniu) (Doyle și Doyle, 1987). Amplificarea a fost efectuată în 20 μl de amestec de reacție conținând ADN genomic, PCR Mastermix (Thermo Fisher Scientific) și primerii de 0,4 μM folosind un cicler termic (Eppendorf). Programul de ciclare termică a implicat o denaturare inițială la 95 ° C timp de 5 min, urmată de 32 de cicluri de denaturare la 95 ° C timp de 60 s, recoacere la 5 ° C sub Tm a grundurilor respective timp de 30 s, extensie grund la 72 ° C timp de 30 s, urmată de o prelungire finală la 72 ° C timp de 10 min. Produsele PCR amplificate au fost fracționate prin electroforeză pe gel de agaroză 2,5% și/sau gel de poliacrilamidă 10% și vizualizate prin colorare cu bromură de etidiu (0,5 μg/ml) într-un sistem de documentare a gelului (Biospectrum UVP).

Microscopie electronică de scanare (SEM)

Semințele de dezvoltare N61 și linia de translocare au fost colectate în patru etape diferite (7DAA, 18DAA, 25DAA și 28DAA). Pentru SEM, semințele au fost încorporate în mediul de temperatură optimă de tăiere (OCT) (biosistemele Leica) și păstrate la congelare timp de o jumătate de oră. Apoi criosecționarea semințelor încorporate a fost efectuată la -20 ° C într-un criomicrotom (criostatul Leica CM1950). Pentru efectuarea microscopiei electronice de scanare, criosecțiile de 40 μm grosime au fost colectate pe banda adezivă de carbon și acoperite cu particule de aur. După acoperire, probele au fost montate pe microscopul electronic cu scanare și observate. Pentru semințele mature, în loc să se efectueze criosecționarea, semințele au fost crăpate sub azot lichid. Semințele crăpate au fost apoi lipite pe banda adezivă de carbon. Restul procedurii a fost același ca și în cazul semințelor în curs de dezvoltare.

Analiza citologică

Metoda Acetocarmine squash (Tsuchiya și Nakamura, 1979) a fost utilizată pentru prepararea cremozomilor mitotici. Th. elongatum ADN-ul genomic a fost izolat prin metoda CTAB (Doyle și Doyle, 1987). Genomică in situ hibridizare (GISH) și fluorescentă in situ hibridizare (FISH) au fost efectuate pentru screening și confirmarea liniei de translocare. ADN genomic total de Th. elongatum a fost marcat cu fluoresceină-12-dUTP (Roche) sau tetrametil-rodamină-5-dUTP (Roche) prin metoda de marcare aleatorie a grundului și a fost utilizat ca sondă pentru identificarea translocației (GISH). secvențele pAS1 și AAG marcate cu cianină (Cy3) și 6-fluoresceină amidită (6-FAM). respectiv, au fost folosite ca sonde pentru FISH pentru identificarea cromozomilor specifici. Cromozomii au fost contracolorați cu 4 ′, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (Roche) și observați la microscopul de fluorescență.

Analiza calității cerealelor

Umiditatea, conținutul de proteine, glutenul uscat și glutenul umed al făinii măcinate au fost determinate în conformitate cu metodele standard ale Asociației Americane a Chimiștilor din Cereale (AACC, 1990). Valorile sedimentării dodecil sulfatului de sodiu (SDSS) au fost măsurate la scară mică folosind 1 g de făină prin metoda Takata și colab. (1999). Testele de extensibilitate a aluatului (Totosaus și colab., 2013) au fost efectuate pe un analizor de textură (Stable Microsystems) folosind aluatul Kieffer și platforma de extensibilitate a glutenului. Valorile forței pozitive de vârf, distanței de întindere, aria până la vârful pozitiv și forța la țintă au fost calculate pentru diferite probe de aluat. Testele privind capacitatea de retenție a solventului (SRC) au fost efectuate în conformitate cu Metoda internațională AACC 56-11.02 pentru apă deionizată, soluție de zaharoză (50% g/g), soluție de carbonat de sodiu (5% g/g) și soluție de acid lactic (5% g/w). Pentru a determina proprietățile de amestecare a făinii s-a folosit un mixograf de 10 g (National Mfg. Co., Lincoln, NE, SUA). Testele de amestecare au fost efectuate în triplicate folosind metoda AACC 54-40A. Rezultatele au fost analizate utilizând software-ul MixSmart (AEW Consulting, Lincoln, NE, SUA).

Analize statistice

Pentru a determina nivelul de semnificație a diferiților parametri, analiza varianței (ANOVA) a fost efectuată utilizând programul de vizualizare statistică.

Rezultate

Generarea liniei de translocare specifică cromozomului DTL-1EL (1AS)

Pentru generarea unei linii de translocare specifice cromozomilor Th. elongatum au fost utilizate linia de substituție DSL-1E (1D) și N1AT1D. Deoarece ambele se află în fundalul genetic al CS, au fost studiate profilurile electroforetice ale proteinelor de stocare a gluteninei și gliadinei pentru identificarea markerilor proteici (Figura 1 suplimentară). Pe baza profilului gluteninei Th. elongatum specific HMW-GS au fost identificate și utilizate în continuare ca markeri pentru screeningul cromozomului 1EL. Din profilul gliadin Th. elongatum gliadine specifice au fost identificate și utilizate ca marker specific 1ES. Profilarea HMW-GS a CS a indicat faptul că are o alelă nulă la Glu-A1 locus. Prin urmare, profilurile de glutenină și gliadină LMW au fost explorate pentru subunitățile proteice specifice cromozomului 1A utilizând stocurile sale nullitetre N1AT1B, N1AT1D, N1BT1A, N1BT1D și N1DT1B. Unul, gliadina specifică cromozomului 1AS a fost identificată și utilizată ca marker proteic pentru screeningul cromozomului IAS (Figura suplimentară 2).

figura 1. Reprezentarea schematică a schemei de încrucișare implicată în generarea liniei de translocație specifică cromozomului [1EL (1AS)]. Monosomica dublă a fost creată prin selectarea cu atenție a materialului de reproducere și screening-ul a fost efectuat printr-o combinație de markeri proteici și genomică in situ hibridizare. Au fost efectuate mai multe runde de încrucișare înapoi pentru a recupera fundalul soiului destinatar. N1AT1D = stoc genetic nullisomic pentru cromozomul 1A și tetrasomic pentru cromozomul 1D.