Boli infecțioase - supraveghere, prevenire și tratament

Acest articol face parte din subiectul de cercetare

Paraziți și cancer Vizualizați toate cele 9 articole

Editat de
Monica C. Botelho

Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge (INSA), Portugalia

Revizuite de
Raquel Soares

Universitatea din Porto, Portugalia

Susana G. Guerreiro

Institutul de Cercetare și Inovare în Sănătate, Universitatea din Porto, Portugalia

Afilierile editorului și ale recenzenților sunt cele mai recente oferite în profilurile lor de cercetare Loop și este posibil să nu reflecte situația lor în momentul examinării.

ficatul

  • Descărcați articolul
    • Descărcați PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Suplimentar
      Material
  • Citarea exportului
    • Notă finală
    • Manager de referință
    • Fișier TEXT simplu
    • BibTex
DISTRIBUIE PE

Cercetare originală ARTICOL

  • 1 Departamentul de Microbiologie, Imunologie și Medicină Tropicală, Centrul de cercetare pentru bolile neglijate ale sărăciei, Școala de Medicină și Științe ale sănătății, Universitatea George Washington, Washington, DC, Statele Unite
  • 2 Departamentul de Biologie, Universitatea din Districtul Columbia, Washington, DC, Statele Unite
  • 3 Nanofabrication and Imaging Center, Office of VP for Research, George Washington University, Washington, DC, Statele Unite
  • 4 Center for Biodiscovery and Molecular Development of Therapeutics, Australian Institute of Tropical Health and Medicine, James Cook University, Cairns, QLD, Australia

Introducere

Infecție cu afecțiuni hepatice transmise de pești Opisthorchis viverrini, Opisthorchis felineus, și Clonorchis sinensis rămâne o problemă majoră de sănătate publică în Asia de Est și Eurasia, cu> 40 de milioane de cazuri. O. viverrini este endemic în regiuni din Thailanda, Cambodgia, Lao PDR și Vietnam (1), iar opisthorchiasis a fost studiat pe larg în Thailanda unde

8 milioane de persoane sunt infectate, calculate din prevalența la nivel național de 9,4% pentru populația thailandeză în 2001 (2, 3). Consumul de pești puțin gătiti infectați cu stadiul metacercariae al fluke-ului duce la infecție la om și la alte mamifere, cum ar fi pisicile și câinii (1). Stadiul metacercarial al parazitului excistează în duoden și fluke juvenil migrează în căile biliare ale ficatului și se maturizează peste o lună într-un fluke adult, care pășunește pe epitelii biliari. Paraziții au o viață îndelungată și persistă adesea în arborele biliar timp de decenii (1, 3). Ouăle Fluke sunt vărsate în bilă și ies cu fluxul fecal (1). Ouăle care pătrund în ecosistemele de apă dulce pot fi ingerate de melcul gastropod Bithynia siamensis (2, 4). Parazitul se dezvoltă în interiorul melcului, eliberând la rândul său cercarii care caută și pătrund în pielea unui pește ciprinid, care se învechesc în pește ca metacercarie, etapa infecțioasă pentru oameni și alte specii gazdă definitive (1).

Infecția provoacă boli hepatobiliare, inclusiv colangită și fibroză periductală (1). Mai problematic, atât dovezile experimentale, cât și cele epidemiologice implică puternic infecția cu fluke hepatic în etiologia colangiocarcinomului (CCA), cunoscut în mod obișnuit sub numele de cancer al căilor biliare - unul dintre principalele subtipuri de cancer hepatic (1, 5). Până la 81% din cazurile de cancer hepatic din regiunea endemică Isaan din nord-estul Thailandei sunt CCA, care suferă, de asemenea, cea mai mare incidență a CCA din lume - de 65 ori rata înregistrată în regiunile neendemice (1, 5, 6). CCA este un adenocarcinom care prezintă, în general, o creștere lentă și care este diagnosticat în stadiu avansat, adesea cu metastază la locuri îndepărtate datorită proximității vaselor limfatice (4). Din păcate, prognosticul este sumbru în stadiul avansat, când tumora primară nu mai este supusă rezecției hepatice. Mecanismul (mecanismele) prin care infecția inițiază leziuni genetice care culminează în cele din urmă cu CCA nu este clar, dar implică probabil tractul biliar și inflamația sistemică, inflamația asociată nitroziei endogene și dietetice și secreția de mitogeni și altele prin afectarea ficatului.

Un aspect al infecției hepatice care este potențial implicat în transformarea malignă este vindecarea excesivă, neîncetată a rănilor ca răspuns la hrănirea continuă de către paraziți pe țesutul căilor biliare (2, 3, 5). Am arătat că factorul de creștere asemănător granulinei, Ov-GRN-1, secretat de fluke este factorul proliferativ dominant și este suficient pentru a stimula vindecarea rănilor (2, 7). Un pas critic în generarea de țesuturi noi, inclusiv vindecarea rănilor și creșterea tumorii induse de infecție, este stimularea angiogenezei - formarea de noi capilare din vasele de sânge preexistente sau celulele stem vasculogene (8). Țesutul nou necesită angiogeneză pentru a furniza oxigen și substanțe nutritive, pentru a facilita supravegherea imunitară și pentru a elimina deșeurile (9). O interacțiune complexă de factori de creștere și inhibitori reglează angiogeneza, iar dezechilibrul poate duce la boli (10). În timp ce angiogeneza nu inițiază în sine malignitatea, aceasta poate promova progresia tumorii și metastaza (9, 11). Citokinele angiogene, incluzând factorul de creștere a fibroblastelor, factorul de creștere endotelial vascular (VEGF), factorul de creștere derivat din trombocite și factorul de creștere epidermică (9, 10), stimulează celulele endoteliale sau precursorii să prolifereze și să migreze, ducând rapid la capilare și vas de sânge noi rețele.

Testul de formare a tubulilor (TFA) oferă o abordare informativă, convenabilă, rapidă și cuantificabilă pentru a investiga angiogeneza (12). TFA implică adeziunea celulelor endoteliale, migrarea, proteoliza și formarea tubulilor de către celulele endoteliale, care este inițiată după însămânțarea celulelor pe matricea bazală gelificată, substratul natural al progenitorilor celulelor endoteliale. Celulele endoteliale formează structuri asemănătoare capilarelor cu un lumen (12). Recombinant Ov-GRN-1 (rOv-GRN-1) induce angiogeneza (creșterea vaselor de sânge) la embrionii de prepeliță în testul membranei corioalantoice (CAM) (2). Cu toate acestea, potențialul angiogen al granulinei de ficat asupra celulelor umane nu a fost determinat. Aici, raportăm o activitate angiogenă și mitogenică puternică a Ov-GRN-1 la concentrația nanomolară pe celulele endoteliale ale venei ombilicale umane primare (HUVEC) utilizând atât un TFA cu randament ridicat cu analize automate bazate pe ImageJ, cât și cu testul celular în timp real al sistemului xCELLigence.

Materiale și metode

Producția recombinantă Ov-GRN-1

Purificarea rOv-GRN-1 a fost realizat utilizând un sistem de purificare AKTA10 la 4 ° C (GE Healthcare) așa cum s-a descris anterior (2, 13). Pe scurt, BL21 E coli peletă bacteriană care conține rOv-Plasmida de expresie GRN-1 a fost lizată cu trei cicluri de îngheț/dezgheț, urmate de sonicare. Peleta insolubilă rezultată a fost solubilizată în tampon de legare a nichelului care conține uree [8 M uree/300 mM NaCI/50 mM imidazol/50 mM fosfat de sodiu pH 8 (Sigma)]. Supernatantul filtrat cu 0,22 uM a fost trecut peste 2 × 5 ml coloane de nichel Histrap IMAC (GE Healthcare) și spălat cu concentrații crescânde de imidazol și eluat cu 500 mM imidazol în tampon de legare. Reîncărcarea ureei denaturate rOv-GRN-1 a fost efectuat cu 28 ml de rășină Sephadex G10 pe o coloană XK16/20 (GE Healthcare) cu 7 ml aplicat la 100 ug/ml și eluat cu NaCl 150-mM, 50-mM fosfat de sodiu, pH 6. A 120 -ml Coloana Superdex 30 XK16/60 (GE Healthcare) a fost utilizată pentru fracționarea rOv-GRN-1 monomer eluând la o dimensiune pliată echivalentă cu

1 kDa. Concentrația de proteine ​​a fost determinată de o combinație de test de microplacă Bradford (Bio-Rad) în conformitate cu instrucțiunile producătorului și densitatea optică la 280 nm.

Celule endoteliale ale venei ombilicale umane

Celulele endoteliale ale venei ombilicale umane reunite de la donatori (PromoCell, Heidelberg, Germania) au fost cultivate în baloane de cultură tisulară T75 în mediu EGM-2 complet (PromoCell) la 37 ° C într-o atmosferă umidificată în 5% CO2 în aer. HUVEC-urile au fost crescute până la

Confluență de 80%, după care cultura a fost tripsinizată utilizând PromoCell Detach Kit (PromoCell). Celulele investigate prin testul de formare a tubulilor (TFA) au fost utilizate doar din al treilea, al patrulea sau al cincilea pasaj, cu HUVEC trecute la

80% confluență în 24 de ore de TFA, așa cum este descris (14).

Proliferare xCELLigence Test

Celulele au fost însămânțate la 5.000 de celule pe godeu în 200 ofl de mediu complet (de mai sus) în plăci E (ACEA Biosciences, San Diego, CA, SUA) și crescute peste noapte în timp ce au fost monitorizate cu un sistem xCELLigence DP (ACEA Biosciences) care monitorizează evenimentele celulare în timp real prin măsurarea impedanței electrice pe microelectrozi de aur interdigitați integrați pe fundul plăcilor de cultură tisulară. Celulele au fost spălate de trei ori cu PBS și înlocuite cu 180 EGl EGM-2 mediu bazal (fără factori de creștere sau suplimente) și incubate timp de minimum 6 ore înainte de tratamentul suplimentar. Tratamentele au fost preparate la 10 × concentrații și adăugate la fiecare godeu într-un volum total de 20 pl. XCELLigence DP a înregistrat citiri ale indexului celular la fiecare 15 minute timp de 3 zile după tratament. Citirile indicelui celular au fost normalizate înainte de tratament și raporturile de proliferare celulară au fost determinate din patru replici biologice și reprezintă numărul relativ de celule comparativ cu celulele martor. Un ANOVA bidirecțional cu Holm - testul de comparație multiplă al lui Sidak a fost folosit pentru a compara Ov-Tratament GRN-1 până la control mediu-singur, cu P ≤ 0,05 considerat semnificativ.

Testul de formare a tubulilor (TFA)

Matrigel cu factor de creștere redus (Corning, Corning, NY, SUA) a fost placat într-o placă cu 96 de godeuri de angiogeneză μ (ibidi, Planegg, Germania) la 10 μl/godeu și incubat la 37 ° C în 5% CO2 în aer timp de 60 min așa cum este descris (14). HUVEC-urile au fost detașate (deasupra) și resuspendate în mediul de creștere complet al celulelor endoteliale 2 (EGM-2) (PromoCell) și însămânțate la 10.000 celule/godeu în mediu suplimentat cu 10 µM sulforaphane (SFPH, Sigma) (control negativ), 1,2 nM VEGF-165 (Novus Biologicals) (control pozitiv) sau 5, 10, 20 și 40 nM Ov-GRN-1. Placa ibidi a fost incubată timp de 12 ore într-o atmosferă umidificată cu 5% CO2 în aer la 37 ° C într-un incubator superior de stadiul microscopului (OKOLAB, Pozzuoli, Napoli, Italia). La intervale de timp, fotomicrografiile celulelor și tubulilor născuți și dezvoltați au fost colectate folosind un microscop Leica DMi8 cu platformă automată sub câmp luminos la mărire de 2,5 × și software-ul Leica LASX (Leica).

Analiza formării tubulilor

Evaluarea automată a angiogenezei a fost efectuată pe imagini TFA 490 cu 2 pixeli de către ImageJ (NIH) cu instrumentul de plugin Angiogenesis Analyzer cu contrast de fază așa cum este descris (12, 15). Setările utilizate au fost următoarele: dimensiunea minimă a obiectului de 10 pixeli; Dimensiune minimă a ramurii de 25 pixeli; 2.500 pixeli dimensiune buclă artifactual; Prag de dimensiune a elementului izolat de 25 pixeli; Prag de dimensiune a segmentului master de 30 de pixeli; cu un număr de iterație de 3. Cele patru indicatoare de ieșire (număr de ochiuri, număr de segmente, lungime de segment și număr de joncțiuni) au fost reprezentate direct sau ca procentaj în raport cu tratamentul cu semifabricat mediu-singur (măsura de tratament împărțită la măsură singură) . Un ANOVA bidirecțional cu Holm - testul de comparație multiplă al lui Sidak a fost folosit pentru a compara Ov-Tratamentul GRN-1 împotriva martorului gol mediu-singur pentru cele patru valori cu P ≤ 0,05 considerat semnificativ.

Combinarea celor patru valori într-o singură variabilă ponderată uniform a fost realizată prin calcularea Z scoruri standardizate care s-au bazat pe valorile populației (16). Formula de mai jos generează Z scorul și a reprezentat distanța dintre scorul brut și media populației în unități ale SD. Valorile populației au fost estimate din 39 de replici de tratament.

Combinația robustă Z Scor (Z*) a fost generat pentru fiecare replică din mediană Z scorul celor patru valori. Z* scorurile au fost reprezentate grafic și Ov-Tratamente GRN-1 în comparație cu controlul martor mediu singur folosind ANOVA unidirecțional cu Holm - testul de comparație multiplă al lui Sidak, P ≤ 0,05 a fost considerat semnificativ statistic.

Rezultate

Pentru a evalua influența Ov-GRN-1 pe HUVEC în comparație cu alte tipuri de celule, am analizat proliferarea și migrația celulară HUVEC cu sistemul xCELLigence. Tratamentul cu Ov-GRN-1 induce proliferarea într-o serie de tipuri de celule (2, 4, 17). Expunerea HUVEC la 5-20 nM Ov-GRN-1 a prezentat un răspuns similar (Figura 1). Deoarece testul angiogen cu HUVECs ar fi evaluat la 12 ore, pentru proliferare, ne-am concentrat pe primele 24 de ore și am observat o creștere nesemnificativă (5-11%) nesemnificativă peste valorile controalelor negative de la 5 la 10 nM Ov-GRN-1 (Figura 1B). Douăzeci de nanomolari au fost suficienți pentru a induce o creștere semnificativă cu 14% a indicelui celular de la 4 ore (*P Cuvinte cheie: granulină, parazit, angiogeneză, vindecarea rănilor, cancer la ficat, celule endoteliale ale venei ombilicale umane, testarea formării tubulilor

Citație: Haugen B, Karinshak SE, Mann VH, Popratiloff A, Loukas A, Brindley PJ și Smout MJ (2018) Granulină secretată de Fluke Liver-Borne Food Opisthorchis viverrini Promovează angiogeneza în celulele endoteliale umane. Față. Med. 5:30. doi: 10.3389/fmed.2018.00030

Primit: 21 noiembrie 2017; Acceptat: 29 ianuarie 2018;
Publicat: 16 februarie 2018

Monica Catarina Botelho, Institutul Național de Sănătate Doutor Ricardo Jorge (INSA), Portugalia

Raquel Soares, Universitatea din Porto, Portugalia
Susana Gomes Guerreiro, i3S, Institutul de Investiții și Inovare din Saúde, Portugalia

† Acești autori au contribuit în mod egal la această lucrare.