Editat de
Carlos B. Duarte

Universitatea din Coimbra, Portugalia

Revizuite de
Kurt Gottmann

Universitatea Heinrich Heine din Düsseldorf, Germania

Shuya Fukai

Universitatea din Tokyo, Japonia

Afilierile editorului și ale recenzenților sunt cele mai recente oferite în profilurile lor de cercetare Loop și este posibil să nu reflecte situația lor în momentul examinării.

mecanisme

  • Descărcați articolul
    • Descărcați PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Suplimentar
      Material
  • Citarea exportului
    • Notă finală
    • Manager de referință
    • Fișier TEXT simplu
    • BibTex
DISTRIBUIE PE

Cercetare originală ARTICOL

  • 1 Centrul Djavad Mowafaghian pentru Sănătatea Creierului, Departamentul de Psihiatrie, Universitatea British Columbia, Vancouver, BC, Canada
  • 2 Centrul de Științe ale Sănătății, Institutul Kleysen pentru Medicină Avansată, Universitatea din Manitoba, Winnipeg, MB, Canada
  • 3 Departamentul de Fiziologie și Fiziopatologie, Facultatea de Științe ale Sănătății Rady, Universitatea din Manitoba, Winnipeg, MB, Canada
  • 4 Institutul de cercetare a spitalului pentru copii din Manitoba (CHRIM), Winnipeg, MB, Canada
  • 5 Departamentul de Științe Celulare și Fiziologice, Facultatea de Medicină, Institutul de Științe ale Vieții, Universitatea British Columbia, Vancouver, BC, Canada

Introducere

Un prim pas cheie în formarea unei noi sinapse implică legarea între proteinele organizatoare sinaptice exprimate pe axonul unui neuron și dendrita altui, care declanșează gruparea proteinelor sinaptice intracelulare în ambii neuroni. Prezentarea unei singure proteine ​​organizatoare sinaptice exprimată pe suprafața unei celule non-neuronale este suficientă pentru a induce gruparea locală a mașinilor presinaptice sau postsinaptice. Acest lucru este exemplificat de prima pereche descoperită și cea mai cunoscută de proteine ​​organizatoare sinaptice, neuroliginele postsinaptice (Scheiffele și colab., 2000) și neurexinele presinaptice (Graf și colab., 2004). În plus față de neuroligine și neurexine, au fost descrise o varietate de alte proteine ​​organizatoare cu activități sinaptogene similare (Südhof, 2018). Acestea includ LAR exprimat presinaptic, proteina tirozin fosfatază σ (PTPσ) și PTPδ, care împreună alcătuiesc familia LAR-RPTP și interacționează cu NGL-3 postsinaptic (Woo și colab., 2009), TrkC (Takahashi și colab., 2011), Slitrk1-6 (Takahashi și colab., 2012; Um și colab., 2014), Il1RAPL1 (Yoshida și colab., 2011), IL1RAcP (Yoshida și colab., 2012), SALM3 și SALM5 (Mah și colab. al., 2010; Li și colab., 2015).

Mecanismul prin care proteinele organizatoare sinaptice semnalează formarea unei sinapse născute trebuie să implice mai mult decât simpla aderență. În cazul neurexinei, recrutarea proteinelor intracelulare poate avea loc cel puțin în anumite circumstanțe fără prezența regiunii intracelulare a neurexinei (ICR; Gokce și Südhof, 2013), probabil printr-un co-receptor neidentificat. Același lucru nu pare să fie adevărat pentru LAR-RPTP, deoarece o versiune a PTPσ lipsită de ICR a acționat ca un supresor dominant-negativ al sinaptogenezei (Takahashi și colab., 2011). Cu toate acestea, mecanismul prin care aceste proteine ​​își exercită efectele, inclusiv care sunt proteinele care interacționează intracelular și/sau co-receptorii sunt implicați, este slab înțeles.

LAR-RPTP-urile sunt alcătuite din domenii extracelulare Ig și FNIII care mediază legarea de liganzii postsinaptici NGL-3, TrkC, Slitrks, IL1RAPL1, IL1RAcP și SALM (Takahashi și Craig, 2013). Domeniul LAR-RPTP Ig1 leagă de asemenea sulfatul de condroitină și sulfatul de heparan (HS), interacțiuni care reglează creșterea axonului (Aricescu și colab., 2002; Shen și colab., 2009). În contextul sinaptogenezei, HS concurează cu TrkC pentru legarea PTPσ (Coles și colab., 2014), dar HS poate media formarea de complecși sinaptogeni suplimentari, așa cum este sugerat pentru un complex PTPσ-glypican-4-LRRTM4 (Ko și colab., 2015 ).). Cealaltă familie majoră de organizatori presinaptici, neurexinele, sunt HSPG (Zhang și colab., 2018). Nu este încă clar dacă interacțiunea LAR-RPTP mediată de HS cu neurexinele sau alți co-receptori axonali poate contribui la funcția sinaptogenă.

În urma domeniului transmembranar unic, LAR-RPTP au un domeniu mic de pană urmat de două domenii asemănătoare fosfatazei, denumite D1 și D2, dintre care doar D1 este activ catalitic (Streuli și colab., 1990; Takahashi și Craig, 2013). Există mai multe substraturi enzimatice cunoscute ale LAR-RPTP, inclusiv p250GAP (Chagnon și colab., 2010), β-catenină (Müller și colab., 1999; Dunah și colab., 2005) și N-caderină (Siu și colab., 2007), care le-ar putea media efectele sinaptogene. Domeniul D2 se leagă de proteinele schelelor din familia liprin-α (Serra-Pagès și colab., 1995), de trio GEF/kinază (Debant și colab., 1996) și de proteinele care interacționează cu CASK caskin1 și caskin2 ( Weng și colab., 2011).

Aici, am folosit o strategie de înlocuire moleculară în care una sau mai multe interacțiuni intermoleculare au fost întrerupte de ștergerea domeniului sau mutageneză punctuală pentru a oferi o perspectivă asupra mecanismului prin care PTPσ semnalează formarea unei sinapse născute. Găsim că abilitatea PTPσ de a media inducerea de noi site-uri presinaptice prin partenerii săi canonii trans-sinaptici nu depinde de capacitatea sa de a defosforila ținte sau de a lega HSPG-uri, dar necesită locul de legare pentru liprin-α. Rezultatele noastre sugerează, de asemenea, că, spre deosebire de rapoartele anterioare, legarea dintre PTPσ și liprin-α implică atât domeniile D1, cât și D2 ale PTPσ.

Materiale și metode

Construcții ADN și vectori virali

Vectorul pFB-shPTP folosit pentru ambalarea AAV6-shPTP a fost generat pe baza L315-shCtrlx4 (Gokce și Südhof, 2013), pFB-AAV-GFP-4xshRNA (Zhang și colab., 2018) și secvențe shRNA împotriva PTPσ (5 ′ -GGCATCATGGGTAGTGATT-3 '), PTPδ [5'-GTGCCGGCTAGAAACTTGT-3' (Dunah și colab., 2005)] și LAR [5'-GGCCTACATAGCTACACAG-3 '(Mander și colab., 2005)]. Această plasmidă a fost ambalată în AAV6 de Virovek. AAV6-GFP-4xshRNA numit aici shCtrl a fost descris anterior (Zhang și colab., 2018).

Următoarele construcții au fost descrise anterior: HA-CD4, pLL-CFP (shCtrl-rezistent; Zhang și colab., 2018), HA-TrkC și TrkC-CFP (ambele forma necatalitică; Takahashi și colab., 2011). HA-NGL-3 a fost creat pe baza NGL-3-CFP (Siddiqui și colab., 2013) prin inserarea unui tag HA (YPYDVPDYA) în urma peptidei de semnal și îndepărtarea CFP C-terminal, iar V5-CD4 a fost creat din YFP -CD4 (Takahashi și colab., 2011) prin înlocuirea etichetei YFP cu V5 (GKPIPNPLLGLDST) în urma peptidei de semnal.

pLL3.7-hSyn-V5-PTPσ de tip sălbatic (WT), ștergere ICR (ΔICR, aminoacizi lipsă 974–1530, KLSQ… HYAT), C1142S, 4K4A, ștergere D1 (ΔD1, lipsă aminoacizi 993–1232, SNLE … EAVG), ștergerea D2 (ΔD2, aminoacizii lipsă 1251-1523, AQVE… EYLG), D2D2 (aminoacizii 993-1232 înlocuiți cu aminoacizii 1251-1523), PPLL, QFG și EGFID au fost generate pe baza C1-YFP -pusează mouse-ul cu patru domenii FNIII și lipsește atât inserțiile de îmbinare meA, cât și meB (Takahashi și colab., 2011). Eticheta V5 a fost inserată direct după peptida de semnal și YFP a fost îndepărtată, iar construcția WT (care a fost utilizată ca șablon pentru a construi toți mutanții) a fost făcută rezistentă la shARN prin mutarea secvenței GGCATCATGGGTAGTGATT în GGaATaATGGGaAGcGATT.

Trio-C1-myc (Terry-Lorenzo și colab., 2016) a fost un fel de cadou de la Dr. Craig Garner (Centrul German pentru Boli Neurodegenerative, Bonn, Germania) și conține secvența de ADNc trio uman. ADNc caskin1 de șoarece (numărul de acces BC060720) a fost obținut de la Open Biosystems. O mică parte din capătul 5 ′ al ADNc a lipsit și a fost restaurată prin PCR.

CMV-HA-liprin-α2 care conține gena liprin-α2 de șoarece a fost un fel de cadou de la Dr. Susanne Schoch (Institutul de Neuropatologie, Bonn, Germania) care conține gena liprin-α2 de șoarece. Am mutat secvența GGGGCTGATCCACCGGAGTTT în GGaGCcGATCCtCCaGAaTTT pentru a face secvența rezistentă la un shRNA (neutilizat în această lucrare) fără a schimba secvența de aminoacizi. Din plasmida rezultată, am transferat cadrul de citire deschis în vectorul pBA, care conține promotorul β-actinei de pui CAG și a fost un cadou amabil de la Dr. Gary Banker (Oregon Health and Sciences University, Portland, OR, SUA) și am înlocuit eticheta N-terminal HA cu o etichetă myc (EQKLISEEDL) pentru a genera pBA-myc-liprin-α2.

Fuziunile cu dihidrofolat reductaza (DHFR) F3 C-terminal au fost realizate pe baza p41-HPH-TEF-SspBYGMF-linker-DHFR-F3 (Tarassov și colab., 2008). Secvențele PTPσ, liprin-α2, caskin1 și trio au fost subclonate fie în totalitate, fie în formă trunchiată din plasmidele descrise mai sus, astfel încât să fie fuzionate la termenii lor C prin intermediul un linker scurt către fragmentul F3. PTPσ ICR a constat din aminoacizi 974–1530 (KLSQ ... HYAT), liprin-α2 SAM a constat din aminoacizi 877–1192 (KDRR ... SDDK), caskin1 SAM a constat din aminoacizi 344–636 (AIVK ... MAIE) și trio IgPSK a constat din aminoacizi 2237-3062 (NQRN ... LPRV). Fuziunile cu fragmentul N-terminal DHFR F1-2 au fost clonate în vectorul p413 (Mumberg și colab., 1995). O casetă care conține fragmentul DHFR F1-2 și terminatorul Adh1 de la pAG25-F1-2 (Tarassov și colab., 2008) a fost fuzionată la capătul C-terminal al PTPσ full-length (FL) sau ICR sub controlul TEF promotor. PTPσ-FL-DHFR atât F1-2, cât și F3 conțineau un N-terminal V5 tag. NgCAM, care a fost un fel de cadou de la doctorul Peter Sonderegger (Universitatea din Zurich, Zurich, Elveția) și YFP au fost fiecare separat separat la F1-2 și la F3 ca controale. Mutațiile punctuale au fost introduse în fuziunile PTPσ FL sau ICR DHFR F1-2, precum și în fuziunea PTPσ FL DHFR F3 în cazul mutantului PPLL (Hofmeyer și Treisman, 2009).

Cultura neuronală, transfecția și transducția AAV

Acest studiu a fost realizat în conformitate cu recomandările Consiliului canadian pentru îngrijirea animalelor. Protocolul a fost aprobat de Comitetul pentru îngrijirea animalelor de la Universitatea din Columbia Britanică.

Neuronii hipocampici de șobolan în ziua 18 embrionară primară (E18) au fost cultivați în esență în conformitate cu metoda descrisă în Kaech și Banker (2006). Pentru exprimarea constructelor ADN, sistemul nucleofector AMAXA (Lonza) a fost utilizat pentru a livra o cantitate adecvată de plasmidă (2-4 μg per construct) la 1-2 milioane de celule proaspăt disociate. Celulele au fost placate pe lamele de acoperire acoperite cu poli-L-lizină la o densitate inițială de aproximativ 700.000-900.000 pentru neuronii transfectați sau 500.000 pentru neuronii netransfecți, pe o farfurie de 6 cm. Neuronii au fost menținuți cu un strat alimentator glial și s-a adăugat citozină arabinozidă (5 μM) la DIV 2 pentru a preveni creșterea excesivă glială. S-a adăugat acid DL-2-amino-5-fosfonovaleric (APV, 100 μM) începând de la DIV 5 pentru a limita excitotoxicitatea și a îmbunătăți supraviețuirea neuronală.

Livrarea AAVs a fost realizată prin incubarea neuronilor DIV 6 cu fața în sus în plăci cu 12 godeuri, fiecare godeu conținând 700 μL de mediu condiționat glial cu 5 × 10 9 genomi virali (vg) de construcție virală adecvată. Mediile condiționate au fost recoltate fie din vasele proprii ale neuronilor, fie din vase similare și au fost centrifugate timp de 5 minute la 1.500 × g inainte de folosire. APV a fost adăugat la o concentrație de 100 μM. Neuronii au fost incubați în soluția care conține virus timp de 4 ore și apoi transferați înapoi în vasele lor de acasă.

PCR cantitativ în timp real (RT-qPCR)

RT-qPCR a fost efectuat pentru a confirma tripla eliminare a PTPσ, PTPδ și LAR de către AAV6-shPTP. Neuronii au fost tratați cu AAV purtând shCtrl sau shPTP ca mai sus, recoltați pe DIV 16 în PBS rece și apoi lizați în reactiv TRIzol (Invitrogen). Extracția ARN din lizate a fost efectuată imediat folosind PureLink RNA Mini Kit (Thermo Fisher Scientific). Eliminarea ADN-ului genomic și retranscrierea la ADNc au fost efectuate folosind SuperScript IV Vilo Master Mix cu ezDNase Enzyme (Thermo Fisher Scientific). SYBRGreen qPCR (PowerUp ™ SYBR Green Master Mix, Thermo Fisher Scientific) a fost efectuat folosind ADNc rezultat, cu gliceraldehidă-3-fosfat dehidrogenază (GAPDH) și β-actină (Actb) ca gene de referință. Grundele utilizate sunt listate în tabelul de mai jos, iar eficiența lor a fost estimată între 0,87 și 1,05. Toate valorile ciclului cantitativ (Cq) au fost detectate înainte de finalizarea celui de-al 38-lea ciclu.

Lista primerilor utilizați în testele cantitative RT-PCR.

Confirmarea Knockdown de Western Blot

Neuronii au fost tratați cu AAV purtând shCtrl sau shPTP ca mai sus și recoltați pentru Western blot la DIV 17-18 folosind Complexiolyte-48 (50 μL/acoperitor, Logopharm). S-au determinat concentrațiile de proteine ​​și s-au administrat cantități egale pe geluri SDS-poliacrilamidă 10%. Proteinele au fost șterse folosind membrane Immobilon P (Millipore). Membranele au fost blocate folosind lapte degresat 5% în soluție salină tamponată cu Tris cu 0,001% Tween-20 și incubate în soluție de anticorp. Anticorpii principali utilizați au fost anti-PTPσ (șoarece, 17G7.2, MM-0020, Medimabs) și anti-β-actină (iepure, 1: 5.000, ab8227, Abcam). Anticorpii secundari au fost conjugați HRP anti-șoarece sau anti-iepure de capră de la Southern Biotech. Detectarea a fost efectuată folosind un substrat chemiluminiscent Western Immobilon (Millipore).

Analiza coculturii

Celulele COS au fost menținute în mediul Eagle modificat (DMEM) al lui Dulbecco cu 10% ser de creștere bovină (BGS). Când neuronii au atins vârsta de 12 DIV, celulele COS aproape confluente au fost recoltate folosind 0,25% tripsină-EDTA și placate în plăci cu 12 godeuri, apoi transfectate în ziua următoare la

85% confluență utilizând polietilenimină (Boussif și colab., 1995) cu 1 μg de ADN plasmidic care codifică o formă marcată fie a unei proteine ​​organizatoare postsinaptice, fie a CD4 ca control non-sinaptogen. A doua zi după transfecție, când neuronii erau la DIV 13, celulele COS au fost recoltate din nou ca înainte, spălate de două ori cu DMEM cu 10% BGS, resuspendate în mediu condiționat glial (tratat ca mai sus pentru infecție virală) și placate la o densitate de

20.000 de celule per acoperire de deasupra neuronilor. Coculturilor li s-a permis să incubeze 18-24 de ore înainte de fixare și colorare.

HEK Cultures Cellular and Clustering Assay

Întreținerea, recoltarea și transfecția celulelor HEK 293 (HEK) au fost efectuate în același mod ca și pentru celulele COS, cu excepția faptului că concentrația de tripsină-EDTA utilizată a fost de 0,05%. Înainte de transfecție, celulele au fost placate în plăci cu 12 godeuri pe lamele acoperite cu poli-D-lizină (PDL). Testul de grupare a fost realizat prin transfectarea celulelor HEK cu un amestec de 0,2 μg de pBA-myc-liprin-α2, 0,6 μg de pLL-V5-PTPσ WT sau mutant și 0,2 μg de pLL CFP. Acoperitoarele de control au înlocuit fie liprină-α2, fie plasmida PTPσ cu o cantitate egală de plasmidă pLL CFP suplimentară, astfel încât cantitatea totală de ADN a fost întotdeauna 1 μg.

Imunocitochimie și imagistică

Colorarea suprafeței vii atât pentru celulele HEK (Figura 7), cât și pentru coculturi (Figurile 2-4) a fost efectuată prin incubarea lamelelor de acoperire cu fața în sus în soluție de anticorp timp de 30 min pe un bloc de gheață într-un incubator umidificat la 37 ° C, 5% CO2. Soluția de anticorp a fost realizată cu mediu neurobazic proaspăt. APV a fost adăugat la o concentrație de 100 μM pentru experimentele care implică neuroni. Capace au fost spălate cu mediu neurobazal de trei ori înainte de fixare.

Citație: Bomkamp C, Padmanabhan N, Karimi B, Ge Y, Chao JT, Loewen CJR, Siddiqui TJ și Craig AM (2019) Mecanisme de diferențiere presinaptică mediate de PTPσ. Față. Neuroști sinaptici. 11:17. doi: 10.3389/fnsyn.2019.00017

Primit: 12 martie 2019; Acceptat: 06 mai 2019;
Publicat: 22 mai 2019.

Carlos B. Duarte, Universitatea din Coimbra, Portugalia

Shuya Fukai, Universitatea din Tokyo, Japonia
Kurt Gottmann, Universitatea Heinrich Heine din Düsseldorf, Germania