Microbiologie alimentară

Acest articol face parte din subiectul de cercetare

Siguranța alimentară și agentul patogen alimentar - O perspectivă globală asupra diversității, combaterea rezistenței și gestionării multidrogurilor Vizualizați toate cele 39 de articole

Editat de
Learn-Han Lee

Monash University Malaysia, Hotel Malaysia

Revizuite de
Sergio E. Pasteris

Universitatea Națională Tucumán, Argentina

Konstantinos Papadimitriou

Departamentul de Știință și Tehnologie Alimentară, Universitatea din Peloponez, Grecia

Afilierile editorului și ale recenzenților sunt cele mai recente oferite în profilurile lor de cercetare Loop și este posibil să nu reflecte situația lor în momentul examinării.

frontiere

  • Descărcați articolul
    • Descărcați PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Suplimentar
      Material
  • Citarea exportului
    • Notă finală
    • Manager de referință
    • Fișier TEXT simplu
    • BibTex
DISTRIBUIE PE

Cercetare originală ARTICOL

  • 1 Departamentul de Biotehnologie Alimentară, Direcția pentru Regiunea Nord-Vest și Vest, Institutul de Cercetări în Biotehnologie Agricolă, Organizația pentru Educație și Extindere (AREEO), Tabriz, Iran
  • 2 Suplimentele dietetice și Centrul de cercetare probiotice, Universitatea Alborz de Științe Medicale, Karaj, Iran

Introducere

Enterococii aparțin generației de bacterii lactice (LAB). Sunt gram-pozitive, catalază negativă, în formă de cocci, anaerobe facultative și bacterii care nu formează spori (Haghshenas și colab., 2016). Pe baza dovezilor filogenetice și a studiilor moleculare (secvențierea 16S-rDNA sau hibridizarea ADN - ADN), mai mult de 26 de specii au fost clasificate în acest gen. Aceste microorganisme sunt bacterii omniprezente care se prezintă ca microbiota obișnuită în intestinele oamenilor, mamiferelor și altor tracturi gastrointestinale ale animalelor, dar există și în sol, apă, produse vegetale, carne, carne și produse lactate fermentate și fierte (Li și colab. ., 2018; Zommiti și colab., 2018). Acest lucru se datorează toleranței lor ridicate la condiții dure, cum ar fi temperaturi ridicate, pH scăzut și salinitate ridicată. Rol semnificativ al E. faecium, E. faecalis, și E. durans în maturarea brânzeturilor tradiționale au indicat faptul că enterococii joacă un rol important în maturarea acestor brânzeturi, probabil prin proteoliză, lipoliză și descompunerea citratului, contribuind astfel la gustul și aroma lor tipice. Majoritatea operelor specifică acest lucru Enterococ izolatele joacă un rol vital în dezvoltarea proprietăților senzoriale ale alimentelor fermentate, cum ar fi măslinele (descompun oleuropeinul în măsline fermentate), cârnații și brânza (Moreno și colab., 2006).

Există mai multe matrice de probiotice, în principal Lactobacillus și Bifidobacterii grupuri și Enterococ genurile din ultimii ani, sunt utilizate în alimente funcționale (Haghshenas și colab., 2017). Avantajele revendicate ale enterococilor probiotici sunt: ​​(i) diareea sau tratamentul diareei în asociere cu medicamente antibiotice, contaminări virale, chimioterapie și boli provenite de la agenții patogeni de origine alimentară (Lau și Chamberlain, 2016); (ii) reducerea creșterii bacteriilor patogene (Zorriehzahra și colab., 2016); (iii) caracteristici anti-mutagene și anticancerigene; (iv); creșterea barierei mucoasei intestinale (Ahl și colab., 2016); (v) stimularea sistemului imunitar (Sheikhi și colab., 2016); (vi) prevenirea ulcerelor legate de Helicobacter pylori infecție (Oh și colab., 2016) și (vii) asimilarea colesterolului în alimente și în intestinul uman (Kobyliak și colab., 2016). Aceste microorganisme au activități antagoniste prin intermediul agenților patogeni de către diferiți compuși antimicrobieni producerea cuprinde bacteriocine, acizi lactici și acetici și peroxid de hidrogen.

Materiale și metode

Condiții de eșantionare și cultură

Produsele lactate artizanale (iaurt, brânză și caș) au fost colectate de la producătorii interni (Tabelul 1). Probele au fost transportate la laborator în cutii de gheață și depozitate la 4 ° C. Pentru o mai bună separare a bacteriilor de particulele solide de iaurt și brânză, omogenizarea inițială a avut loc prin vortex. Pentru a prepara suspensia bacteriană de iaurt, 10 g de iaurt au fost transferați la 100 ml de apă peptonă fiziologică sterilă și agitați ușor. Pentru a prepara suspensia bacteriană de brânză și caș, 20 g din fiecare probă au fost suspendate în 180 ml soluție sterilă de citrat de sodiu și, după o jumătate de oră, s-au adăugat 10 ml soluție preparată la 200 ml Man Rogosa Sharpe (MRS) ) bulion pentru a îmbogăți și îmbunătăți populația bacteriană inițială în condiții anaerobe și incubat la 37 ° C timp de 24 de ore (Haghshenas și colab., 2017).

tabelul 1. Originea, regiunea probelor preparate și toleranța acidă și biliară a izolatelor.

Izolarea Enterococ Izolați

Enterococ izolatele au fost izolate prin metoda streak-plate pe agar MRS și incubate aerob la 37 ° C timp de 24 de ore. Coloniile individuale au fost verificate în mod curent pentru puritate prin examinare microscopică. Coloniile pure au fost folosite pentru a caracteriza colorarea Gram și testul catalazei. Coloniile care au fost Gram-pozitive și catalază-negative au fost selectate și inoculate în bulion MRS conținând 30% glicerol ca crioprotector și stocate la -80 ° C (El Soda și colab., 2003). Culturile purificate au fost activate prin subcultivare de două ori în bulion MRS înainte de utilizare.

Evaluarea proprietăților probiotice

Toleranță la acizi și săruri biliare

Pentru a determina toleranța la acid, 10 mL de cultură bacteriană din fiecare probă au fost incubate timp de 24 de ore în bulion MRS. Coloniile selectate au fost transferate în soluție salină tamponată cu fosfat mediu (PBS, pH 2,5). Probele au fost incubate aerob timp de 3 ore la 37 ° C. Ulterior, celulele au fost diluate de până la 10 ori folosind ser fiziologic steril (clorură de sodiu: 5,8 g/L) și a fost cultivată fiecare diluție de 100 μL pentru suprafața de agar MRS în mediu de cultură. Probele au fost incubate aerob timp de 48-72 ore la 37 ° C (Haghshenas și colab., 2015).

Toleranța la sărurile biliare a fost analizată pe baza metodei utilizate anterior de Nami și colab. (2015b). Pe scurt, mediul de cultură bulion MRS, ca martor, și MRS cu 0,3% oxal biliar, utilizat ca mediu de testare (tratamente), au fost inoculate simultan cu 1% cultură bacteriană activă la 37 ° C timp de 4 ore. Densitățile optice ale culturilor de creștere controlate și tratate au fost măsurate cu un spectrofotometru (Eppendorf, Germania) la 600 nm. Procentul de suprimare a creșterii a fost măsurat folosind următoarea formulă:

Activitatea antimicrobiană și detectarea bacteriocinei

Metoda de difuzie a puțului a fost efectuată pentru a concluziona și recunoaște metaboliții inhibitori produși de Enterococ izolate (Nami și colab., 2015a). Culturile peste noapte ale izolatelor selectate au fost cultivate în agar MRS la 37 ° C timp de 24 de ore. Bacteriile indicatoare utilizate în acest studiu au fost Shigella flexneri PTCC 1234, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Listeria monocytogenes ATCC 13932, Yersinia enterocolitica ATCC 23715, Klebsiella pneumoniae PTCC 1053, Escherichia coli PTCC, 1276 și Bacillus subtilis ATCC 19652. Aceste organisme patogene au fost achiziționate din colecția de culturi de tip persan (PTCC) pentru a detecta substanțele antagoniste. Jumătate bacterii indicator McFarland (1,5 × 108 CFU/ml) au fost turnate pe agar Mueller-Hinton și godeurile au fost tăiate pe plăci. Apoi, fiecare godeu a fost umplut cu 50 μL de supernatant filtrat și plăci incubate peste noapte la 37 ° C și, în cele din urmă, zona de inhibare din jurul godeurilor a fost măsurată cu etriere digitale.

S-a evaluat natura proteică a inhibiției. În acest scop, supernatanții activi de cultură fără celule au fost obținuți prin centrifugare la 15000 RPM timp de 12 minute la 4 ° C. Aceștia au fost supuși diferitelor tratamente enzimatice, inclusiv catalază, tripsină, a-chimotripsină și proteinază K, la 1 mg/ml la 37 ° C timp de 2 ore, după ajustarea pH-ului la 6,2 cu 1 M de NaOH. Apoi, activitatea reziduală a fost evaluată împotriva microorganismelor patogene. Sensibilitatea la protează a fost determinată de absența zonelor de inhibare în jurul godeurilor. Pentru a confirma prezența peroxidului de hidrogen, supernatantele active au fost supuse catalazei sterilizate (1 mg/ml) și incubate la 37 ° C timp de 2 ore și în cele din urmă activitățile lor au fost evaluate prin metoda de difuzare a puțului.

Amplificarea PCR a genelor de enterocină cunoscute

Toate genele structurale implicate în expresia unor enterocine bine cunoscute EntA, EntB, EntP, EntL50A, EntL50B, Ent31 (Toit și colab., 2000), EntQ (Belgacem și colab., 2010) și Ent1071 (Omar și colab., 2004) au fost amplificate cu primeri PCR specifici (Tabelul 2). Amplificarea PCR a fost efectuată la un volum final de 50 μL care conținea 1 tampon de polimerază Taq, 200 μM de dNTP, 25 pM de fiecare primer, 2 μL de ADN șablon (stoc) și 1 U de ADN polimerază Taq, Thermo Fisher Scientific, United State). Produsele PCR au fost vizualizate prin electroforeză pe geluri de agaroză 2%.

masa 2. Grunduri utilizate pentru amplificarea PCR a factorilor de virulență și a genelor de detectare a enterocinei în tulpinile Enterococcus.

Exopolizaharidă (EPS) Producție

Metoda folosită de Fguiri și colab. (2016) a fost utilizat pentru evaluarea capacității de producție a EPS a izolatelor. Pe scurt, culturile au fost striate pe mediu de agar m-MRS care a fost modificat prin înlocuirea glucozei cu 100 g/L zaharoză și incubate la 37 ° C timp de 24 de ore aerob. Bucla metalică a fost folosită pentru a trage în sus coloniile formate. Dacă lungimea mamei a fost mai mare de 1,5 mm, izolatul a fost considerat producător de zăpadă pozitiv.

Hidrofobicitatea suprafeței celulare

Capacitatea de aderență a izolatelor la xilen a fost determinată așa cum a fost descrisă anterior de Mishra și Prasad (2005).

Autoagregare și coagregare

Capacitatea izolatelor de auto-agregare a fost realizată în conformitate cu metoda descrisă de Angmo și colab. (2016). Procentul de agregare automată a fost determinat folosind următoarea ecuație:

Unde A0 reprezintă absorbanță la t = 0 și la reprezintă absorbanță la timpul t.

Coagregarea de Enterococ izolatele împotriva celor șapte agenți patogeni s-au efectuat la 37 ° C după 4 ore de incubare pe baza metodei utilizate de Zuo și colab. (2016). Procentul de coagregare a fost calculat pe baza ecuației:

Abilitatea de adeziune la celulele intestinale umane

Capacitatea de adeziune la celulele carcinomului de colon uman (Caco-2) a fost evaluată așa cum a fost raportat anterior de Nami și colab. (2014). Pe scurt, mediul Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640; Sigma), suplimentat cu 10% ser fetal bovin inactivat termic, a fost utilizat pentru cultivarea celulelor umane. Celulele au fost cultivate pe plăci de cultură tisulară cu 24 de godeuri și incubate la 37 ° C în 5% CO2 într-o atmosferă relativ umedă până la obținerea unui monostrat confluent. Celulele viabile Caco-2 au fost numărate într-o cameră de hematocitometru Burker. Apoi, suspensia celulară, inclusiv bacteriile și celulele Caco-2, a fost supusă unei tehnici de placă pură pentru a determina C.F.U. adeziunea bacteriilor a fost exprimată ca numărul total de bacterii atașate la celulele Caco-2 viabile.

Asimilarea colesterolului

Procentul de îndepărtare a colesterolului a fost determinat prin metoda o-ftalaldehidă descrisă de Rudel și Morris (1973) cu o anumită modificare. Un bulion MRS proaspăt preparat a fost suplimentat cu 0,3% oxgall (Merk Germany), deoarece sarea biliară și colesterolul solubil în apă (150 μg/ml) a fost adăugat ca sursă de colesterol (sterilizat prin filtrul de 0,2 μL), amestecul inoculat cu fiecare izolat la Nivel 1% și incubat anaerob la 37 ° C timp de 20 de ore. Celulele au fost îndepărtate prin centrifugare (10000 rpm timp de 15 minute) după perioada de incubație; ulterior, 1 mL de bulion fără celule a fost amestecat cu 1 mL KOH (33% W/V) și 2 mL etanol 96%, vortexat timp de 2 min, urmat de încălzire la 60 ° C timp de 15 min. Amestecurile răcite la temperatura camerei, 2 ml apă distilată și 3 ml hexan au fost adăugate și agitate timp de 1 min. Un ml de strat de hexan a fost transferat într-un tub de sticlă și evaporat într-o baie de apă la 80 ° C. Reziduul a fost imediat dizolvat în 2 ml o-reactiv ftalaldehidă (Merck, Germania), urmat de 0,5 ml acid sulfuric concentrat și agitat complet timp de 1 min. Probele au fost incubate la temperatura camerei timp de 30 min și în cele din urmă absorbanța a fost citită la 550 nm.

Activitatea β-galactozidazei

Activitatea β-galactozidază a Enterococ izolate a fost evaluată în conformitate cu Angmo și colab. (2016). Culturile bacteriene au fost striate pe plăci de agar MRS conținând 60 μL X-gal (5-bromo-4-clor-3-indolil-β-D-galactopiranozidă) și 10 μL de IPTG (iso-propil-tio-β-D-galactopiranozidă )) soluție ca inductor. Prezența activității β-galactozidazei în tulpini a fost determinată după 42 de ore de incubare la 37 ° C.

Evaluarea siguranței

Activitate hemolitică

Activitatea hemolitică a Enterococ izolatele au fost examinate prin cultivarea de culturi proaspete peste noapte pe plăci de agar Columbia (Oxoid) conținând 7% (v/v) sânge de oaie (Oxoid) și incubate timp de 48 de ore la 37 ° C. În cele din urmă, activitățile hemolitice au fost detectate de 3 categorii: apariția unui halou în jurul coloniei: zona verzui considerată ca α-hemoliză, zonă liberă pentru β-hemoliză și fără halo pentru hemoliza γ (Abedi și colab., 2018).

Hidroliza sărurilor biliare

Hidroliza sării biliare a fost evaluată în conformitate cu Argyri și colab. (2013). Activitatea de hidroliză a fost indicată de 0,5% (greutate/volum) acid taurodeoxicolic după 48 de ore de incubare la 37 ° C. Activitatea de hidroliză a fost evaluată prin formarea de halouri de agar opace în jurul coloniilor.

Detectarea factorilor de virulență

Amplificarea PCR a fost efectuată pentru a detecta genele care codifică potențiali factori de virulență. ADN-ul bacterian total a fost izolat prin metoda descrisă de Leenhouts și colab. (1990). Genele de virulență evaluate în acest studiu au fost cylA, clyB, esp, gelE, asa1, Ace, efaAfs, și cpd. E. faecium ATCC 51299 a fost utilizat ca control. Amplificarea PCR a fost efectuată pentru a detecta genele care codifică acești factori folosind mai mulți primeri (Tabelul 2). Amplificarea PCR a fost efectuată în tuburi de reacție de 0,2 mL fiecare cu 25 μL de amestecuri folosind 0,1 mM de trifosfați deoxinucleozidici, 2,5 mM de MgCl2, 0,5 mM de fiecare primer, tampon PCR (1X), 2 U de Taq polimerază și 50 ng/μL de șablon ADN. Amplificările PCR au fost efectuate cu un ciclu de denaturare inițială (94 ° C timp de 5 min), urmat de 32 de cicluri de denaturare (94 ° C timp de 60 s), recoacere la o temperatură adecvată (Tabelul 2) timp de 60 s și alungire (72 ° C timp de 5 minute). Produsele PCR au fost analizate prin electroforeză pe gel în 1,5% agaroză colorată cu bromură de etidiu (0,5 g/ml).

Susceptibilitatea la antibiotice

Testul de sensibilitate la antibiotice a fost efectuat pe baza metodei descrise anterior de Haghshenas și colab. (2014). Pe scurt, testul de difuzie a discului a fost efectuat pentru a determina sensibilitatea la antibiotice a izolatelor. Pentru acest test a fost utilizat mediul de agar MRS. Discuri antimicrobiene (5 mm) au fost achiziționate de la Padtan Teb Co., Iran. Antibioticele testate au fost vancomicină (30 μg), colistină (10 μg), streptomicină (10 μg), cefepimă (30 μg), cefiximă (15 μg), sulfametoxazol (2 μg), kanamicină (30 μg), ciprofloxacină (5 μg ).), tetraciclină (30 μg), eritromicină (15 μg), ampicilină (10 μg), gentamicină (10 μg), clindamicină (30 μg), ceftriaxonă (30 μg), cloramfenicol (30 μg) și cefalexină (30 μg), folosind metoda de difuzie a discului. După incubare peste noapte la 37 ° C, s-a măsurat diametrul inhibiției (mm) în jurul fiecărui disc.

Secvențierea genei 16S-rDNA

Amplificarea genei 16S-rDNA (1500 pb) a izolatului a fost realizată utilizând o pereche de primeruri universale specifice bacteriilor lactice (LAB) (Hal6F/Hal6R) (F: 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3 'și R: 5' -TACCTTGTTAGGACTTCACC-3 ′) descris anterior de Haghshenas și colab. (2016). Amplificarea PCR a fost îndeplinită pentru volumul total de 50 μL în următoarele condiții: denaturarea inițială la 94 ° C timp de 5 min, urmată de 35 de cicluri de denaturare la 94 ° C timp de 45 s, recoacere la 59 ° C timp de 60 s, extindere la 72 ° C timp de 90 s și o etapă finală de extensie la 72 ° C timp de 10 min. Produsele PCR au fost vizualizate prin 1% (greutate/volum) gel de agaroză (Sigma Chemical Co., Poole, Marea Britanie) electroforeză și colorate prin bromură de etidiu. Produsele PCR au fost trimise Serviciului de Secvențiere ADN Macrogen (Coreea) pentru a fi secvențiate. Alinierea secvenței multiple a genelor ARNr 16S a fost efectuată utilizând funcția CLUSTAL W (Thompson și colab., 1994) cu parametrii impliciți, iar un arbore filogenetic al genelor ARNr 16S a fost reconstruit folosind metoda de îmbinare vecină (Saitou și Nei, 1987) implementată în software-ul MEGA X (Kumar și colab., 2018) cu distanța parametrului p-distance. Valorile bootstrap au fost calculate cu 1.000 de eșantioane. Secvența genei ARNr 16S a Lactobacillus acidophilus (LC064893.1) a fost utilizat ca grup extern pentru analiză.

Analize statistice

Analiza statistică a datelor a fost efectuată utilizând SPSS (Ver. 19.0 SPSS, Chicago, IL, Statele Unite). Comparațiile diferențelor dintre mijloacele tratamentelor au fost analizate de ANOVA unidirecțional la un nivel de semnificație de P a-g Semnificațiile din aceeași culoare cu litere mici mici au diferit semnificativ (p Cuvinte cheie: Enterococ, proprietăți probiotice, produse lactate, colesterol scăzut, activitate antimicrobiană, evaluarea siguranței, enterococ ca probiotice, factori de virulență

Citație: Nami Y, Vaseghi Bakhshayesh R, Mohammadzadeh Jalaly H, Lotfi H, Eslami S și Hejazi MA (2019) Proprietăți probiotice ale Enterococ Izolat de produse lactate artizanale. Față. Microbiol. 10: 300. doi: 10.3389/fmicb.2019.00300

Primit: 26 septembrie 2018; Acceptat: 04 februarie 2019;
Publicat: 26 februarie 2019.

Learn-Han Lee, Universitatea Monash Malaezia, Malaezia

Sergio Enrique Pasteris, Universitatea Națională din Tucumán, Argentina
Konstantinos Papadimitriou, Universitatea Agricolă din Atena, Grecia