Simbioze microbiene

Editat de
Zhongtang Yu

Universitatea de Stat din Ohio, Statele Unite

Revizuite de
Nadia Everaert

Universitatea din Liège, Belgia

Xianyong Ma

Academia de Științe Agricole din Guangdong (GDAAS), China

Afilierile editorului și ale recenzenților sunt cele mai recente oferite în profilurile lor de cercetare Loop și este posibil să nu reflecte situația lor în momentul examinării.

frontierele

  • Descărcați articolul
    • Descărcați PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Suplimentar
      Material
  • Citarea exportului
    • Notă finală
    • Manager de referință
    • Fișier TEXT simplu
    • BibTex
DISTRIBUIE PE

Cercetare originală ARTICOL

  • 1 Departamentul de științe veterinare și animale, Facultatea de Științe medicale și a sănătății, Universitatea din Copenhaga, Frederiksberg, Danemarca
  • 2 Departamentul pentru bacterii, paraziți și ciuperci, Statens Serum Institute, Frederiksberg, Danemarca
  • 3 Departamentul de Științe Alimentare, Facultatea de Științe, Universitatea din Copenhaga, Frederiksberg, Danemarca
  • 4 Departamentul de Medicină Clinică, Universitatea Aarhus, Aarhus, Danemarca

Introducere

Tractul gastrointestinal porcin (GIT) adăpostește o populație microbiană diversă și dinamică, care este implicată în maturarea intestinului, funcția barierei imune și patogene, sinteza vitaminelor și metabolismul anumitor componente dietetice (Kim și Isaacson, 2015; Blacher și colab., 2017; Holman și colab., 2017). Aceste efecte fac ca microbiota intestinală (GM) să aibă o importanță majoră pentru fiziologia digestivă și sănătatea generală a porcilor (Pluske și colab., 2018).

Compoziția GM diferă de-a lungul GIT în funcție de funcția asociată fiecărui segment individual. Funcția principală a intestinului subțire este digestia și absorbția enzimatică a alimentelor, digestia trecând în 3-4 ore la porci (Sciascia și colab., 2016), făcând microbii ileali terminali asociați în principal cu digestia enzimatică (Quan și colab., 2018). În schimb, cecumul și colonul acționează ca principalii bioreactori ai GIT, unde digesta este reținută timp de 1-2 zile (Sciascia și colab., 2016). Cecul prezintă capabilități multi-metabolice diverse, iar genele asociate cu metabolismul proteinelor, metabolismul vitaminelor și metabolismul polichidelor sunt reglate în sus (Quan și colab., 2018). În contrast, colonul este în principal asociat cu fermentarea carbohidraților și crește disponibilitatea nutrienților către gazdă prin fermentarea polizaharidelor altfel nedigerabile, cum ar fi fibrele dietetice (Richards și colab., 2005; Quan și colab., 2018). Fermentarea are ca rezultat producerea acizilor grași cu lanț scurt (SCFA) și a altor metaboliți esențiali pentru menținerea epiteliului intestinal (Crespo-Piazuelo și colab., 2018). Producția de SCFA poate fi reglată în sus sau în jos prin modificarea dietei, de ex. prin includerea de prebiotice precum inulina, care va crește producția de SCFA.

Inulina este o polizaharidă, produsă adesea comercial din rădăcini de cicoare, care trece în mare parte nedigerată prin intestinul subțire și este fermentată de bacterii zahararolitice din intestinul gros (Metzler-Zebeli și colab., 2017). Inulina este privită ca un prebiotic datorat fermentației, care la om conferă beneficii pentru sănătate din bacterii, cum ar fi Faecalibacterium prausnitzii, niste Roseburia spp. și Eubacterium rectale care produc butirat prin hrănire metabolică încrucișată (De Vuyst și Leroy, 2011; Poeker și colab., 2018). Aceste bacterii pot fi considerate bacterii benefice datorită proprietăților lor care produc SCFA și pot proteja gazda de inflamația mucoasei (Kostic și colab., 2014). Cu toate acestea, efectele inulinei dietetice la porci sunt mai puțin bine definite, dar studiile indică faptul că inulina oferă protecție împotriva agenților patogeni, îmbunătățește creșterea și eficiența hranei și modulația microbiotei intestinale (Grela și colab., 2016; Metzler-Zebeli și colab., 2017; McCormack și colab., 2019). Inulina crește diversitatea bacteriană și abundența relativă a Clostridiaceae și reduce abundența relativă a Escherichia, indicând un potențial efect benefic (Sattler și colab., 2014). În plus, inulina alimentară stimulează selectiv creșterea bifidobacteriilor care produc acetat și lactat (Patterson și colab., 2010).

Studii recente au arătat că paraziții atât ai animalelor, cât și ai oamenilor pot modula compoziția GM (Jenkins și colab., 2017; Peachy și colab., 2017; Leung și colab., 2018). Studiile au indicat o reducere a abundenței bacteriilor care utilizează carbohidrați în colonul proximal al porcilor în zilele 21 și 53 după infecția experimentală cu Trichuris suis, viermele porc, care a persistat cel puțin pe termen scurt după expulzarea spontană a viermilor din cauza imunității dobândite (Kringel și Roepstorff, 2006; Li și colab., 2012; Wu și colab., 2012). Folosind Trichuris muris-șoarecii infectați, alții, au arătat că modificările majore ale GM au loc după ziua 20 după infecție (p.i.) cu o scădere a diversității bacteriene fecale și cecale (Holm și colab., 2015; Houlden și colab., 2015). în plus, Ascaris suum, viermele rotund porcin, a scăzut diversitatea microbiană în timp ce abundența genurilor Prevotella și Faecalibacterium a fost semnificativ crescută, cu o reducere a metabolismului glucidic în colonul proximal (Wang și colab., 2019). În plus, A. suum se știe că eliberează factori antimicrobieni care pot afecta direct creșterea bacteriană în intestinul gazdă (Midha și colab., 2019). Astfel, este clar că există o legătură directă între nematodele gastrointestinale și mediul microbian al intestinului gazdă.

Deoarece mulți paraziți se află în nișa de mediu în care are loc fermentarea microbiană a produselor dietetice (cecum/colon), dieta poate avea un impact profund asupra populațiilor de paraziți. Includerea dietetică a carbohidraților fermentabili a scăzut astfel numărul de ouă fecale, fecunditatea și mărimea femeilor și o reducere cu până la 97% a sarcinii viermilor unui alt helmint intestinal., Oesophagostomum dentatum (vierme nodular porcin) (Petkevicius și colab., 2001, 2003). În consecință, perfuzia cecală de SCFA și acid lactic în ziua 7 p.i. redus O. dentatum numărul de ouă fecale și recuperarea viermilor cu 98 și respectiv 92% (Petkevicius și colab., 2004). S-au observat efecte similare ale inulinei dietetice cu T. suis (Petkevicius și colab., 2006). Cu toate acestea, alte studii nu au arătat niciun efect asupra T. suis o dimensiune redusă și o expulzare mai timpurie decât de obicei a viermilor (Thomsen și colab., 2005) sau chiar o creștere a numărului de T. suis la porcii hrăniți cu rădăcini de cicoare bogate în inulină (Jensen și colab., 2011).

Am arătat recent asta T. suis și inulina îmbunătățesc sinergic răspunsurile imune antiinflamatorii ale mucoasei prin suprimarea genelor pro-inflamatorii cum ar fi INFG și CXCL9 (Myhill și colab., 2018). Scopul prezentului studiu a fost, prin urmare, de a elucida efectele interacțiunii dintre inulina alimentară și infecția cu paraziți asupra microbiotei fecale gazdă timp de 4 săptămâni și compoziția microbiotei luminale a gazdei de-a lungul GIT porcin la necropsie.

Materiale și metode

Animale și design de studiu

În timpul perioadei de studiu experimental de 6 săptămâni, porcii au fost adăpostiți în stilouri solide cu podea din beton, cu furaje furnizate de două ori pe zi și apă disponibil ad libitum. Verificările de bunăstare au fost efectuate zilnic, iar consistența fecală și BW au fost înregistrate săptămânal. Trei porci au fost excluși în timpul perioadei de studiu din cauza Lawsonia-enterită. Cei trei porci au provenit din grupurile C și I + Ts (ambii eutanasiați ziua 7 p.i.) și din grupul I (ziua eutanasiați 14 p.i.).

Studiul a fost aprobat de Inspectoratul Danez de Experimentare a Animalelor (Nr. De licență: 2015-15-0201-00760) și efectuat la Unitatea Experimentală pentru Animale, Universitatea din Copenhaga, în conformitate cu recomandările și recomandările FELASA.

Prelevarea de probe și extragerea ADN-ului

Probele de fecale rectale de la fiecare porc au fost colectate la ferma de origine (ziua-18 p.i.) și în grajdurile noastre în zilele 0, 14 și 28 p.i. și imediat s-a răcit pe gheață; subprobe individuale de 0,25 g au fost depozitate la -80 ° C. În ziua 28 pi, 0,25 g de subșantioane de digeste bine omogenizate din ileon (luate 10 cm oral la joncțiunea ileo-cecală), cecum (capătul orb), proximal (20 cm aboral de la joncțiunea ileo-cecal) și colonul distal (la jumătatea distanței dintre cecum și rect) au fost colectate de la fiecare porc și ținute pe gheață înainte de transfer la -80 ° C în decurs de 1 oră. Toate probele colectate în timpul studiului au fost supuse extracției ADN folosind kitul Mobio PowerSoil (Mobio Laboratories, CA, Statele Unite), urmând protocolul producătorului. ADN-ul extras a fost stocat la -20 ° C până la o analiză ulterioară. Probele din colonul proximal au fost, de asemenea, investigate prin cromatografie gazoasă pentru concentrațiile de SCFA, așa cum este descris de Myhill și colab. (2018).

Pregătirea bibliotecii și secvențierea ampliconului ARNr 16S

Un total de 256 de probe au fost supuse secvențierii ampliconului genei ARNr 16S. Pregătirea bibliotecii a constat din trei etape: (1) O reacție în lanț polimerază inițială cu 20 de cicluri (PCR), care a vizat regiunea V3 - V4 a genei 16s rRNA, (2) un al doilea PCR cu 20 de cicluri, care a încorporat grunduri specifice cu adaptoare și indici în ampliconi și (3) curățarea și normalizarea pe bază de margele magnetice, urmate de punerea în comun și secvențierea folosind un MiSeq (Illumina, San Diego, CA, Statele Unite) la Statens Serum Institut (Copenhaga, Danemarca) ). O explicație amănunțită a celor trei pași înainte de secvențiere poate fi vizualizată în Myhill și colab. (2018).

Înainte de PCR inițială, concentrația de ADN a fost măsurată pentru fiecare probă utilizând spectrofotometrul Nanodrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, DE, Statele Unite) și s-a normalizat la 10 ng/μL. Deoarece toate cele 256 de probe au fost rulate într-o singură etapă de secvențiere, primerii utilizați pentru etapa inițială de PCR au încorporat inserții cu lungimea de 0-19 nucleotide în primerii 388F (5′-ACTCCTAYGGGRBGCASCAG-3 ′) și 588R (5′-AGCGTGGACTACNNGGGTATCTAAT- 3 ′), care a rezultat în 16 combinații de primer (tabelul suplimentar S2) și un amplicon de aproximativ 420 nucleotide. Nucleotidele inserate au forțat un raport 1: 1: 1: 1 de A: T: C: G pentru primele 20 de cicluri de secvențiere, ceea ce a asigurat o complexitate sporită în conformitate cu principiile secvențierii ampliconului în etape (Wu și colab., 2015) .

Cartarea secvenței

Analize ale diversității alfa și beta

Analizele diversității alfa și beta au fost efectuate folosind QIIME (v1.9.1). Măsurile de diversitate alfa pentru o specie observată (similaritate oligo 96%) au fost calculate pentru tabelele de abundență rarefiată (90.000 de citiri pe eșantion) utilizând fluxul de lucru alfa de rarefacție urmat de scriptul „comparați diversitățile alfa” cu non-parametric t-test (QIIME v1.9.1). Graficele de analiză a coordonatelor de principiu non-filogenetic (PCoA) au fost generate pe baza a 10 matrici la distanță folosind 10 tabele de abundență submasionate. Numărul de secvențe luate pentru fiecare subset cuțit a fost stabilit la 90% din numărul secvenței din toate eșantioanele (100.000 citiri/eșantion). Matricele de distanță Sorensen-Dice (SD; prezența/absența speciilor) și Bray Curtis (BC; abundența speciilor prezente) au fost calculate pe tabele de abundență rarefiate (90.000 citiri pe eșantion) și testate pentru separarea între grupuri la fiecare moment și prin fiecare segment intestinal folosind Analiza asemănărilor (ANOSIM) și Analiza permutationala a variației multivariate (PERMANOVA) cu 999 permutări (rezultatele PERMANOVA sunt prezentate numai în tabelul suplimentar S3). Distribuția relativă a filelor și familiilor înregistrate a fost calculată pe baza tabelului de abundență normalizată și rezumată la tabelele de abundență la nivel de fil și familie.

Analiza compoziției microbilor

Pentru a analiza diferențele de taxoni bacterieni între cele patru grupuri, a fost utilizată Analiza compoziției microbilor (ANCOM). Analiza a fost efectuată în Rstudio (v1.1.383) cu un nivel de semnificație de 0,05 și corecție pentru ajustarea testelor multiple stabilite la multcorr = 2. Cele patru grupuri au fost comparate între ele folosind ANCOM pentru fiecare punct de timp (microbiota fecală: zile -18, 0, 14 și 28 pi) și pentru fiecare segment intestinal în ziua 28 (ileon, cec, proximal și colon distal).

Rezultate

Inulina dietetică nu a afectat stabilirea viermilor

Infecție stabilită la toți porcii inoculați. Grupurile Ts și I + Ts au avut sarcini medii ale viermilor (toți viermii erau imaturi) de 4.352 ± 2.079 și, respectiv, 3.838 ± 1.020 (± SD)p > 0,05) (Myhill și colab., 2018), indicând nicio diferență în stabilirea viermilor în ziua 28 p.i. indiferent de suplimentarea dietetică cu inulină.

Date secvențiale globale

Un total de 23.275.094 citiri au fost obținute pentru 254 probe din patru puncte de timp și patru segmente intestinale distincte, cu o medie de 91.634 citiri pe probă. După tunderea datelor, calitatea și filtrarea himerei, au fost achiziționate 5.086.207 secvențe de înaltă calitate cu o medie de 20.024 secvențe pe eșantion (interval 10.417-33.789) înainte de a se scala la 100.000 secvențe/eșantion pentru scoruri normalizate. Secvențele au fost adnotate la 666 de specii independente aparținând 355 genuri, 160 familii, 59 ordine, 41 clase și 19 filuri. Douăsprezece probe cu mai puțin de 10.000 de secvențe au fost eliminate din setul de date înainte de o analiză suplimentară.

Diversitatea alfa a fost neafectată de T. suis Infecție sau inulină

Nu s-au găsit diferențe semnificative în niciunul dintre indicii de diversitate alfa (Shannon, chao1 și numărul speciilor observate) în timp pentru oricare dintre cele patru grupuri (p > 0,05) și, de asemenea, nu s-au observat diferențe între grupuri pentru niciunul dintre segmentele intestinalep > 0,05). Nu au existat diferențe semnificative între numărul mediu de specii observate în ileon și segmentele intestinului gros (LI, combinând colonul cecum, proximal și distal) în oricare dintre grupuri [ileon: 114 ± 24 (± SD); LI: 118 ± 26] (Figura suplimentară S2).

Un total de 222 de specii au fost identificate ca fiind împărțite între toate segmentele intestinale, indiferent de grup (Figura 1). În total, 136 de specii s-au dovedit a fi exclusive pentru ileon, în timp ce 23-30 de specii erau exclusive pentru fiecare segment al LI. În general, speciile găsite exclusiv într-un segment reprezentau în principal membri ai filelor Proteobacteria și Firmicutes.

figura 1. Ileonul are o cantitate mai mare de specii exclusive segmentului în comparație cu intestinul gros. Numărul de specii microbiene partajate între segmentele intestinale și speciile exclusive pentru fiecare segment. Toate cele patru grupuri sunt incluse pentru fiecare segment. Taxonomia speciilor exclusive găsite în fiecare segment intestinal (ileon, cecum, proximal și colon distal) sunt reprezentate de diagrame.

Inulină și T. suis S-a schimbat microbiota fecală în timp

Diferențele compoziționale ale microbiotei fecale între grupuri au fost observate pe parcursul experimentului. Inițial, cele patru grupuri au fost similare în compoziția microbiotei, cu excepția grupurilor I vs. I + Ts (S-D: p = 0,02, R = 0,23 și BC: p = 0,03, R = 0,33) (Tabelul suplimentar S4 și Figura 2A). Cu toate acestea, după 14 zile de suplimentare, aceste grupuri au fost similare în compoziție (S-D: p = 0,63, R = 0,00), iar cele patru grupuri separate în două clustere distincte pe baza suplimentelor alimentare (Figura 2B, S-D și BC: p Cuvinte cheie: microbiotă intestinală, infecție cu helminți, secvențierea ARNs 16s, prebiotice, porcine

Citație: Stolzenbach S, Myhill LJ, Andersen LO’B, Krych L, Mejer H, Williams AR, Nejsum P, Stensvold CR, Nielsen DS și Thamsborg SM (2020) Inulină dietetică și Trichuris suis Infecția promovează bacterii benefice în intestinul porcin. Față. Microbiol. 11: 312. doi: 10.3389/fmicb.2020.00312

Primit: 10 iulie 2019; Acceptat: 12 februarie 2020;
Publicat: 04 martie 2020.

Zhongtang Yu, Universitatea de Stat din Ohio, Statele Unite

Xianyong Ma, Academia de Științe Agricole din Guangdong (GDAAS), China
Nadia Everaert, Universitatea din Liège, Belgia