Figurile și datele articolelor

Cifre

Structuri ale acidului valproic și analogi. VPA, acid valproic; Acid 2M2PP, acid 2-metil-2n-propilpentanoic; 4PA, acid 4-pentenoic; 2M2P, acid 2-metil-pentenoic; Acid 2EH, 2-etilhexanoic; VPM, valpromidă.

deacetilaza

Inhibarea histonei deacetilaze (HDAC) din clasele I și II in vitro de către acidul valproic (VPA) și analogi. A, HDAC-uri marcate cu epitop 1, 6 și 7 au fost exprimate în celule 293T, imunoprecipitate și testate pentru activitatea HDAC in vitro în prezența 0,3-20 m m VPA. Activitatea HDAC este reprezentată ca procent din activitatea totală a fiecărui HDAC. Fiecare punct de date afișat reprezintă activitatea medie HDAC din cel puțin trei experimente independente. B, HDAC1 marcat cu Myc a fost exprimat în celule 293T, imunoprecipitat și testat cu fiecare dintre analogii VPA (0,1-20 m m); au fost reprezentate mijloacele a cel puțin trei experimente.

Inhibarea histonei deacetilaze de către acidul valproic (VPA) și analogii VPA în celulele cultivate. Celulele A, U937 au fost tratate cu 0,1-2 m m VPA timp de 18 ore pentru a arăta răspunsul la doză pentru acetilarea histonei (panoul din stânga). Celulele K562 (panoul din dreapta) au fost tratate cu 1 m m VPA și recoltate la momentele indicate pentru a evalua cursul de timp pentru hiperacetilarea histonelor prin VPA. În fiecare caz, histonele au fost izolate și imunoblotate pentru histona acetilată H3 sau colorate cu Coomassie Blue pentru a arăta cantitatea totală de histone din fiecare probă. Celulele B, K562 au fost tratate cu analogi VPA de 2 m m timp de 24 de ore; histonele au fost izolate și imunoblotate pentru histona acetilată H4 și histona totală H4. Celulele C, 293T au fost transfectate cu reporterul SV40-luciferază, iar a doua zi, celulele au fost împărțite în plăci cu 6 godeuri și tratate cu analogi VPA 0,5-2 m m timp de 24 de ore. Activitatea luciferazei a fost măsurată în lizatele celulare și reprezentată grafic ca unități relative de luciferază. Celulele D, K562 au fost tratate cu 1 m m VPA și analogi timp de 24 de ore. Lizatele celulare au fost imunoblotate pentru p21, gelsolin și hnRNP-K (control de încărcare).

Acetilarea histonelor asociate cu promotorul p21 și inducerea ARNm p21 după tratamentul cu acid valproic și analogi. Celulele K562 au fost tratate cu acid valproic și analogi timp de 24 de ore și evaluate pentru acetilarea histonei H4 asociată cu promotorul p21 prin testul de imunoprecipitare a cromatinei (cantitativ prin PCR în timp real) sau pentru nivelurile de ARNm prin transcripție inversă în timp real-PCR. Creșterea de ori a acetilării histonei H4 asociată cu promotorul p21 a fost reprezentată grafic pe axa X și inducerea ori a nivelurilor de ARNm p21 a fost reprezentată de-a lungul axei Y. Datele sunt reprezentate ca mijloace de testare triplicate în fiecare caz. Experimentele s-au repetat de trei ori (imunoprecipitare cu cromatină) sau de două ori (transcripție inversă-PCR) cu rezultate similare.

Acidul valproic (VPA) induce diferențierea în celulele U937. Celulele U937 au fost tratate cu VPA timp de 6 zile și analizate pentru exprimarea markerilor de suprafață CD11a, CD11b, CD11c, CD18 și CD64 de către FCM. Histogramele sunt prezentate pentru celulele tratate cu 0 (linii solide), 0,5 (linii punctate) și 1 m m VPA (linii punctate) și sunt reprezentative pentru cel puțin trei experimente independente pentru fiecare marker.

Inducerea diferențierii în celulele U937 de acidul valproic (VPA) și analogii VPA. Celulele A, U937 au fost tratate cu VPA de 2 m m sau analogi VPA și analizate pentru exprimarea CD11b de către FCM. Procentul de celule CD11b-pozitive (ca medie a probelor triplicate) ± SD a fost reprezentat grafic. Celulele B, U937 au fost tratate cu VPA și analogi și evaluate pentru inducerea CD13 de către FCM. Intensitățile medii au fost reprezentate grafic pentru concentrațiile indicate de VPA și analogi. Celulele C, U937 au fost tratate cu VPA și analogi și evaluate pentru exprimarea HLA-DR de către FCM. Intensitățile medii au fost reprezentate grafic pentru concentrațiile indicate de VPA și analogi.

p21 este necesar pentru inducerea diferențierii de acid valproic (VPA) în celulele U937. A, linii celulare U937 stabile care exprimă fie antisens p21 (p21AS), fie control vector gol (CON; Ref. 24) au fost tratate cu 0,25-2 m m VPA timp de 24 de ore și imunoblotate pentru p21 sau hnRNP-K (control de încărcare). O inducție dependentă de doză a p21 este evidentă în celulele martor, dar nu și în celulele antisens p21. Celulele B, martor și antisens au fost tratate cu 0,1-1 m m VPA timp de 6 zile și analizate pentru exprimarea CD11b de către FCM. CD11b a fost indus în celulele martor, dar nu și în celulele antisens p21. Inducerea ori a intensității medii a CD11b ± SD a fost reprezentată grafic. Rezultatele sunt reprezentative pentru trei experimente. Celulele C, martor și 0,5 m m tratate cu VPA U937 au fost analizate pentru exprimarea CD11b în zilele 1-5 și 7. Expresia CD11b a crescut în control, dar nu celule antisens p21 tratate cu VPA. Datele sunt reprezentate ca inducție de intensitate medie a CD11b după tratamentul cu VPA; fiecare punct de date este media triplicelor ± SD.

Inducerea diferențierii eritrocitare în celulele K562 de acid valproic (VPA) și analogi. Celulele A, K562 au fost tratate cu concentrațiile indicate de VPA și evaluate pentru exprimarea hemoglobinei fetale (HbF) de către FCM. Rezultatele reprezentative din trei experimente independente au fost reprezentate grafic ca inducție a intensității medii a hemoglobinei fetale ± SE. B, expresia glicoforinei A în celulele K562 tratate cu VPA sau analogi VPA a fost evaluată de FCM și reprezentată grafic ca intensitate medie. Rezultatul este reprezentativ pentru trei experimente independente. C, procentul de celule benzidin-pozitive (de 300 de celule numărate) după tratamentul cu analogi VPA la concentrațiile indicate. Rezultatul prezentat este reprezentativ pentru trei experimente.

Activarea rapidă a protein kinazei activate cu mitogen (MAPK) în celulele tiroidei de șobolan Wistar (WRT) de către analogii acidului valproic (VPA). Celulele A, WRT au fost tratate cu VPA de 2 mm și butirat de sodiu (NaBu), recoltate la momentele indicate, electroforizate pe 10% SDS-PAGE și imunoblotate pentru MAPK fosforilat (fosfo-MAPK), care reflectă și activarea MAPK. în ceea ce privește actina (controlul încărcării). Celulele B, WRT au fost tratate cu analogi VPA de 2 m m, recoltate după 2 și 5 minute și imunoblotate pentru fosfo-MAPK și actină (controlul încărcării).

Mese

Inhibarea HDAC-urilor de clasa I și II a de către VPA

HDAC-urile au fost exprimate în celule 293T, imunoprecipitate și testate cu VPA în testul HDAC in vitro (așa cum este descris în Fig. 2); mijloacele pentru activitatea HDAC la fiecare concentrație de inhibitor din trei experimente independente au fost reprezentate grafic și utilizate pentru a calcula valorile IC50 pentru fiecare HDAC.

ClassEnzymeIC50 (m m)
EuHDAC10,7
EuHDAC20,8
EuHDAC31
II subclasa IHDAC41.5
II subclasa IHDAC51
II subclasa IIHDAC6> 20
II subclasa IHDAC71.3
II subclasa IIHDAC10> 20

un HDAC, histon deacetilaza; VPA, acid valproic.

Inhibarea HDAC-urilor de clasa I și II a de către analogii VPA

HDAC-urile imunoprecipitate au fost testate cu analogi VPA în testul HDAC in vitro (ca mai sus); mijloacele pentru activitatea HDAC la fiecare concentrație de inhibitor din trei experimente independente au fost reprezentate grafic și utilizate pentru a calcula valorile IC50 pentru fiecare HDAC (așa cum este descris în Fig. 2 și Tabelul 1). Activitatea HDAC endogenă din extractele nucleare ale celulei HeLa a fost, de asemenea, testată cu fiecare inhibitor.

InhibitorHDAC (IC50, m m)HDAC1HDAC2HDAC7
NaBu0,30,40,3
VPA0,70,81.3
4PA2.311
2EH2.32.51.9
2M2PP7.57.88.5
2M2P151515
VPM> 20> 20> 20

un HDAC, histon deacetilaza; NaBu, butirat de sodiu; VPA, acid valproic; 4PA, acid 4-pentenoic; Acid 2EH, 2-etilhexanoic; Acid 2M2PP, acid 2-metil-2-propilpentanoic; Acid 2M2P, 2-metil-2-pentenoic; VPM, valpromidă.