B. Anne Croy

1 Departamentul de Anatomie și Biologie Celulară, Universitatea Queen’s, Kingston ON Canada K7L 3N6

Suzanne D. Burke

1 Departamentul de Anatomie și Biologie Celulară, Universitatea Queen’s, Kingston ON Canada K7L 3N6

Valerie F. Barrette

1 Departamentul de Anatomie și Biologie Celulară, Universitatea Queen’s, Kingston ON Canada K7L 3N6

Jianhong. Zhang

1 Departamentul de Anatomie și Biologie Celulară, Universitatea Queen’s, Kingston ON Canada K7L 3N6

Kota Hatta

2 Departamentul de Microbiologie și Imunologie, Universitatea Queen’s, Kingston ON Canada K7L 3N6

Graeme N. Smith

3 Departamentul de obstetrică și ginecologie, Universitatea Queen’s, Kingston ON Canada K7L 3N6

Juares Bianco

1 Departamentul de Anatomie și Biologie Celulară, Universitatea Queen’s, Kingston ON Canada K7L 3N6

5 Laboratorul de histochimie și citochimie, Institutul de biologie, UNICAMP, Campinas, Brazilia

Aureo T. Yamada

5 Laboratorul de histochimie și citochimie, Institutul de biologie, UNICAMP, Campinas, Brazilia

Michael A. Adams

4 Departamentul de farmacologie și toxicologie, Universitatea Queen’s, Kingston ON Canada K7L 3N6

Abstract

Preeclampsia, o complicație acută a sarcinii umane, este asociată în modificarea fiziologică completă a arterelor spirale deciduale. Se crede că acest lucru promovează stresul oxidativ din perfuzia/reperfuzia placentei și restricționează creșterea placentară și fetală. Șoarecii alimfoizi (genotip Rag2 -/-/Il2rg -/-), suficienți în funcțiile celulelor dendritice și mieloide, nu au modificări arteriale spirale cu artere spirale individuale având

1,7x rezistența vasculară și 0,66x viteza sanguină a șoarecilor +/+. Placentele lor sunt hipoxice măsurabile, dar nici creșterea placentară, nici supraviețuirea fetală nu sunt afectate, iar hipertensiunea gestațională nu este văzută. Astfel, limfocitele, mai degrabă decât adaptările vasculare, par a fi contribuitorii esențiali la complicațiile clinice ale preeclampsiei.

1. INTRODUCERE

primare

Fotomicrografie a secțiunilor medii aggitale ale placentei și deciduas basalis din (A) +/ + și (B) Rag2 -/-/Il2rg -/- pe gd12. Aspectul mezometrial este în partea de sus a fiecărei imagini. Panouri (C, D) arată la o mărire mai mare, diferențele observate de obicei în decidua basalis între (A) modificat și (B) artere spirale nemodificate, respectiv. Diferențele în grosimea peretelui și diametrul lumenului pot fi cuantificate morfometric. Dintr-o serie de comparații între aceste genotipuri pe fondul BALB/c, s-a estimat că rezistența vasculară este cu 1,7x mai mare într-o arteră nemodificată la gd12 31. Colorat folosind lectina 42 DBA. DB, decidua basalis; MLAp, agregat limfoid mezometrial al sarcinii P, placentă; SA, artera spirală; TGC, celule gigantice trofoblaste; Săgețile uNK +, indică mai multe dintre populația de celule DBA + uNK foarte abundente. Barele indică măriri.

Studiile ulterioare au arătat că interferonul gamma principal de citokine derivate din celule NK (Ifng) a fost esențial în procesul pe care l-am numit modificarea arterială spirală a șoarecelui 20. Ifng, cunoscut pe scară largă ca citokină pro-inflamatorie, are efecte pleiotrofice complexe asupra multor tipuri de celule și s-a estimat că modifică expresia a 0,5% din algeni la șoareci în condiții fiziologice și patologice 21 .

Un model pentru patogeneza pre-eclampsiei în care disfuncția celulelor endoteliale (adică activarea, disponibilitatea insuficientă a moleculelor de viabilitate și factor de creștere, starea pro-coagulantă etc.) este văzută ca eveniment sistemic pivot.

2. COMPARAȚII ISTOLOGICE ÎNTRE SITURILE DE IMPLANTARE CU ȘI FĂRĂ MODIFICARE ARTERIALĂ SPIRALĂ

Așa cum se arată în Figura 1, există o diferență ușor de recunoscut între structura arterială spirală la jumătatea sarcinii (termen

19 zile) în secțiuni histologice ale locurilor de implantare a șoarecilor cu și fără limfocite. Când raportul perete la lumen este calculat pentru ambele genotipuri pe un fundal BALB/c în ziua de gestație (gd) 12 folosind specimene fixate în perfuzie, raportul Rag2 -/-/Il2rg -/- este aproape de două ori mai mare decât cel observat în (0,39 ± 0,02 versus 0,21 ± 0,009; P 31. Valoarea Rag2 -/-/Il2rg -/- nu se modifică semnificativ între gd 8 și 12, indicând stabilitatea vasului. Calculele indică faptul că rezistența în Rag2 -/-/Il2rg -/- arterele spirale ar trebui să fie

1,7 ori mai mare decât în ​​BALB/c +/+. Am efectuat un studiu de timp de la gd10 la gd18 la șoareci Rag2 -/-/Il2rg -/- și șoareci BALB/c +/+ folosind micro-ultrasunete pentru a stabili dacă există diferențe în fluxul sanguin în arterele uterine și spirale.

3. COMPARAȚII MICRO-ULTRASUNETE DOPPLER ÎNTRE SITURILE DE IMPLANTARE CU ȘI FĂRĂ MODIFICARE ARTERIALĂ SPIRALĂ

Formele de undă Doppler detectate în arterele uterine ale BALB/c +/+ s-au schimbat dinamic în timpul sarcinii, așa cum este raportat pentru șoarecii +/+ de rasa aleatorie 32. La gd2 când embrionii în stadiul morulei sunt prezenți în oviducte, viteza sistolică maximă a fost

Debitul diastolic de 2 cm/nisip a fost chiar sub 1 cm/s. După modificarea arterială spirală, viteza sistolică maximă a arterei uterine a fost

4 cm/s, o creștere de două ori care a fost stabilă în restul sarcinii. Fluxul diastolic final la gd12 a fost puțin peste 2 cm/nisip mai târziu în sarcină a ajuns la 5 cm/s. Examinarea preliminară a urmăririlor din arterele uterine Rag2 -/-/Il2rg -/- a găsit o diferență majoră față de aceste valori de control ale tulpinii după gd10. Viteza maximă a crescut pentru a atinge

9 cm/s după gd14 și apoi refuzat (Zhang și Croy, nepublicat).

Formele de undă Doppler arterială spirală au fost, de asemenea, comparate între BALB/c +/+ și Rag2 -/-/Il2rg -/- pe gd 10-18 33. Viteza medie a fost similară în ambele genotipuri pe intervalul de studiu. Indicii de pulsatilitate și rezistență ai arterelor spirale au devenit statistic mai mari în arterele spirale Rag2 -/-/Il2rg -/- nemodificate cu gd14 și au rămas ridicate la gd18 (Zhang și Croy, nepublicate).

4. EVALUAREA HIPOXIEI PLACENTALE ȘI FETALE ȘI A SUPRAVIEȚII FETALE ÎNTRE SITURILE DE IMPLANTARE CU ȘI FĂRĂ MODIFICARE ARTERIALĂ SPIRALĂ

Este posibilă evaluarea histologică a hipoxiei în țesutul animal prin infuzie de Hypoxyprobe-1 ™ (Millipore) cu puțin timp înainte de eutanasie și aplicarea reactivilor imunohistochimici pentru a detecta aductii metabolizați ai sondei. Am comparat situsurile de implantare ale șoarecilor Rag2 -/-/Il2rg -/- și BALB/c +/+ cărora li s-au administrat Hypoxyprobe-1 ™ cu 60 de minute înainte de eutanasie pe gd12, un punct de timp după modificarea arterială spirală la șoarecii +/+ . Placentae la ambii șoareci au fost reactivi cu sonda, în special celulele gigantice trofoblaste. Reactivitatea a fost oarecum mai puternică în placenta Rag2 -/-/Il2rg -/- decât a +/+. Rag2 -/-/Il2rg -/- și +/+ țesuturile fetale nu au fost reactive la gd12. Sunt în curs de desfășurare studii despre perioadele de gestație ulterioare.

Am emis ipoteza că chiar și hipoxia placentară ușoară de la mijlocul gestației ar avea consecințe asupra viabilității fetusilor Rag2 -/-/Il2rg -/-. Prin urmare, șoarecii însărcinați au fost eutanasiați și au fost abordate ratele de supraviețuire fetală. Așa cum se arată în Figura 3A, când s-au examinat 3-4 sarcini pentru fiecare tulpină studiată un punct de timp de predare (gd7-18), ambele tulpini au părut să piardă utilizările conceptuale în a doua jumătate a sarcinii. Cu toate acestea, în acest eșantion mic, Rag2 -/-/Il2rg -/- a avut tendința generală de a avea mai multe site-uri de implantare care au fost viabile decât +/+. La peripartum gd18, viabilitatea făturilor a fost similară pentru ambele genotipuri. Astfel, stresul hipoxic ușor al celulelor gigantice placentare la jumătatea sarcinii care însoțește lipsa modificării arteriale spirale nu favorizează moartea fetală.

(A) Datele sunt afișate pentru media ± SEM a făturilor viabile în șoareci BALB/c +/+ (bare deschise) și Rag2 -/-/Il2rg -/- (bare solide) împerecheați și eutanasiați în colonia noastră. S-au studiat 3 sau 4 litri pe histogramă. Pentru a obține o estimare exactă a succesului fetal pentru aceste genotipuri, ar trebui sacrificate multe altele. Aceste date preliminare arată totuși că viabilitatea Rag2 -/-/Il2rg -/- nu este dezavantajată în comparație cu + /+. (B) Sunt prezentate date pentru zonele secțiunii transversale medii ± SEM ale placentei. Erorile sunt prea mici pentru vizualizarea barelor de eroare. Un total de 135 de secțiuni de țesut au fost scanate pentru fiecare medie. La gd10, 12 și 14, nu au existat diferențe semnificative în mărimea placentei între genotipuri. La gd 16, +/+ placente au fost semnificativ mai mari (6,16 mm 2 ± 0,17 versus 5,4 mm 2 ± 0,14 P 2 ± 0,29). Rag2 -/-/Il2rg -/- placente au continuat să crească și au avut o dimensiune medie peripartum gd18 de 7,02 mm 2 ± 0,26. Aceasta a fost statistic mai mare (P 31 .

5. EVALUAREA MĂRIMII PLACENTALE ȘI VASCULARIZĂRII ÎNTRE SITURILE DE IMPLANTARE CU ȘI FĂRĂ MODIFICARE ARTERIALĂ SPIRALĂ

8. BARAJURILE CU EXPERIENȚĂ A SĂRNĂȚII FĂRĂ MODIFICARE ARTERIALĂ SPIRALĂ DEVIN HIPERTENSIVE ÎN TIMPUL GESTAȚIEI TÂRZII?

Modificarea (Δ) în 24 de ore a presiunii arteriale medii (MAP) în timpul sarcinii în BALB/c +/+ (○; n = 5) și Rag2 -/-/Il2rg -/- (●; n = 9) pentru femeile care livrează vii descendenți născuți. Deoarece nu s-au găsit modificări de la o bază inițială de pre-concepție de 4 zile în timpul gestației pre-implantare la acești șoareci sau C57Bl/6J, s-a utilizat gd0-3 MAP 24 hr pentru comparații statistice medii zilnice 24h 31. Ambele tulpini au prezentat o scădere a APMAP la scurt timp după implantare, care a continuat până la momentul modificării spiralei arteriale și deschiderii circulației placentare (

gd9–10). Declinul a fost semnificativ statistic de la momentul inițial de pre-implantare pentru Rag2 -/-/Il2rg -/-. A urmat un câștig în ΔMAP, iar valorile inițiale au fost atinse câteva zile mai târziu. Acestea au rămas relativ stabile, fără hipertensiune până la naștere (P). Un model de hipertensiune gestațională târzie (neprezentat) a fost observat la două femele Rag2 -/-/Il2rg -/- care au născut litiere de pui născuți 31 .

De remarcat, alte două femei gravide Rag2 -/-/Il2rg -/- au avut hipertensiune gestațională severă, tardivă. Acestea au fost singurele două femele din studiu care au dat naștere la litiere formate din pui născuți. Acest lucru ridică întrebarea dacă conceptul ne oferă un control hemodinamic unic în timpul sarcinii. Unele dintre femelele noastre implantate cu radiotransmițător s-au împerecheat, dar nu au reușit să conceapă și au fost endocrinologic pseudopregnant. Nu a existat APMAP la aceste animale după împerechere, ceea ce indică faptul că mediul hormonal nu reglează dinamic MAP gestațional 31. Încă nu am stabilit dacă reglarea maternă este posibilă prin diferențierea țesutului decidual în absența unui concept, dar aceste studii sunt în curs de desfășurare.

9. EXISTĂ DIFERENȚE HEMODINAMICE POST-PARTUM ÎNTRE BARAJE CARE EXPERIMENTĂ SĂRBÂNTĂ CU SAU FĂRĂ MODIFICARE ARTERIALĂ SPIRALĂ?

Sechelele post-partum la preeclampsie includ un risc crescut de hipertensiune arterială 29; 30. Prin urmare, am colectat și comparat datele hemodinamice pre-partum și post-partum de la Rag2 -/-/Il2rg -/- pentru a determina dacă absența modificării arteriale spirale în timpul sarcinii ar putea crește MAP post-partum. MAP de douăzeci și patru de ore au fost comparate de la nivelurile de bază pre-partum (n = 16), sarcina timpurie (gd 0-3; n = 9) și 10-14 zile post-partum (n = 9). Nu au existat diferențe între aceste trei puncte de timp, ceea ce indică faptul că nu apar modificări sistemice circulatorii aparente din sarcini lipsite de modificări arteriale spirale, cel puțin în primele câteva săptămâni după naștere (Burke, Barrette, Adams și Croy, date nepublicate).

10. MECANISME CARE SUNT PUTEA CHEIE PENTRU ACȚIUNILE CELULARE UNK PE ARTERELE SPIRALE

Moleculele Ephrin B2 (Efnb2) și EphB4 (Ephb4) sunt utilizate pentru a discrimina endoteliile arteriale de cele venoase. Am examinat expresia acestor markeri în siturile de implantare a șoarecilor 36. La gd 8 la ambele șoareci Rag2 -/-/Il2rg -/- și +/+, arterele spirale sunt tipice ale arterelor Efnb2 + Ephb4 și sunt similare din punct de vedere histologic. Prin +/+ gd10, aceste vase exprimă Efnb2 mult mai puțin detectabil și încep să exprime Ephb4. Prin gd12, arterele spirale +/+ au pierdut expresia Efnb2 și exprimă slab Ephb4. În schimb, Efnb2 se exprimă prin arterele spirale ale Rag2 -/-/Il2rg -/- între gd6 și gd12, sugerând păstrarea funcțiilor arteriale. Aceste funcții ar include vasoreactivitate și rezistență vasculară mai mare, dar ar putea include și expresia moleculelor de recrutare a limfocitelor. Între gd6 și gd10, celulele uNK la șoareci +/+ au devenit puternic Efnb2 +, ceea ce poate explica localizarea lor cu structuri arteriale mai degrabă decât venoase. În Rag2 -/-/Il2rg -/-, miometrul mezometrial a devenit puternic pozitiv pentru Efnb2. Această regiune nu a fost reactivă cu anti-Efnb2 la șoareci normali la jumătatea sarcinii.

S-a raportat că celulele T ale oamenilor și șoarecilor și celulele NK umane exprimă toate componentele RAS, inclusiv receptorii de angiotensină Agtr1 și Agtr2 37 - 40. Datorită asocierii strânse dintre celulele uNK și arterele spirale din locurile de implantare a șoarecilor, am postulat că celulele uNK ar fi echipate cu Agtr1 și Agrt2 și că acest lucru ar contribui la reglarea tensiunii arteriale gestaționale. Folosind tehnici imunohistologice de colorare duală pentru a identifica celulele uNK și a localiza unul sau altul receptor, am constatat că mulți (

40%), dar nu toate celulele uNK de șoarece gd10 exprimă Agtr2. Agtr1 este, de asemenea, exprimat, dar printr-o proporție mai mică de celule UNK (Hatta K, Carter A, Zhen A, Leno-Duran E, Ruiz-Ruiz C, Olivares EG, Tse Y, Pang SC și Croy BA, manuscris prezentat). Cu toate acestea, nu este încă clar dacă o celulă uNK co-exprimă acești receptori sau exprimă alte componente ale sistemului renină angiotensină Astfel, în ciuda constatărilor noastre care utilizează radiotelemetrie pentru a examina tensiunea arterială la șoarecii alfaizi Rag2 -/-/Il2rg -/- gravidați, rămâne posibil ca abaterile în funcțiile uNK, NK și/sau celulelor T la șoarecii +/+ însărcinați să contribuie direct la dereglarea MAP.

11. CONCLUZII

Datele prezentate aici diferă de cele pe care le-am raportat pentru prima tulpină cu deficit de celule NK, tgε26 41. Tulpina tgε26 a fost dezvoltată ca tulpină cu deficit de celule T și crescută cu selecție de fenotip pentru cel mai sever deficit de celule T. La vremea respectivă, am primit animale de reproducție (1994), așternuturi mici

3) și moartea fetală semnificativă a caracterizat această tulpină. După cum sa raportat anterior, tgε26 a pierdut acest fenotip reproductiv după 3 ani prin aplicarea presiunii de selecție a reproducerii pe dimensiunea mare a așternutului. Studiile noastre cu această tulpină au fost încheiate și transferate către genotipuri superioare, pe măsură ce au devenit disponibile. Alifoidul BALB/c Rag2 -/-/Il2rg -/-, așa cum este rezumat mai sus, este tulpina noastră cea mai aprofundată investigată. Nu am găsit diferențe semnificative între acești șoareci și C57BL/6 Rag2 -/-/Il2rg -/-, utilizate în multe dintre publicațiile noastre anterioare.

Deficitul imunitar din Rag2 -/-/Il2rg -/- este limitat la limfocite. Astfel, absorbția antigenului și căile de prezentare sunt intacte la fel ca producția de chemokine și citokine de către macrofage, celule dendritice și celule mieloide. Aceasta implică faptul că consecințele care duc de la hipoxia placentară la restricția creșterii fetale sau moartea trebuie să depindă de funcțiile limfocitelor. Figura 6 prezintă un „limfocentricModel pentru patogeneza pre-eclampsiei bazat pe datele rezumate aici și sugerează că intervențiile clinice pentru pre-eclampsie ar putea fi proiectate în mod benefic prin luarea în considerare a patologiei bazate pe limfocite. În Figura 7, sunt rezumate căile cunoscute ale funcției limfocitelor care ar putea contribui la complicațiile sarcinii, cum ar fi restricția de creștere intrauterină și preeclampsia. Va fi important să identificați subseturile de limfocite critice în promovarea complicațiilor gestaționale pentru a avansa aceste ipoteze.

Un model pentru patogeneza pre-eclampsiei în care disfuncția limfocitară declanșează complicațiile sarcinii care apar din absența modificării arteriale spirale. Deși activarea imună a fost documentată de alții ca o componentă a sindromului pre-eclampsiei, studiile noastre sugerează că modificările limfocitelor și nu cele ale celulelor imune care prezintă antigen sau ale liniei mieloide, cum ar fi macrofagele, neutrofilele și mastocitele, sunt cele care sunt centrale în patogeneză.

Un model pentru căile pe care limfocitele le pot utiliza pentru a determina complicațiile sarcinii, inclusiv restricția de creștere intrauterină și moartea fetală.

Caracterizarea fenotipică a sarcinilor la șoarecii Rag2 -/-/Il2rg -/- oferă o platformă puternică, nouă, pentru studii ulterioare privind patogeneza pre-eclampsiei. Această tulpină are dovezi histologice consistente pentru eșecul modificării arteriale spirale gestaționale, dar păstrează creșterea normală a placentei, supraviețuirea fetală și funcția hemodinamică. Atunci când aceste caracteristici sunt testate cantitativ în combinație cu radiotelemetrie cronică și micro-ultrasunete, acțiunile și dozele moleculelor de test sau combinațiile de molecule pe fiecare caracteristică pot fi evaluate independent. Acest lucru ar trebui să ofere un model in vivo în care să poată fi testată reconstituirea incrementală a elementelor suspectate de a contribui la patogeneza pre-eclampsiei. De exemplu, infuziile pompei osmotice de s-Wegfr1, Tnf, STBM, acid uric sau anticorpi care activează Agtr1 ar putea fi testate pe intervale largi de doză și în combinații. Deoarece șoarecii Rag2 -/-/Il2rg -/- acceptă cu ușurință xenogrefele, aceștia ar putea fi, de asemenea, construiți pentru a evalua funcțiile anumitor subseturi de limfocite umane în locurile de implantare.