Samantha Brown

1 RLAHA, Universitatea din Oxford, OX1 3QY, Marea Britanie

Thomas Higham

1 RLAHA, Universitatea din Oxford, OX1 3QY, Marea Britanie

Viviane Slon

2 MPI-EVA, Leipzig, 04103, Germania

Svante Pääbo

2 MPI-EVA, Leipzig, 04103, Germania

Matthias Meyer

2 MPI-EVA, Leipzig, 04103, Germania

Katerina Douka

1 RLAHA, Universitatea din Oxford, OX1 3QY, Marea Britanie

Fiona Brock

3 Cranfield Forensic Institute, Universitatea Cranfield, SN6 8LA, Marea Britanie

Daniel Comeskey

1 RLAHA, Universitatea din Oxford, OX1 3QY, Marea Britanie

Noemi Procopio

4 Facultatea de Științe ale Vieții, Universitatea din Manchester, M13 9PL, Marea Britanie

Michael Shunkov

5 Institutul de Arheologie și Etnografie, Novosibirsk, 630090, Rusia

Anatoly Derevianko

5 Institutul de Arheologie și Etnografie, Novosibirsk, 630090, Rusia

Michael Buckley

4 Facultatea de Științe ale Vieții, Universitatea din Manchester, M13 9PL, Marea Britanie

Date asociate

Abstract

Secvențierea ADN-ului a revoluționat înțelegerea noastră asupra oamenilor arhaici în paleoliticul mediu și superior. Din păcate, în timp ce multe situri paleolitice conțin un număr mare de oase, majoritatea acestora nu are caracteristicile de diagnostic necesare pentru identificarea morfologică tradițională. Ca urmare, recuperarea rămășițelor umane din epoca Pleistocenului este extrem de rară. Pentru a ocoli această problemă, am aplicat o metodă de amprentare a colagenului la peste 2000 de oase fragmentate de pe site-ul peșterii Denisova, Rusia, pentru a facilita descoperirea rămășițelor umane. Ca rezultat al analizei noastre, a fost identificat un singur os de hominină (Denisova 11), susținut printr-o analiză aprofundată a secvențierii peptidice și s-a constatat că transportă ADN mitocondrial de tip neandertal. Datarea ulterioară cu radiocarbon a dezvăluit că osul are o vechime> 50.000 de ani. Aici demonstrăm potențialul uriaș al amprentelor digitale de colagen pentru identificarea rămășițelor de hominin în ansambluri arheologice extrem de fragmentare, îmbunătățind resursele disponibile pentru studii mai ample despre evoluția umană.

Fosilele de Hominin din Peștera Denisova s-au dovedit a fi extrem de valoroase în înțelegerea populației arhaice de hominin. Acest lucru este evidențiat de starea excepțională de conservare a moleculelor de ADN străvechi din unele oase recuperate la locul respectiv. Falanga Denisovan (Denisova 3), de exemplu, conținea> 70% ADN endogen care produce un genom cu acoperire ridicată (30x) 7. În ciuda săpăturilor intensive la Peștera Denisova, totuși, doar o mână de resturi de hominin au fost identificate printre mii de oase excavate. Cei identificați sunt fie dinți, fie de dimensiuni mici, în general falange, care sunt mai puțin susceptibili de a suferi fragmentare, ducând la pierderea caracteristicilor de diagnostic. O astfel de fragmentare, care se datorează atât taphonomiei mediului înconjurător, cât și carnivorului sau activității umane, are ca rezultat un procent ridicat de oase excavate din acest și multe alte situri arheologice care nu pot fi identificate pe baza morfologiei lor 3, 8. Numai în cadrul Galeriei de Est a Peșterii Denisova, săpăturile între 2005 și 2013 au produs aproximativ 135.600 de oase; cu toate acestea 128.591 nu au putut fi identificate 8 .

Aici aplicăm o metodă de identificare a speciilor prin amprentă de masă a peptidelor de colagen, cunoscută sub numele de Zooarchaeology by Mass Spectrometry (ZooMS), la 2.315 fragmente osoase neidentificate arhivate din Peștera Denisova. Aceste oase non-diagnostice au fost selectate dintre materialul excavat de la Galeria de Est a peșterii în 2014. Rămășițele au variat ca dimensiune, variind în general între 3-5 cm, cu oase suficient de mari pentru a fi utile pentru analize suplimentare (adică radiocarbon și ADN) analiză) selectată preferențial. În trecutul recent, analiza ZooMS a reușit să discrimineze între o gamă variată de grupuri de mamifere, inclusiv taxoni domestici 9, 10, taxoni sălbatici terestri 11, 12 și faună marină 13, precum și unii taxoni non-mamiferi 13, 14 . Pentru a realiza acest lucru, ZooMS folosește amprenta digitală în masă peptidică pentru a analiza proteina dominantă din os, colagenul de tip 1 (COL1), care este cunoscut pentru longevitatea sa, în special în climă mai rece. Metoda a dat amprente de colagen la exemplare care datează din

Rezultate

Screening-ul ZooMS pentru hominin rămâne

peștera

Marcatorii umani publicați anterior sunt etichetați A - G. Toate vârfurile numerotate reprezintă peptide confirmate de secvențiere observate în colagenul uman (cu excepția E care este cunoscută doar prin similitudine cu markerii omologi la alte specii 9).

Specimenul identificat ca provenind dintr-un hominin, DC1227, a fost excavat din pătratul A-2, stratul 12 al Galeriei de Est. Înainte de prelevare, osul cântărea 1,68 g, cu o lungime maximă de 24,7 mm și o lățime de 8,39 mm. S-au luat aproximativ 36 mg pentru analiza ZooMS (Fig. 2). Osul pare destul de remarcabil, fără trăsături morfologice sau dovezi ale unei modificări intenționate, prin urmare a fost ușor trecut cu vederea în analiza osteologică.

Scanare Micro CT a DC1227

Înainte de prelevarea de probe distructive ulterioare pentru analiza ADN-ului radiocarbonat și mitocondrial, a fost efectuată tomografia micro-computerizată (micro-CT). Având în vedere raritatea unei astfel de descoperiri, un micro-CT a fost considerat adecvat pentru a identifica zonele care suferiseră de degradare vizibilă și, prin urmare, ar trebui evitat în analize viitoare. Rezultatele au arătat că eșantionul este foarte dens, fără semne de degradare osoasă, în ciuda unei serii de microfisuri diagenetice care traversează lungimea sa. Trei dintre aceste fisuri sub-micronice se apropie una de alta prin os, totuși nu formează o fisură și nu par să fi compromis structura osului. Scanarea a evidențiat, de asemenea, gradul de gravare acidă și scobire pe suprafața oaselor, care poate fi rezultatul trecerii prin sistemul digestiv al unui carnivor (Fig. 3). Există un număr de carnivore identificate pe site; având în vedere prevalența hienelor la Peștera Denisova, se pare că osul a fost supus gravării acide prin intermediul acizilor stomacali ai unei hiene 8, 20 .

Analiza radiocarbonului DC1227

Înainte de munca noastră, toate oasele de hominin descoperite la locul respectiv erau prea mici pentru datarea directă cu radiocarbon, ceea ce înseamnă că determinările de vârstă pentru acești indivizi s-au bazat exclusiv pe poziția lor față de alte materiale, faună și sedimente datate 4. Această metodă presupune că rămășițele de hominin nu au fost supuse mișcării post-depozitare din cauza bioturbării sau a altor influențe tahonomice. Acest lucru este deosebit de problematic atunci când se iau în considerare datele cronologice limitate care au fost publicate până acum pentru site. Determinările de vârstă pentru Galeria de Est sunt limitate la un singur strat (stratul 11) cu o serie de date radiocarbonate pe oase care prezintă semne tăiate sau alte modificări umane și pot dezvălui un anumit grad de amestecare în acel strat 4. Prin urmare, a fost efectuată analiza radiocarbonă a DC1227 pentru a determina dacă specimenul nu a fost refăcut sau intrat de mai sus în secvență. Deși până acum nu a fost publicată nicio datare științifică pentru stratul mai vechi 12 al Galeriei de Est, studiile asupra faunei de mamifere sugerează că stratul este asociat cu specii de locuitori de stepă, reprezentând probabil stadiul izotopului de oxigen (OIS) 4, care s-a încheiat

Acum 57.000 de ani 21, 22. Dacă DC1227 ar fi găsit in situ, ar fi de așteptat să se întoarcă o vârstă peste limita superioară a datării cu radiocarbon (> 50.000 de ani).

Datarea radiocarbonată a fost efectuată la Oxford Radiocarbon Accelerator Unit (ORAU), urmând proceduri și protocoale standard 23, obținând o estimare a vârstei de> 49.900 ani BP (OxA-32241), indicând faptul că osul este mai vechi decât limita maximă măsurabilă pentru datarea radiocarbonată de colagen osos. Rezultatul este întru totul în concordanță cu epoca sa geoarologică dedusă cu privire la secvența stratigrafică a sitului.

Măsurătorile izotopice ale carbonului și azotului au dat o valoare de δ 13 C de -17,3 ‰ și o valoare de δ 15 N de 16,4 ‰. Homininele din regiune returnează de obicei valori izotopice ale azotului între 13-15 ‰, prezentate de exemplu printre Neandertalele din peștera Okladnikov 24. Valorile crescute ale DC1227 ar putea indica o varietate de anomalii dietetice, inclusiv o dietă bogată în proteine ​​derivate din organisme cu nivel trofic superior, precum peștii de apă dulce 25, 26. Sunt necesare cercetări suplimentare pentru a plasa valorile izotopice crescute într-un context adecvat și acest lucru va fi raportat în viitor. Astfel de investigații privind compoziția izotopică a homininei și faunei asociate din Denisova au potențialul de a dezvălui informații importante despre dietele homininelor paleolitice care trăiesc în Altai și astfel de cercetări sunt în curs de desfășurare la Universitatea din Oxford.

Secvențe de ADN mitocondrial (ADNmt) din specimenul DC1227

Am extras ADN din 30,9 mg pulbere osoasă din DC1227 27. O parte alicotă a extractului a fost convertită într-o bibliotecă de ADN monocatenară 28, care a fost îmbogățită pentru fragmente de ADN mitocondrial de hominină folosind sonde mitocondriale umane 29. Fragmentele de ADN izolate au fost secvențiate și mapate la secvența de referință mitocondrială umană Cambridge (rCRS) revizuită. În total, am identificat 282.502 fragmente unice de ADNmt mai lungi de 35 de perechi de baze (tabelul suplimentar S1).

Pentru a evalua dacă unele dintre fragmentele de ADNmt au fost de origine antică, am folosit faptul că bazele de citozină (C) de la capetele moleculelor de ADN în timp au tendința de a suferi dezaminare 30 și, ca urmare, sunt citite ca timine (T) de ADN polimeraze. Fragmentele de ADN străvechi aliniate la o secvență de referință tind astfel să poarte frecvențe ridicate ale substituțiilor aparente de la C la T la capetele lor 5 'și 3' - 31, 32, 33. Dintre fragmentele care încep sau se termină în poziții în care baza rCRS este un C, 32,2% și 31,3% au purtat Ts la capetele lor 5 ′ și respectiv 3 ′ (Figura suplimentară S13), indicând faptul că moleculele ADN de hominină antice sunt prezente în DC1227.

Pentru a determina dacă ADNmt endogen al DC1227 este cel mai strâns legat de genomul mitocondrial uman modern, neanderthalian sau denisovan, am limitat analiza la secvențe care poartă o substituție de la C la T relativ la rCRS la unul dintre capetele lor 34 pentru a diminua influența putativului contaminarea cu ADN-ul uman actual (informații suplimentare). Folosind 36.665 de astfel de secvențe (Tabelul suplimentar S1), genomul mitocondrial al specimenului DC1227 a fost reconstruit cu o acoperire medie de 130 de ori, lăsând 63 de poziții acoperite de două sau mai puține secvențe și patru în care mai puțin de două treimi din secvențe au purtat aceeași bază. Astfel, 67 de posturi nu au putut fi apelate în mod confidențial.

Când se compară ADNmt DC1227 cu ADNmt neandertal complet stabilit până în prezent, acesta prezintă cinci diferențe de bază față de ADNmt neandertal din Okladnikov 2 33 găsite la aproximativ 60 km de peștera Denisova, 12 la 17 diferențe față de neandertalii din vestul și sudul Europei și 31 diferențe de Mezmaiskaya 1 din Caucaz 35 și până la un Neandertal găsit în peștera Denisova 5. În comparație, ADNmt al DC1227 diferă între 174 și 354 baze față de ADNmt ale altor grupuri de hominină (Tabelul suplimentar S2). Într-o analiză filogenetică (Fig. 4), genomul mitocondrial DC1227 se încadrează astfel în variația a zece neandertali, cu excluderea a 311 de oameni din zilele noastre, a zece oameni moderni antici, a doi denisovani și a unui hominin din Pleistocenul Mijlociu din Spania. Concluzionăm că individul DC1227 a purtat un genom mitocondrial de tip neandertal și îl denumim de acum înainte ca Denisova 11.

Un ADNmt de cimpanzeu a fost folosit ca grup outgroup (nu este prezentat). Suportul pentru fiecare ramură se bazează pe 500 de replici de bootstrap. Vezi Tabelul S2 pentru originea geografică a exemplarelor antice.

Concluzii

Metode

ZooMS

Între 20-50 mg de os au fost luate din fiecare dintre oasele din cadrul ansamblului și demineralizate în acid clorhidric 0,6 M (HCl) timp de 18 ore. Reziduul rezultat a fost îndepărtat în ultrafiltre de tăiere cu greutate moleculară de 30 kDa (MWCO) și centrifugat la 3700 rpm timp de 1 oră. Filtratul a fost apoi spălat de două ori cu 500 pl de bicarbonat de amoniu 50 mM (AmBic) și centrifugat în continuare la 3700 rpm timp de o jumătate de oră după fiecare tratament. Reziduul final a fost resuspendat cu AmBic suplimentar (200 μL), jumătate din care a fost îndepărtat pentru a crea o probă de rezervă setată înainte de digestie. Restul de 100 μL au fost apoi tratați cu 0,2 μg tripsină (grad de secvențiere; Promega UK) și incubate la 37 ° C timp de 18 ore. Soluția rezultată a fost apoi amestecată cu o soluție matricială de 1 μl de soluție de acid α-ciano-4-hidroxicinamic (10 mg/ml în acetonitril 50% (ACN)/acid trifluoroacetic 0,1% (TFA)), lăsată să co-cristalizeze și analizate folosind un spectrometru de masă Bruker Ultraflex II (Bruker Daltonics, Bremen) MALDI Tof/Tof. Spectrele de masă rezultate au fost selectate pentru markerii umani 9, 12 în cadrul software-ului FlexAnalysis.

Scanare CT

Scanarea CT a fost efectuată utilizând un micro-scaner Nikon XT H 225 cu o țintă de transmisie. S-au făcut încercări de menținere a dozei cât mai mici posibil pentru a evita orice deteriorare a probei, astfel că scanarea a fost efectuată la 70kv și 80 μA. În total au fost realizate 1.448 de proiecte la două cadre pe proiecție, cu o expunere stabilită la 100ms și mărire la × 7.2. Datele au fost reconstruite folosind software-ul CT Pro 3D și procesate cu software-ul VG Studio Max 2.1.

Analiza ADN-ului mitocondrial

Extracția ADN și pregătirea bibliotecii

30,9 mg de pulbere osoasă au fost îndepărtate din DC1227 folosind un burghiu pentru stomatologie. ADN-ul a fost extras folosind un protocol pe bază de silice conceput pentru a extrage molecule scurte de ADN 27, 36. 10 pl din extractul de ADN (E3128) au fost transformate într-o bibliotecă de ADN monocatenar (A9301), așa cum este descris 28, 36. Numărul de molecule de ADN din bibliotecă a fost evaluat prin picurare digitală PCR (BioRad QX 200), folosind 1 μl ca intrare pentru un test EvaGreen (BioRad) cu primeri IS7 și IS8 37. Biblioteca a fost codată în bare cu doi indici unici 36, 38 și amplificată utilizând AccuPrime Pfx ADN polimerază (Life Technologies) 39. Produsele de amplificare au fost purificate folosind kitul de purificare MinElute PCR (Qiagen); și cuantificat pe un fotospectrometru NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies).

Captarea și secvențierea mitocondrială

Biblioteca amplificată (A9317) a fost îmbogățită printr-un protocol de captare hibridizare bazat pe margele 29 folosind sonde 52-mer 40 proiectate într-o singură pereche de bază de placare pe rCRS (Centrul Național pentru Informații despre Biotehnologie [NCBI] referință> NC_012920) în două runde de captare, folosind 1 μg și respectiv 0,5 μg de intrare ADN. Biblioteca capturată (L5502) a fost secvențiată pe o platformă MiSeq (Illumina), folosind runde cu capăt asociat (2 × 76 cicluri) cu configurație cu index dublu 38. Un semifabricat de extracție a ADN-ului și un semifabricat de preparare a bibliotecii au fost transportate de-a lungul întregii proceduri ca martori negativi.

Procesarea și maparea secvenței

Apelarea de bază a fost efectuată folosind Bustard (Illumina). Secvențele adaptorului au fost tăiate, iar citirile înainte și invers au fost îmbinate în secvențe unice 41. Secvențele lipsite de potriviri perfecte cu codurile de bare așteptate au fost eliminate. Cartarea la referința genomului a fost efectuată folosind BWA 42, cu parametrii „-n 0,01 -o 2 -l 16500” 7. Duplicatele PCR au fost eliminate prin combinarea secvențelor cu coordonate identice de început și sfârșit de aliniere, folosind bam-rmdup (https://github.com/udo-stenzel/biohazard). Secvențe mai lungi de 35 de baze cu o calitate a cartografierii mai mare de 30 au fost păstrate pentru analize ulterioare.

Analiza filogenetică

Secvențele care transportă o substituție terminală de la C la T au fost folosite pentru a reconstitui ADNmt DC1227. Terminalul Ts din prima sau ultima poziție a fiecărei secvențe a fost convertit în Ns pentru a reduce impactul erorilor de secvență derivate din daune în apelul consens. S-a determinat o bază de consens dacă o poziție a fost acoperită de cel puțin trei secvențe și dacă cel puțin 67% din secvențe, adică mai mult de două treimi care se suprapuneau purtau o bază identică 34 .

ADNmt a fost aliniat la ADNmt de 311 oameni din zilele noastre 43, 10 oameni moderni antici 31, 44, 45, 46, 47 zece neandertali 5, 33, 35, 48, 49, doi denisovani 3, 4 un homin din Pleistocen mediu 34 și un cimpanzeu (Pan troglodytes,> NC_001643) 50 de MAFFT 51. Numărul diferențelor de bază între secvențe și un copac Neighbor-Joining cu 500 de replici bootstrap 52 bazate pe aceste diferențe au fost produse folosind MEGA6 53 .

informatii suplimentare

Cum să citiți acest articol: Brown, S. și colab. Identificarea unui nou os de hominin din Peștera Denisova, Siberia, utilizând amprente de colagen și analiză ADN mitocondrială. Știință. reprezentant. 6, 23559; doi: 10.1038/srep23559 (2016).

Cod de aderare: Secvența genomului mitocondrial al specimenului DC1227 (Denisova 11) a fost depusă în GenBank (număr de acces> KU131206).