• Găsiți acest autor pe Google Scholar
  • Găsiți acest autor pe PubMed
  • Căutați acest autor pe acest site
  • Pentru corespondență: [email protected]

Editat de Sacha B. Nelson, Universitatea Brandeis, Waltham, MA și acceptat de Comitetul de redacție 23 mai 2008 (primit pentru revizuire 30 martie 2008)

unei

Abstract

Prezența undelor lente de amplitudine mare în EEG este o caracteristică primară care distinge activitatea cerebrală în timpul somnului de cea care apare în timpul stării de veghe. Deși neuronii activi în somn au fost identificați în alte zone ale creierului, neuronii care sunt activați în mod specific în timpul somnului cu unde lente nu au fost descriși anterior în cortexul cerebral. Am identificat o populație de celule din cortex care este activată în timpul somnului la trei specii de mamifere. Acești neuroni corticali sunt un subset de interneuroni GABAergici care exprimă NOS neuronal (nNOS). Deoarece expresia Fos în acești neuroni activi în somn, nNOS-imunoreactivi (nNOS-ir) este paralelă cu modificările intensității activității undelor lente în EEG, iar acești neuroni sunt inversați de sistemele de neurotransmițători implicate anterior în controlul somnului/veghei, nNOS cortical -neuronii lor pot face parte din substratul neurobiologic care stă la baza reglării homeostatice a somnului.

Somnul este bine cunoscut pentru că are proprietăți de recuperare (1) și pentru a facilita efectuarea comportamentelor învățate (2, 3); dimpotrivă, privarea de somn are ca rezultat deficite cognitive și de performanță (4). Prezența undelor lente de amplitudine mare în EEG este semnul distinctiv care distinge activitatea cerebrală în timpul somnului de veghe. Deoarece intensitatea undelor lente măsurate în intervalul delta al EEG (1,0-4,0 Hz) pare a fi reglată homeostatic și proporțională cu durata trezirii anterioare (5), sa presupus că activitatea undelor lente (SWA) este asociată funcția de restaurare a somnului și cu plasticitate sinaptică (2, 3, 6).

Circuitul neuronal care stă la baza SWA implică o buclă corticotalamocorticală și interacțiunea între un curent de cation activat prin hiperpolarizare (Ih) și un curent de Ca 2+ (It) cu prag scăzut (It) în neuronii talamocorticali (7, 8). În prezent nu se știe dacă cortexul cerebral este un participant activ sau pur și simplu un transportor pasiv al dinamicii SWA dependente de istoricul somnului. Identificarea unei populații discrete active de somn de neuroni corticali, cum ar fi cei din creierul bazal (BF) (9) și hipotalamusul preoptic-anterior (POAH) (10-13), ar ajuta la distincția dintre aceste alternative.

În experimentele efectuate pe trei specii de mamifere, am constatat că interneuronii GABAergici care exprimă enzima neuronală NOS (nNOS) sunt activate atât în ​​timpul somnului spontan, cât și în timpul somnului de recuperare (RS) după lipsa de somn (SD). Proporția neuronilor nNOS-imunoreactivi (nNOS-ir) care sunt activați în timpul somnului este corelată cu o măsură a intensității SWA cunoscută sub numele de „energie delta” (14, 15). Deoarece neuronii activi pentru somn, nNOS-ir sunt inervați de sistemele de neurotransmițători implicați anterior în controlul somnului/trezirii, neuronii corticali nNOS-ir pot fi un tip de celule nerecunoscut anterior implicat în SWA și o parte a substratului neurobiologic care stă la baza reglării homeostatice a somnului.

Rezultate

Expresia Fos este crescută în neuronii corticali nNOS în timpul RS.

Expresia Fos a fost utilizată anterior pentru a identifica zonele cerebrale active în somn în cadrul POAH, în mod specific, zonele preoptice ventrolaterale (10) și mediane (12). Am folosit această metodologie împreună cu imunomarcarea pentru markeri fenotipici pentru a identifica populații neuronale specifice care sunt active în timpul somnului la trei specii de rozătoare [a se vedea informațiile de sprijin (SI) Fig. S1 pentru o schemă a protocoalelor experimentale]. În cursul acestor studii, am observat că o populație de neuroni ai cortexului cerebral care exprimă nNOS au arătat o expresie a Fos mult crescută în timpul RS după o perioadă de SD. Acești neuroni nNOS-ir „activi în somn” au fost intens colorați, de obicei aveau o formă bipolară sau multipolară, aveau diametrul de ≈10-15 μm și erau localizați pe toate straturile corticale. Aceste caracteristici anatomice ale neuronilor nNOS-ir (Fig. 1D) sunt foarte asemănătoare cu cele raportate (16, 17). De asemenea, am observat un număr mare de celule nNOS slab colorate în cortex. Deoarece imunocolorarea celulelor slab colorate nu a marcat în mod fiabil procesele celulare și, prin urmare, nu a permis determinarea fără echivoc a neuronilor imunoclinați din semnalul de fundal, au fost efectuate analize suplimentare numai pe celulele nNOS-ir colorate intens.

Așa cum este indicat în Fig. 1 și Fig. S2, numărul neuronilor Fos +/nNOS-ir din cortexul șobolanului este mult crescut în timpul RS, o perioadă asociată în mod tipic cu veghe redusă, creșterea timpului total de somn (Fig. 1A) și SWA crescut în timpul mișcării nonrapide a ochilor (NREM) somn (Fig. 1B). Deoarece neuronii nNOS-ir se găsesc în mai multe regiuni corticale și în alte zone ale creierului, am evaluat variația regională a expresiei Fos în neuronii nNOS-ir. Celulele dublu-marcate Fos +/nNOS-ir au fost găsite în mai multe regiuni corticale și în mai multe straturi corticale în timpul RS, în timp ce foarte puține celule dublu-marcate au fost observate în timpul SD (Fig. 1 C și D). FIG. 1E demonstrează creșterea semnificativă a celulelor Fos +/nNOS-ir în toate regiunile corticale examinate. Proporția de celule dublu-marcate a crescut, de asemenea, în timpul RS în caudat-putamen, cu toate acestea, proporția a fost mai mică în această regiune a creierului decât în ​​orice zonă corticală examinată. Procentul de celule dublu-marcate nu a diferit între RS și SD în zona perifornicală a hipotalamusului (Fig. 1E), o regiune în care sunt localizate celulele active la veghe.

Identificarea neuronilor activi în somn în cortexul cerebral al șobolanului. (A) În perioada de 2,5 ore RS care a urmat 6-h SD, starea de veghe a fost semnificativ redusă (distribuția neuronului P +/nNOS-ir în două secțiuni reprezentative ale creierului. Cercurile albastre reprezintă neuroni nNOS-ir cu o singură culoare și pătratele portocalii neuroni dublu colorați Fos +/nNOS-ir. Puțini neuroni dublu colorați se găsesc în cortex după SD, în timp ce mulți neuroni dublu colorați se găsesc în cortex după RS. (E) Proporția de Fos +/nNOS-ir celulele au fost semnificativ mai mari în grupul RS decât în ​​grupul SD în fiecare regiune corticală și în caudat -putamen. Datele sunt medii ± SEM. *, neuronii P +/nNOS-ir au fost găsiți în timpul RS în raport cu starea de veghe în toate cele opt corticale zone examinate (Fig. 2). La caudatul-putamen de șoarece, procentul de celule dublu-marcate a fost semnificativ mai mare în partea posterioară în timpul RS, dar nu și în partea anterioară (Fig. 2C).

Parametrii de somn și expresia Fos în neuronii nNOS-ir ai cortexului șoarecelui și hamsterului în timpul somnului spontan și al stării de veghe. (A) Șoarecii au fost uciși în patru puncte de timp din ciclul lumină/întuneric; cantitățile de somn/trezire și nivelurile EEG SWA au fost calculate pentru perioada de 2,5 ore înainte de a fi ucise. Au fost făcute comparații statistice între toate grupurile; literele din partea de sus a barelor indică diferențe semnificative (celulele P +/nNOS-ir au fost semnificativ mai mari la ZT2.5 decât la ZT8.5 și astfel au fost paralele cu nivelurile ridicate de SWA. În toate grupurile, procentul de Fos +/nNOS- celulele ir din cortexul mouse-ului au fost puternic corelate cu energia delta NREM (relația este prezentată aici ca un grafic semilog). (C) La hamsterii uciși după expunerea la lumină constantă timp de cel puțin 2 săptămâni, profilul expresiei Fos în nNOS- celulele ir au fost similare cu cele de la șoareci: Cel mai mare procent de celule Fos +/nNOS-ir a fost găsit la CT3 în timpul fazei inactive când EEG SWA este mare și cea mai mică proporție la CT9-12 când EEG SWA este scăzută. proporția de celule Fos +/nNOS-ir este scăzută la CT15 și crește deoarece datoria de somn se acumulează târziu în faza activă (CT21-24). Datele sunt prezentate ca medie ± SEM.

Neuronii Fos +/nNOS par a fi o populație unică de interneuroni corticali activi în somn.

Neuronii nNOS-ir sunt cea mai mică subdiviziune cunoscută în prezent a neuronilor de proiecție GABAergici din cortexul șoarecelui. Următoarea subdiviziune mai mare este neuronii care exprimă neuropeptida Y (NPY) (19). Prin urmare, am efectuat experimente cu etichetare triplă a Fos, nNOS și NPY în cortexul șoarecelui și am constatat că Fos a fost exprimat în neuroni care au fost colorate atât pentru nNOS, cât și pentru NPY, dar nu a fost găsit în neuronii care au colorat doar pentru NPY (Fig. 4A) .

Caracterizarea imunohistochimică a celulelor nNOS-ir active în somn. (A) Colorare triplă pentru nNOS (a), NPY (b) și Fos (c) imunoreactivitate în cortexul mouse-ului în timpul RS. Neuronii care exprimă atât nNOS, cât și NPY conțin Fos (săgeți), dar neuronii care exprimă doar NPY nu conțin Fos (triunghiuri). (B) Colorare dublă pentru imunoreactivitatea calretininei (triunghiuri) și Fos (săgeată) în cortexul șoarecelui indicând faptul că puțini neuroni calretinin-ir exprimă Fos în timpul RS.

Experimentul 4: Activitate de odihnă spontană la hamsteri.

Hamsterii aurii masculi (M. auratus) (râul Charles) au fost adăpostiți individual și prevăzute cu roți de rulare. Datele despre ritmul activității locomotorii au fost colectate și analizate cu ClockLab (Actimetrics). După 1 săptămână sub LD14: 10 ciclu de lumină/întuneric, hamsterii au fost eliberați în lumină slabă constantă (LL; 200-300 lux). După cel puțin 2 săptămâni în LL, hamsterii au fost uciși la una dintre cele opt faze ale ciclului circadian (CT3: n = 3; CT6: n = 5; CT9: n = 3; CT12: n = 4; CT15: n = 3; CT18: n = 3; CT21: n = 3; CT24/0: n = 4). Hamsterii au fost anesteziați profund cu pentobarbital (20 mg la 100 g greutate corporală; i.p.) și perfuzați cu 25 ml de PBS 0,01 M heparinizat urmat de 100 ml de paraformaldehidă rece 4% în tampon fosfat 0,1 M. Creierele au fost postfixate peste noapte la 4 ° C.

Tehnici histochimice.

Creierele au fost îndepărtate, fixate timp de 4 ore în formalină, echilibrate în PBS cu zaharoză 30% și depozitate la 4 ° C. Pentru șobolani, secțiunile coronare cuprinzând aria cuprinsă între 0 mm și -5 mm de la bregma au fost tăiate la 40 μm pe un microtom înghețat. Pentru șoareci, întregul creier a fost tăiat la 40 μm. Creierele de hamster au fost tăiate la 40 μM pe un criostat.

În studiul cu etichetă triplă, secțiunile creierului șoarecilor au fost mai întâi colorate pentru Fos utilizând metoda ABC/DAB-Ni și apoi prelucrate pentru marcarea cu dublă fluorescență nNOS/NPY. Secțiunile creierului șoarecelui au fost incubate peste noapte în anticorp anti-nNOS de șoarece (1: 5.000; Sigma-Aldrich) la temperatura camerei. Țesutul a fost clătit în PBS, incubat în IgG anti-șoarece de măgar biotinilat, clătit în PBS și incubat în Alexa Fluor 594 streptavidin conjugat (1: 500; Invitrogen). Țesutul a fost din nou clătit în PBS și incubat în anticorpul anti-NPY de iepure (1: 1.000). Țesutul a fost clătit în PBS și incubat în IgG anti-iepure de măgar Alexa Fluor 488 (1: 500; Invitrogen) timp de 2 ore la temperatura camerei. Țesutul a fost apoi montat pe diapozitive acoperite cu gelatină și acoperit cu ajutorul mediilor de montare Fluoromount (științe de microscopie electronică).

Numărul de celule.

Secțiunile cerebrale au fost examinate la microscopie cu lumină (Leica DM5000B) echipate cu o cameră video CCD care funcționează cu un sistem computerizat, de cartografiere anatomică și de analiză a imaginii (StereoInvestigator; Microbrightfield). Un singur examinator, orb de condițiile de tratament, a efectuat numărarea celulelor. Regiunile pentru numărarea celulelor nNOS au fost selectate prin conturarea corticală și caudat-putamen bilateral la o mărire de putere redusă (obiectivul × 5). Pentru hipotalamusul lateral, regiunea de numărare specifică a fost cartografiată prin plasarea unei rețele dorsale de 750 × 500 μm la fornix la o mărire de putere redusă (obiectivul × 5). Regiunile selectate au fost apoi scanate la mărire mare (obiectivul × 20) pentru prezența neuronilor dublu-marcați Fos-pozitivi (Fos +) și Fos +/nNOS. Neuronii au fost considerați Fos + dacă conțin un produs de reacție negru Ni + -DAB care era mai întunecat decât un prag stabilit vizual. Celulele nNOS au fost numărate în secțiuni ale creierului la locații -2,0 mm, -2,8 mm și -3,6 mm de bregma la șobolani; la locațiile +1,0 mm, -1,5 mm și -3,0 mm de bregma la șoareci; și la locațiile de 0 mm, -1,7 mm și -2,5 mm de bregma la hamsteri. Numărurile au fost calculate în medie și utilizate pentru analize statistice suplimentare.

Metode statistice.

Datele au fost analizate folosind un singur sens ANOVA și testul posthoc Student - Newman - Keuls. Datele au fost prezentate ca mijloace ± SEM. Diferențele au fost considerate semnificative la P ¶ Cui îi trebuie adresată corespondența. E-mail: thomas.kilduffsri.com

Contribuțiile autorului: D.G., H.O.d.l.I. și T.S.K. cercetare proiectată; D.G., J.P.W., D.B., R.K.R. și H.O.d.l.I. cercetări efectuate; P.J.S. a contribuit cu noi reactivi/instrumente analitice; D.G., J.P.W., D.B., R.K.R., H.O.d.l.I. și T.S.K. date analizate; și D.G., J.P.W., T.S. și T.S.K. a scris ziarul.

Autorii nu declară niciun conflict de interese.

Acest articol este o trimitere directă PNAS. S.B.N. este un editor invitat invitat de comitetul editorial.