Arti Ahluwalia

1 Centrul de cercetare E. Piaggio, Universitatea din Pisa, Pisa, Italia

Alessandra Misto

2 Consiliul Național Italian de Cercetare, Institutul de Fiziologie Clinică, Pisa, Italia

Federico Vozzi

2 Consiliul Național Italian de Cercetare, Institutul de Fiziologie Clinică, Pisa, Italia

Chiara Magliaro

1 Centrul de cercetare E. Piaggio, Universitatea din Pisa, Pisa, Italia

Giorgio Mattei

1 Centrul de cercetare E. Piaggio, Universitatea din Pisa, Pisa, Italia

Maria Cristina Marescotti

3 Departamentul de Medicină, Universitatea din Padova, Padova, Italia

Angelo Avogaro

3 Departamentul de Medicină, Universitatea din Padova, Padova, Italia

Elisabetta Iori

3 Departamentul de Medicină, Universitatea din Padova, Padova, Italia

Date asociate

Toate datele relevante se află în hârtie și în fișierele sale de informații de suport.

Abstract

Tulburările metabolice datorate supra-nutriției sunt o problemă majoră de sănătate la nivel mondial, adesea asociată cu obezitatea și morbiditățile asociate. Obezitatea este specifică oamenilor, deoarece este asociată cu stilul de viață și dieta și este atât de dificil de reprodus în modelele animale. Aici descriem un model de adipozitate centrală umană bazat pe un sistem cu 3 țesuturi constând dintr-o serie de module fluidice interconectate. Având în vedere legătura cauzală dintre obezitate și inflamația sistemică, ne-am concentrat în primul rând pe markerii proinflamatori, examinând asemănările și diferențele dintre modelul cu 3 țesuturi și dovezile din studiile la om în literatura de specialitate. Atunci când este provocat cu niveluri ridicate de adipozitate, sistemul in-vitro manifestă stres cardiovascular prin expresia E-selectinei și a factorului von Willebrand, precum și a inflamației sistemice (exprimând IL-6 și MCP-1), așa cum se observă la om. Interesant este că majoritatea răspunsurilor sunt dependente de interacțiunea sinergică dintre adipozitate și prezența mai multor tipuri de țesuturi. Amenajarea are potențialul de a reduce experimentele pe animale în cercetarea obezității și poate ajuta la dezlegarea mecanismelor celulare specifice care stau la baza răspunsului țesutului la supraîncărcarea nutrițională.

Introducere

Supraponderabilitatea și obezitatea sunt factori de risc majori pentru o serie de boli cronice, inclusiv diabetul [1], bolile cardiovasculare și cancerul [2]. De la începutul secolului, numărul adulților obezi a crescut la peste 300 de milioane. Persoanele obeze au adesea exces de adipozitate viscerală centrală, o afecțiune care contribuie la o creștere cronică a acizilor grași liberi circulanți și a metaboliților, cum ar fi glicerina și trigliceridele. La rândul lor, acești metaboliți activează diverse cascade de semnalizare care interferează cu semnalizarea insulinei și funcția celulelor β, contribuind în continuare la gluco/lipotoxicitate [3].

O mulțime de cercetări au fost dedicate pentru a delimita mecanismele etiopatogene ale obezității și diabetului utilizând modele animale. Cele mai utilizate modele de obezitate sunt rozătoarele, șoareci sau șobolani mutanți sau modificați genetic, în care adipozitatea este indusă de hrănirea prelungită cu diete bogate în grăsimi [4,5]. După cum a spus succint Wang și colab., „În ciuda utilizării extinse a acestor modele de rozătoare, multe detalii mecaniciste ale metabolismului uman rămân slab înțelese, iar opțiunile de tratament pentru oameni sunt limitate și în mare parte nesatisfăcătoare” [6]. Într-adevăr, acum știm multe despre detaliile metabolismului rozătoarelor, dar încă nu avem o înțelegere detaliată a mecanismelor care stau la baza homeostaziei glucozei umane și a răspunsului la supra-nutriția cronică, precum și a comorbidităților legate de obezitatea umană și a răspunsurilor la intervenții [7].

Pe lângă diferențele evidente între durata de viață a omului și rozătoarele, dieta și biologia de bază, modelele animale nu sunt susceptibile disocierii dinamicii metaboliților în diferite țesuturi și organe. În consecință, identificarea contribuției țesuturilor sau organelor individuale la echilibrul sau destabilizarea nutrienților este o sarcină formidabilă. S-au făcut câteva încercări de modelare a obezității umane utilizând tehnici in vitro, cele mai multe dintre acestea se referă la culturi de celule adipoase sau țesuturi derivate din linii celulare sau izolate de la donatori [8,9]. Cercetarea in vitro a contribuit în mod semnificativ la înțelegerea modificărilor semnalizării la nivelul membranei sau citoplasmatic la celule individuale [10,11]. Astfel, deși există în mod clar o rețea de semnalizare între diferite țesuturi care contribuie la menținerea homeostaziei energetice în corpul uman, o mare parte din înțelegerea noastră despre transducția semnalului este limitată la un spațiu și o fereastră de timp foarte mici. Întrebarea privind modul în care semnalele metabolice sunt propagate și traduse de către țesuturile și organele îndepărtate și modul în care mediul intern este modulat de acestea nu a fost încă abordată, cu foarte puține cercetări efectuate cu privire la modele la nivel superior de metabolism endogen care conțin celule sau țesuturi diferite tipuri.

Material si metode

Celulele

La fel ca în studiile noastre anterioare, proporțiile celulare în structura cu 3 căi au reprezentat raportul hepatocit: adipocit: endotelial în regiunea viscerală, adică 12% AT 10: 2: 1 pentru greutatea normala; 25% AT 10: 4: 1 pentru supraponderalitate; 35% AT 10: 6: 1 pentru obezi [18].

Celulele endoteliale ale venei ombilicale umane (HUVEC, pasajele 4-6) provin de la Promocell. Au fost cultivați în ECGM (mediu de creștere a celulelor endoteliale, Promocell) cu 10% di FBS (ser bovin fetal), 0,1 ng/ml EGF (factor de creștere epidermică), 1,0 ng/ml BFGF (factor de creștere a fibroblastului de bază), 90 μg/ml heparină, 1,0 μg/ml hidrocortizon și pen-strep. Acest cocktail este denumit în continuare media obișnuită. Celulele (38.000) au fost pipetate în μ-Slides care au fost preparate prin acoperire cu 200 μL de gelatină 1% urmată de pre-incubare de 24 de ore într-un cuptor la 37 ° C.

Linia celulară de hepatocite HepG2 provenea din ATCC (American Type Culture Collection). Aceste celule mențin principalele funcții endogene ale hepatocitelor umane și răspund la glucoză-6-fosfat, păstrându-și capacitatea de a sintetiza glicogenul [23]. Hepatocitele au fost trecute în EMEM cu 1g/L glucoză, 5% FBS și pen-strep. 150.000 de celule au fost pipetate cu atenție în centrul schelelor poroase de colagen (porozitate 98%, dimensiunea porilor 200 μm, modul elastic 1,2 kPa) plasate în plăci cu 48 de godeuri. Celulele au fost incubate în mediul comun cu 48 de ore înainte de începerea experimentelor de cultură conectate. După acest timp, celulele proliferează la aproximativ 400.000-450.000, după cum se constată prin citometrie, și sunt pregătite pentru experimentele cu 3 căi.

Țesutul adipos visceral a fost obținut de la n = 9 donatori supuși rezecției hepatice pentru leziuni hepatice metastatice/benigne, fără boli hepatice cronice subiacente sau complicații diabetice și IMC (indicele de masă corporală) cuprins între 20 și 25. Toți pacienții și-au dat consimțământul scris în scris pentru a participa în studiu, care a fost aprobat de Comitetul Etic Local (Studiul nr. 3059 aprobat la 21/07/2011 de către Azienda Ospedaliera Università Pisana). Studiul a fost realizat în conformitate cu liniile directoare stabilite de Comitetul Etic Local. Țesutul a fost curățat de vase de sânge vizibile și împărțit în porțiuni cântărite reprezentând i) normo-greutate, 56 mg, ii) supraponderal, 112 mg și iii) obez, 168 mg. Probele cântărite au fost plasate în godeuri și parțial digerate în colagenază (Sigma) timp de 10 minute. Au fost apoi clătite în EMEM cu 20% FBS și pen-strep înainte de a fi introduse în bioreactoare. Folosind această procedură, obținem un randament de aproximativ 1500 adipocite/mg [22].

Bioreactoare

Bioreactoarele au fost LB1 și LB2 (IVTech srl, IT) și μ-Slide (Ibidi, DE). LB1 este o cameră transparentă cu dimensiuni de 24 de godeuri, transparentă, pentru cultura fluidică a schelelor și membranelor sub solicitare de forfecare redusă, în timp ce LB2 are 2 intrări și ieșiri de flux (Fig. 1). Înălțimea canalului de 400 μm al μ-Slide este concepută pentru a simula mediul vascular cu forfecare ridicată.

vasculară

a) Componentele de bază ale sistemului fluidic cu 3 căi: camera LB1, camera de flux laminar Ibidi și camera LB2; b) instalația fluidică cu o pompă peristaltică, cameră de amestecare și camere hepatice (LB1), endoteliale (Ibidi) și de țesut adipos (LB2); c) Celulele HepG2 colorate cu DAPI (albastru) și actin-faloidină (roșu) însămânțate pe schele poroase de colagen (autofluorescență verde). Bara de scalare 50 μm; d) celule endoteliale colorate cu calceină. Bara de scalare 50 μm; e) adipocite colorate cu roșu ulei. Bară de scalare 50 μm.

O cameră LB2 a fost utilizată pentru țesutul adipos utilizând o configurație de flux încrucișat pentru culturi neaderente, conform recomandărilor producătorului. Țesutul a fost conținut în cameră de o bucată de plasă de nailon sterilă. Hepatocitele însămânțate pe bureți de colagen au fost plasate într-o cameră LB1 în timp ce μ-Slide a fost utilizat pentru celulele endoteliale. În experimentele cu 1 direcție, fiecare tip de celulă a fost plasat individual în circuitul de curgere. Experimentele cu 2 căi au fost realizate prin conectarea unei camere LB2 cu țesut adipos la un μ-Slide cu HUVEC. În cele din urmă, în testele cu 3 căi, o cameră LB1 cu hepatocite a fost adăugată la circuitul cu 2 căi. În toate experimentele (adică cu 1, 2 și 3 căi, vezi mai jos), volumul total al circuitului a fost de 14 ml, iar mediul comun a fost ECGM complet, care păstrează vitalitatea HepG2 și a țesutului adipos în raport cu mass-media standard [22].

După însămânțare, camerele au fost asamblate folosind conectori Luer pentru a forma un circuit cu buclă închisă care conține o pompă peristaltică (Ismatech, CH) și o cameră de amestecare (IVTech srl, IT) așa cum se arată în Fig 1. Debitul a fost de 250 μL/min, ceea ce oferă o tensiune de forfecare a peretelui de 5 μPa în LB1 [24] și 0,35 Pa în μ-Slide și garantează transportul adecvat al nutrienților către celule în construcții 3D [25].

Culturi cu 1, 2 și 3 căi

Viabilitatea celulei

Viabilitatea tuturor celor trei tipuri de celule din culturile conectate a fost măsurată și evaluată prin testul lactat dehidrogenazei (LDH) folosind metoda descrisă de Decker și Lohmann-Matthes [26].

Analize biomolecule

Pentru a evalua funcțiile și viabilitatea celulei, 200 μL de mediu au fost extrase din camera de amestecare la intervale fixe (0, 4 și 24 h). Testele biochimice au fost efectuate pentru a măsura schimbarea în timp a nivelului de metabolit și marker pro-inflamator din medii.

Acizii grași liberi (FFA) și trigliceridele au fost măsurate printr-un test enzimatic colorimetric (respectiv testul NEFA C-Wako Chemicals GmbH, Germania și Hagen Diagnostica SRL, S. Giovanni V.no (AR), ITALIA). Glicerolul a fost determinat printr-un test Lloyd modificat folosind un spectrofotometru automat Cobas Fara II (Roche) [27]. IL-6, (eBioscience Dx Diagnostic, Viena, Austria), E-Selectin, (Boster Biological Technology, LDT, Tema Ricerca, Bologna, Italia), MCP-1 (Life Technologies Italia, Monza-MI, Italia, Albumin Laboratories, Montgomery, TX, SUA), au fost determinate folosind ELISA.Alte teste și rezultatele acestora sunt raportate în fișierul S1, Informații suport.

La sfârșitul experimentelor celulele au fost fixate și colorate cu DAPI și falodină sau anti-vWF (toate de la Thermo Fischer, Italia) și observate cu un microscop confocal (Nikon A1, IT) sau fluorescent (Olympus X81, IT). Țesutul adipos a fost colorat cu o culoare roșie ulei. Intensitatea colorării vWF a fost cuantificată prin procesarea imaginii, așa cum este descris în Informațiile suport, fișierul S1.

Analiza datelor

Rezultatele sunt raportate ca medie ± deviație standard, dacă nu se specifică altfel. Diferențele statistice în concentrațiile de metabolit și citokine (în raport cu mediile proaspete) între cele trei niveluri de adipozitate în culturile conectate cu 1, 2 și 3 căi au fost analizate folosind ANOVA bidirecțională urmată de testul de comparație multiplă al lui Tukey pentru a evalua atât efectul variației adipozității pentru un model dat de complexitate (adică 1, 2 sau 3 căi), cât și cel al schimbării complexității modelului pentru un anumit nivel de adipozitate (adică 12, 25 sau 35% AT). Deoarece albumina umană este secretată doar de hepatocite (deoarece mediul conține albumină bovină), producția sa a fost evaluată numai pentru cel mai complex circuit cu 3 căi care conține hepatocite: efectul adipozității în sistemul cu 3 căi a fost testat cu 1- mod ANOVA urmat de testul de comparație multiplă al lui Tukey și rezultate comparativ cu producția de albumină bazală a monoculturii hepatocitelor. În mod similar, semnificația statistică între nivelurile de selectină și vWF pentru diferitele condiții cu 3 căi și controalele cu o singură cale a fost determinată cu ANOVA cu un singur sens. Comparații multiple post-hoc între diferite grupuri de date au fost efectuate folosind testul Tukey. Analiza statistică a fost implementată în Graphpad Prism 6.0. Diferențele au fost considerate semnificative la p Fig 2a). În special, producția de TRG cu 3 căi a fost mai mare decât cu 2 căi cu 12% adipozitate (p = 0,0138), în timp ce a fost mai mare decât cu 1 și 2 căi cu 25% adipozitate (p Fig. 2b). Interacțiunea variabilă semnificativă a fost găsită și pentru FFA (p Fig. 2c), nivelurile au fost foarte similare, independent de procentul de țesut adipos adăugat la sistem. De fapt, analiza interacțiunii ANOVA cu 2 căi arată că nivelurile FFA depind de adipozitate (p Fig. 2d), fiind semnificativ mai mari la 35% adipozitate față de 12% AT (p = 0,0264). Hepatocitele însămânțate pe schele de colagen în absența altor celule în legătură au secretat semnificativ mai puțină albumină (3,38 ± 1,28 μg/mL, p = 0,004 față de 3 căi 12% AT, 1-ANOVA) timp de 24 de ore. Deoarece albumina este un purtător de acizi grași, secreția sa crescută de către hepatocite poate fi direct asociată cu creșterea adipozității și corelată cu nivelarea concentrațiilor de FFA observate în Fig 2c. Aceste date sugerează că discuția încrucișată cu 3 țesuturi stabilizează concentrațiile de FFA media, probabil prin creșterea producției de trigliceride (Fig. 2a) și albumină (Fig. 2d) de către hepatocite.

Glucoza, lactatul și ureea

După 24 de ore de cultură, s-a investigat efectul atât al adipozității (adică 12, 25 și 35% AT), cât și al complexității modelului (adică 1-, 2 și 3 căi) asupra nivelurilor mediilor de glucoză, lactat și uree pentru a stabiliți dacă și cum cantitatea de țesut adipos din model și/sau discuțiile încrucișate între mai multe țesuturi afectează producția/consumul acestor ultime molecule. Interacțiuni semnificative între adipozitate și complexitatea modelului au fost găsite pentru glucoză (p = 0,0098), lactat (p Fig. 3a. În general, acest consum părea să crească atât cu complexitatea modelului, cât și cu adipozitatea. Cu toate acestea, există câteva excepții care complică analiza datelor, făcând De exemplu, i) absorbția de glucoză a fost observată în modelul AT cu 1 direcție-25%, în timp ce celelalte două modele cu 1 direcție au prezentat eliberarea de glucoză și ii) eliberarea de glucoză a fost observată pentru modelul AT în 2 direcții-25%, în timp ce celelalte două bidirecționale au prezentat absorbția glucozei: acest lucru se reflectă în interacțiunea variabilă semnificativă pentru glucoză.

a) Glucoza; b) Lactat; c) Uree. În toate cazurile, modificarea conținutului de AT în culturile cu 1, 2 și 3 căi a fost comparată în cadrul aceluiași grup, * = p Fig 3b), cu singura excepție de 1-cale-25% AT care prezintă valori mai mici mai mult decât 1% -12% AT și 35% AT (deși nu sunt semnificative, probabil datorită variabilității ridicate a altor date luate în considerare în analiza ANOVA globală cu 2 căi).

O creștere semnificativă a producției de uree s-a găsit între 25% AT și 35% adipozitate AT atât pentru modelele cu 1 direcție, cu 2 căi și cu 3 căi (p Fig. 3c). La modelele cu 1 și 2 căi, s-a observat o scădere semnificativă a producției de uree între 12% AT și 25% AT (p Fig 4a. Interacțiunea sinergică dintre adipozitate și conectivitate dând naștere la niveluri ridicate ale acestei citokine în prezența a 25 și 35% adipocite în grupul cu 3 căi au fost confirmate prin analiza interacțiunii (p Fig. 4b.) Nivelurile MCP-1 au fost puternic corelate cu adipozitatea atât în ​​control, cât și în condiția cu 3 căi, o indicație a interacțiunii variabile nesemnificative (p = 0,1637, ANOVA cu 2 căi) .În mediul conexiunilor cu 3 căi cu 25% AT am constatat o creștere netă a concentrațiilor medii MCP-1 față de cele observate în prezența 12% AT (p = 0,0022) sau 35 % AT (p = 0,0183), Fig. 4. IL-6 și MCP-1 au fost aproape de limita de detecție în circuitele HUVEC cu 1 direcție și cu circuitele hepatocitare cu 1 direcție.

a) Modificări ale concentrației IL-6 în culturile conectate cu 1, 2 și 3 căi în funcție de adipozitate; b) Modificări ale concentrației MCP-1 în culturile conectate 1-2 și 3 ca funcție a adipozității. * = n Fig. 5a). Pe măsură ce adipozitatea în sistem a crescut, am observat o eliberare semnificativă de E-selectină (p Fig. 5a). Expresia vWF în HUVEC a fost măsurată utilizând imunocolorarea și cuantificarea imaginii așa cum este descris în fișierul S1. O creștere semnificativă (peste 2 ori, p = 0,0012) a fluorescenței vWF pe celulă a fost observată în trecerea de la HUVEC în conexiunea cu 3 căi cu 12% AT la 35% AT și 25% AT. Nu s-a observat nicio diferență între martorii negativi (numai HUVEC) și HUVEC în 3 căi cu 12% AT. Celulele tratate cu LPS au fost utilizate ca martori pozitivi (Fig 5b).

a) Modificări ale concentrației E-selectinei în culturi conectate cu 3 căi și în controlul HUVEC-1-cale. * = n Fig. 2a). Cu toate acestea, în experimentele noastre, nivelurile FFA nu s-au corelat cu adipozitatea în sistemul cu 3 căi, dar au fost identice pentru 12% AT, 25% AT și 35% AT (Fig. 2c). Nivelurile FFA destul de stabile (comparativ cu circuitele cu 1 și 2 căi) au fost asociate cu o creștere semnificativă a concentrației de albumină umană - acest lucru se poate datora faptului că orice FFA în exces în 35% AT și 25% AT condițiile au fost legate de albumină și, prin urmare, nu au fost detectate în medii. Aceste rezultate sunt coerente cu descoperirile in-vivo, deoarece mai multe studii pe oameni raportează o corelație pozitivă între nivelurile crescute de albumină serică, starea nutrițională și indicele de masă corporală (IMC), asociat probabil cu rolul albuminei ca purtător de FFA [40,41].

Declarație de finanțare

Lucrările care au condus la aceste rezultate au primit finanțare din partea celui de-al șaptelea program-cadru al Uniunii Europene (PC7/2007-2013) în temeiul acordului de subvenționare 304961 (ReLiver). Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.

Disponibilitatea datelor

Toate datele relevante se află în hârtie și în fișierele sale de informații de suport.