Abstract

Obezitatea este o problemă majoră în societatea occidentală, 10% din populație fiind supraponderală sau obeză (1). Impune riscuri pentru sănătate indivizilor, inclusiv rezistența la insulină și diabetul de tip 2, ducând la un risc crescut de hipertensiune, dislipidemie și boli cardiovasculare, cum ar fi insuficiența cardiacă (2).

inhibarea

Rezistența la insulină apare atunci când există o incapacitate a organismului de a prelua și utiliza glucoza ca sursă de energie la stimularea insulinei. Rezistența la insulină afectează mai multe țesuturi, inclusiv ficatul, mușchii scheletici, pancreasul, țesutul adipos și inima. Mușchii scheletici reprezintă mai mult de 70% din utilizarea glucozei în întregul corp (3) și, prin urmare, este cel mai important sistem de organe care controlează nivelul glicemiei și sensibilitatea globală la insulină. Astfel, orice abordare terapeutică care poate îmbunătăți capacitatea de reacție la insulină din mușchii scheletici poate fi benefică pentru sensibilitatea la insulină a întregului corp și pentru toleranța la glucoză.

Rezistența la insulină în mușchiul scheletic este însoțită de un dezechilibru între absorbția de acizi grași și β-oxidarea acidului gras (4,5). Acumularea excesivă intracelulară de acizi grași și metaboliții acestora a fost implicată ca un mediator cheie al rezistenței la insulină. Acești metaboliți includ diacilglicerol (DAG) (6), ceramidă (7.8) și acil CoA cu lanț lung (9), care s-au dovedit a fi crescute în obezitate și/sau diabet. Într-adevăr, o abordare terapeutică pentru tratamentul rezistenței la insulină este creșterea oxidării acizilor grași, scăzând astfel nivelurile acestor metaboliți. Mai mult, sa demonstrat că manipularea genetică și farmacologică a anumitor gene asociate oxidării acizilor grași pentru a promova oxidarea acizilor grași îmbunătățește sensibilitatea la insulină (10-12).

Deși creșterea oxidării acizilor grași poate atenua rezistența la insulină prin scăderea metaboliților lipidici, alte dovezi sugerează că creșterea oxidării acizilor grași nu poate fi benefică pentru tratamentul rezistenței la insulină la persoanele obeze și diabetice. În primul rând, s-a dovedit că ratele de oxidare a acizilor grași cresc în obezitate și diabet (13,14). În al doilea rând, creșterea oxidării acizilor grași este, de asemenea, asociată cu o creștere a oxidării incomplete a acizilor grași (15,16), care s-a dovedit că promovează rezistența la insulină. Mai mult, creșterea oxidării acizilor grași poate, de asemenea, reduce potențial oxidarea glucozei din mușchi datorită relației reciproce dintre acidul gras și oxidarea glucozei, denumită ciclul Randle (17). Ciclul Randle a fost demonstrat pentru prima dată în inima izolată și în benzi de diafragmă. Cu toate acestea, funcționarea sa în mușchi rămâne încă controversată (18).

Carnitina palmitoiltransferaza-1 (CPT-1) este o enzimă importantă implicată în reglarea oxidării acizilor grași mitocondriali. CPT-1 catalizează conversia acilului CoA cu lanț lung citoplasmatic în acilcarnitină, care apoi intră în mitocondrii pentru β-oxidarea acizilor grași. Această enzimă este localizată pe membrana mitocondrială externă și este enzima care limitează rata de absorbție a acidului gras mitocondrial (19-21). Deși izoformele CPT-1 ale ficatului (22) și ale mușchilor (23) s-au dovedit letale embrionar, s-a demonstrat că inhibarea farmacologică a CPT-1 reduce efectiv oxidarea acizilor grași (16,24).

Oxfenicina (4-hidroxi-1-glicina) este un inhibitor al oxidării acizilor grași care acționează prin inhibarea CPT-1. Transaminarea oxfenicinei în metabolitul său, 4-hidroxifenilglioxilat, este necesară pentru acțiunile sale farmacologice (24). CPT-1 mitocondrial cardiac este mai sensibil la inhibarea oxfenicinei și a 4-hidroxifenilglioxilatului decât isoforma hepatică a CPT-1 (25). Deoarece izoforma musculară a CPT-1 este izoforma predominantă în inimă și mușchiul scheletic (26), administrarea oxfenicinei in vivo ar inhiba preferențial oxidarea acizilor grași în mușchiul scheletic.

În acest studiu, am căutat să stabilim dacă scăderea, mai degrabă decât creșterea oxidării acizilor grași din mușchii scheletici, poate atenua rezistența la insulină a întregului corp. Am emis ipoteza că inhibarea farmacologică a CPT-1 ar scădea oxidarea acizilor grași în timp ce crește oxidarea glucozei printr-un mecanism al ciclului Randle în mușchiul scheletic. De asemenea, am investigat dacă această scădere a oxidării acizilor grași este însoțită de o îmbunătățire a sensibilității la insulină.

PROIECTAREA ȘI METODELE CERCETĂRII

Manipularea animalelor.

Toate studiile au fost aprobate de către Comitetul de politică și bunăstare a animalelor de la Universitatea din Alberta, științele sănătății și au fost conforme cu orientările Consiliului canadian pentru îngrijirea animalelor. Șoarecii masculi C57/BL6 (cu vârsta de 12 săptămâni; 20-25 g) au fost repartizați aleatoriu într-o dietă cu conținut scăzut de grăsimi (LFD) de 13% calorii din grăsimi (4% grăsime în greutate) sau o dietă bogată în grăsimi 60% calorii din grăsimi (Research Diets Inc.) și hrănite cu dieta respectivă timp de 12 săptămâni. Șoarecii au fost adăpostiți câte unul pe cușcă într-o cameră cu temperatură controlată și au fost menținuți pe un ciclu de lumină - întuneric de 12/12 ore. Șoarecii aveau acces ad libitum la alimente și apă. Greutatea corporală și aportul de alimente au fost măsurate în același timp în fiecare zi.

La sfârșitul a 12 săptămâni, animalele au fost injectate zilnic cu inhibitorul CPT-1, oxfenicină (150 mg/kg i.p.) suspendat în 1 × PBS sau controlul vehiculului timp de 4 săptămâni. Testul de toleranță la glucoză (GTT) și testul de toleranță la insulină (ITT) au fost efectuate după 2 săptămâni de tratament cu oxfenicină. Șoarecii au fost posti timp de 16 ore și li s-a administrat o injecție intraperitoneală de glucoză la o doză de 2 g/kg greutate corporală. Glicemia a fost măsurată cu sistemul Accu Check Advantage (Roche) la intervale de 15 min timp de 90 min. La patruzeci și opt de ore după GTT, șoarecii au fost posti timp de 16 ore și li s-a administrat o injecție de insulină intraperitoneală la o doză de 0,3 unități/kg greutate corporală. Glicemia a fost măsurată cu sistemul Accu Check Advantage la intervale de 15 minute timp de 90 de minute.

Evaluarea metabolică in vivo a întregului corp.

Evaluarea metabolică in vivo prin calorimetrie indirectă a fost efectuată folosind Oxymax CLAMS (Columbus Instruments). Animalele au fost inițial aclimatizate în sistem timp de 24 de ore, iar perioada ulterioară de 24 de ore a fost utilizată pentru colectarea datelor.

Testarea capacității de exercițiu.

Capacitatea de exercițiu a fost efectuată prin alergarea animalelor pe o bandă rulantă calibrată, cu motor (Columbus Instruments), la o viteză de 3 m/min timp de 1 min, urmată de creșterea vitezei de 4 m/min timp de 1 min, 5 m/min timp de 1 min, 6 m/min timp de 3 min, 8 m/min timp de 14 min, 9 m/min timp de 10 min, 10 m/min timp de 7 min, 12 m/min timp de 7 min și 14 m/min până la epuizare. Primele 6 minute au fost folosite ca perioadă de aclimatizare pentru animale. Epuizarea a fost determinată ca animalul să petreacă> 10 secunde consecutive pe rețeaua de șoc.

Manipularea țesuturilor.

La sfârșitul protocolului de tratament de 4 săptămâni, animalele au fost ucise printr-o injecție intraperitoneală de pentobarbital de sodiu (12 mg) în stare alimentată, la mijlocul ciclului întunecat. Țesuturile au fost excizate și congelate imediat în azot lichid.

Determinarea intermediarilor lipidici intramiocelulari.

Esterii CoA cu lanț scurt au fost determinați în extracte de acid percloric 6% din țesuturi înghețate, așa cum s-a descris anterior (27). Esterii acil CoA cu lanț lung au fost analizați prin cromatografie lichidă de înaltă performanță, așa cum s-a descris anterior (28). Triacilglicerolul (TAG) a fost extras din țesut conform metodei Folch (29). Diacilglicerolul tisular (DAG) și ceramidele au fost determinate folosind o analiză descrisă anterior (7.30).

Determinarea activităților enzimei mitocondriale.

Activitatea citratului sintază a fost măsurată în omogenatele tisulare prin monitorizarea ratei de reducere a 5,5'-dithio-bis (acid 2-nitrobenzoic) la 412 nm. Activitatea dehidrogenatului β-hidroxiacil CoA (β-HAD) a fost măsurată în omogenizații tisulare prin monitorizarea ratei de dispariție a NADH. Activitatea complexului piruvat dehidrogenazei (PDH) a fost determinată utilizând o modificare a testului enzimei cuplate cu radioizotopi descris anterior (31,32).

Fracționarea membranelor și analiza imunoblotului.

Țesutul praf congelat a fost omogenizat utilizând un omogenizator Polytron timp de 30 s la 4 ° C într-un tampon de omogenizare conținând 50 mmol/L Tris HCI (pH 8), 1 mmol/L EDTA, 10% (greutate/volum) glicerol, 0,02% Brij - 35, inhibitori de fosfatază I și II (1: 100), inhibitori de protează (1: 1000) și 1 mmol/L ditiotreitol. După centrifugare la 10.000 g timp de 20 minute la 4 ° C, conținutul de proteine ​​a fost măsurat folosind testul de proteină Bradford.

În experimentele în care a fost necesară detectarea conținutului de membrană al proteinelor, țesuturile sub formă de pulbere au fost omogenizate și subfracționate prin centrifugare diferențială folosind un kit de extracție a proteinelor disponibil în comerț (Calbiochem). Pentru a determina expresia proteinelor enzimatice, omogenatele au fost supuse SDS-PAGE. După electroforeza pe gel, proteinele fracționate au fost transferate într-o membrană de nitroceluloză folosind o metodă de transfer umed. Tamponul de transfer conținea 25 mmol/L Tris, 192 mmol/L glicină și 20% (v/v) metanol. Membranele au fost blocate cu 10% (g/v) lapte praf degresat în soluție salină tamponată cu Tris cu 0,05% Tween 20 timp de 1 oră la temperatura camerei.

Pentru imunoblotare, membranele au fost incubate cu o cantitate adecvată de anticorpi monoclonali sau policlonali împotriva proteinei de interes la 4 ° C peste noapte. Membranele au fost spălate de trei ori cu soluție salină tamponată cu Tris cu 0,05% Tween 20, apoi testate cu un anticorp secundar conjugat cu peroxidază de hrean. Membranele au fost apoi spălate cu soluție salină tamponată cu Tris cu 0,05% Tween 20. Proteinele țintă au fost vizualizate folosind un kit ECL Western blotting (PerkinElmer Inc, Waltham, MA).