Departamentul de anatomie umană și histologie,

lkb1

Tianjin Medical University Tianjin 300070, (China)

Tel. 13512093065, E-mail [email protected]

Articole similare pentru „”

  • Facebook
  • Stare de nervozitate
  • LinkedIn
  • E-mail

Abstract

Introducere

Problema globală a obezității este asociată cu un risc crescut de boli metabolice, cum ar fi diabetul de tip 2, accident vascular cerebral, boli de inimă, hipertensiune și cancer [1-3]. Obezitatea este probabil cauzată de un dezechilibru energetic caracterizat printr-un aport ridicat de energie în raport cu o cheltuială redusă de energie [4, 5]. Termogeneza în țesutul adipos este un factor important pentru cheltuielile generale de energie; prin urmare, îmbunătățirea termogenezei în țesutul adipos este o strategie terapeutică promițătoare pentru îmbunătățirea condițiilor de obezitate [6-9].

Nucleul arcuit (ARC) al hipotalamusului primește și integrează diferite intrări din organele periferice și controlează ulterior aportul de alimente și cheltuielile de energie [22]. Neuronii ARC sunt împărțiți în două populații distincte care acționează împreună pentru a regla comportamentul de hrănire: cei care exprimă neuropeptidele orexigenice NPY/AgRP (neuropeptidă Y/peptidă asociată agouti) și cei care exprimă peptidele anorexigenice POMC/CART (pro-opiomelanocortină și cocaină și amfetamină -transcriere legată) [23]. Diferiti senzori de energie au fost implicați în mecanismul celular din ARC care reglează metabolismul întregului corp. Reglarea descendentă a AMPKα în ARC favorizează pierderea în greutate corporală și reduce consumul de alimente. Astfel, AMPK este necesar pentru detectarea glucozei atât în ​​neuronii AgRP, cât și în POMC și, prin urmare, pentru controlul echilibrului energetic [24]. Neuronii POMC cu deficit de LKB1 prezintă o alterare a metabolismului hepatic al glucozei, cu o reducere subiacentă a eliberării hormonului de stimulare a α-melanocitului (α-MSH) din hipotalamus [18].

S-a demonstrat că administrarea de virus adeno-asociat (AAV) este sigură și a dus la o expresie pe termen lung și lung în studii preclinice și clinice [25]. Anterior, am descoperit în mod neașteptat că șobolanii cu obezitate indusă de dietă (DIO) au un nivel scăzut de LKB1 în hipotalamus [26]. În studiul de față, pentru a analiza cu precizie efectul anti-obezitate al LKB1 la șobolani DIO, am administrat LKB1 prin livrare AAV în cel de-al treilea ventricul. Am constatat că reglarea în sus a LKB1 în hipotalamus a activat axa neuronilor AMPK-POMC-sistemul nervos simpatic (SNS), care poate elibera epinefrină pentru a favoriza rumenirea grăsimilor albe. În schimb, expresia crescută a MC3R/MC4R a inhibat consumul de alimente. Aceste rezultate sugerează că LKB1 în hipotalamus joacă un rol cheie în reglarea centrală a obezității și oferă o nouă abordare pentru cercetarea echilibrului energetic reglementat central.

Materiale și metode

Animale

Șobolani Sprague-Dawley masculi (140-160 g) au fost cumpărați de la Academia de Științe Militare din Beijing (Beijing, China). Animalele au fost adăpostite într-un mediu controlat, cu temperatură constantă și menținute într-un ciclu standard de lumină/întuneric de 12:12 h (luminile aprinse la ora 07:00, luminile stinse la ora 19:00). Pentru a se acomoda cu noul lor mediu, toți șobolanii au fost hrăniți cu chow de laborator standard și apă disponibilă ad libitum în timpul primei săptămâni. După adaptare, șobolanilor li s-au administrat injecții intraventriculare (ICV) de AAV. După operație, șobolanii au fost împărțiți în mod aleatoriu în patru grupe: (1) grupa chow-fat cu Control-AAV-EGFP (CF-AAV; 2,0 × 108 genomi vectoriali), hrăniți cu chow de laborator standard (3,8 kcal/g); (2) grup cu conținut ridicat de grăsimi cu Control-AAV-EGFP (HF-AAV; 2,0 × 108 genomi vectoriali); (3) grup cu conținut ridicat de grăsimi cu un titru scăzut de LKB1-AAV-EGFP (HF-LKB1-L; 2,0 × 108 genomi vectoriali); și (4) grup cu conținut ridicat de grăsimi cu un titru ridicat de LKB1-AAV-EGFP (HF-LKB1-H; 2,0 × 1010 genomi vectoriali), hrănit cu o dietă bogată în grăsimi (HFD; 4,76 kcal/g). Greutatea corporală a fost înregistrată săptămânal. Aportul alimentar a fost măsurat zilnic. După hrănire timp de 9 săptămâni, țesutul adipos, ficatul și hipotalamusul au fost colectate la sfârșitul studiului.

Toate procedurile de îngrijire a animalelor au fost efectuate în conformitate cu Ghidurile Comitetului de îngrijire a animalelor de la Universitatea de Medicină din Tianjin.

Proiectare și pregătire vector AAV

Clonarea și mutageneza au fost efectuate prin tehnici standard. Pentru pregătirea vectorilor, au fost utilizate două tipuri de transgen: Control-AAV-EGFP (gena EGFP condusă de promotorul CMV) și LKB1-AAV-EGFP (gena LKB1 condusă de promotorul CMV). Vectorii AAV au fost generați prin transfecția celulelor AAV-293 așa cum s-a descris anterior [27]. Titrurile fizice (în genomii vectorului pe microlitru) au fost determinate prin PCR cantitativă pe un cicler termic 2720 (Applied Biosystems, Camarillo, SUA) utilizând un kit de clonare In-Fusion ™ PCR (Clontech, SUA) și următorul set de exemple: înainte, 5 ′ -TGG AGG TAG TGG AAT GGA TCC CGC CAC CAT GGA CGT GGC TGA CCC CCA GC-3 ′ și invers, 5′-CTC ACC ATG GTG GCG GGA TCCTGC TGC TTG CAG GCC GAG AGC-3 ′.

Injecții cu ICV

Pentru a administra supraexpresia LKB1, șobolanii au fost anesteziați prin injecție intraperitoneală de pentobarbiturat și poziționați pe un cadru stereotactic (KOPF, Germania). Pielea de pe craniu a fost incizată și s-a făcut o mică gaură în craniu deasupra țintei folosind un microfor. Coordonatele stereotactice au fost 0,8 mm posterioare bregmei și 6,5 mm ventrale ale suprafeței craniului [28]. Un volum total de 4 uL a fost injectat folosind o seringă de 10 uL (Hamilton Co., Reno, NV). Gena LKB1 mediată de AAV a fost injectată la diferite titruri (scăzut: 2,0 × 10 8 genomi vector; mare: 2,0 × 10 10 genomi vector) și la un debit de 1 µL/min, după care acul a fost lăsat în poziție pentru 2 minute pentru a preveni refluxul înainte de retragere.

Analiză de scanare cu absorbție de raze X cu energie duală

La sfârșitul experimentelor, măsurătorile au fost efectuate folosind absorptiometria cu raze X cu energie duală periferică (pDXA), așa cum a fost descris anterior [29].

Analiza lipidelor din sânge

Concentrațiile trigliceridelor hepatice (TG), colesterolului total seric (TC), ale colesterolului lipoproteic cu densitate ridicată (HDL-C) și ale colesterolului lipoproteinelor cu densitate mică (LDL-C) au fost măsurate folosind un kit de reactivi chimici, Institutul de Inginerie Biologică Nanjing Jiancheng, Nanjing, China).

Măsurarea nivelurilor de epinefrină

Nivelurile serice de epinefrină au fost măsurate utilizând un kit de testare imunosorbent legat de enzime (NOVUS, Ontario, Canada) în conformitate cu liniile directoare ale producătorului.

Examinări histologice

La sfârșitul tratamentelor, WAT și ficatul fiecărui șobolan au fost îndepărtate și depozitate pentru examinări histologice. Probele de țesut adipos au fost conservate în paraformaldehidă 4% timp de 48 de ore, încorporate în parafină, secționate la o grosime de 6 μm și apoi colorate cu hematoxilină și eozină folosind proceduri standard. Pentru colorarea cu ulei roșu O, țesuturile hepatice au fost înghețate în azot lichid și tăiate în secțiuni de 8 um. Secțiunile au fost colorate și analizate la mărirea 200 × folosind un microscop. În plus, ADN-ul țesutului adipos epididimal a fost extras cu un kit de ADN (Tianjin Baibei Biology Engineering Institute, Tianjin, China). Secțiunile înghețate ale hipotalamusului au fost analizate cu colorare imunohistochimică (IHC) pentru NPY și POMC (diluție 1: 1000; Abcam, Cambridge, Anglia).

Extracție totală de ARN și PCR în timp real

ARN-ul total a fost izolat din țesutul adipos de reactivul TRIzol (Invitrogen, Camarillo, SUA). Concentrația ARN-ului total a fost măsurată cu un spectrofotometru, iar ADNc a fost sintetizat din ARN (1 μg) folosind un kit de sinteză ADNc (Thermo, Camarillo, SUA) conform instrucțiunilor producătorului. ADNc nou sintetizat a fost amplificat cu primeri specifici și reacții SYBR Green folosind SYBR Green qPCR Supermix (Invitrogen). β-actina a fost utilizată ca control intern. PCR pentru fiecare genă a fost efectuată timp de 40 de cicluri la 95 ° C timp de 15 sec și 60 ° C timp de 1 min. Testul t al studentului a fost folosit pentru a evalua semnificația statistică. Secvențele seturilor de grund utilizate în acest studiu sunt enumerate în Tabelul 1.

tabelul 1.

Secvența primară utilizată pentru PCR cantitativă în timp real

Western blot

Proteina celulară totală din probe de țesut adipos și hipotalamus a fost recoltată și lizată în tampon RIPA amestecat cu un cocktail complet de inhibitor de protează. Concentrația de proteine ​​a fost determinată folosind un kit de testare a proteinelor BCA. Apoi, 30-100 pg din fiecare probă de proteină denaturată au fost separate pe un gel de electroforeză cu gel de dodecil sulfat de sodiu 10-12% și transferate într-o membrană de fluorură de poliviniliden. Membrana a fost blocată timp de 2 ore la temperatura camerei într-o soluție de blocare a laptelui fără grăsimi de 5%, urmată de incubare peste noapte la 4 ° C separat cu anti-LKB1, anti-MC3R, anti-MC4R (Abcam); anticorpi anti-AMPKα, anti-fosforilat (p) -AMPKα și anti-UCP1 (Cell Signaling, Massachusetts, SUA); GAPDH a fost folosit ca control de încărcare. După incubarea peste noapte, membrana a fost incubată cu un anticorp secundar conjugat cu HRP (1: 8000; Promega, Madison, SUA) timp de 2 ore la temperatura camerei. Complexele imune rezultate au fost detectate folosind un instrument de chemiluminescență îmbunătățit (CLiNX Science Instruments, Shanghai, China). Benzile de proteine ​​au fost vizualizate prin autoradiografie, iar intensitățile au fost analizate folosind ImageJ.

analize statistice

Rezultatele sunt exprimate ca medie ± eroare standard a mediei (SEM). Toate analizele statistice au fost efectuate folosind SPSS. Datele au fost analizate pentru semnificația statistică utilizând testul t Student și analiza unică a varianței și testul post hoc al lui Bonferroni. Semnificația a fost stabilită la p 0,05). Aceste rezultate sugerează că șobolanii tratați cu LKB1 au câștigat masă slabă și mai puțină masă grasă.

Supraexprimarea LKB1 a modificat histopatologia șobolanilor hrăniți cu HFD

Am evaluat posibile modificări fenotipice ale WAT la modularea expresiei hipotalamice LKB1. Histopatologia WAT ​​a arătat că șobolanii grupului HF-AAV au avut adipocite mai mari decât celelalte grupuri, în timp ce conținutul total de ADN a fost cel mai mic dintre toate grupurile (Fig. 3A-B). Mai mult, administrarea LKB1 a condus la picături de lipide mai mici în WAT, implicând o activitate metabolică ridicată. În ceea ce privește controalele, conținutul de ADN a fost comparabil în toate grupurile (Fig. 3B). Colorarea cu ulei roșu O a sugerat că șobolanii HF-AAV au picături lipidice mai mari și au dezvoltat ficat gras. Cu toate acestea, tratamentul cu LKB1 a dus la o îmbunătățire notabilă a picăturilor de lipide și a steatozei hepatice (Fig. 3C). În plus, am măsurat conținutul de lipide hepatice. Comparativ cu grupul CF-AAV, nivelurile TG hepatice au crescut semnificativ la șobolanii din grupul HF-AAV (p = 0,000). Nivelurile TG au scăzut semnificativ în grupurile HF-LKB1-H și HF-LKB1-L cu 26,7% și, respectiv, 21,6%, comparativ cu grupul HF-AAV (Fig. 3D). Așa cum se arată în FIG. Șobolanii tratați cu 3E-F, LKB1 au avut semnificativ mai multă masă BAT decât grupurile CF-AAV și HF-AAV. Aceste rezultate au arătat că tratamentul cu LKB1 a atenuat hipertrofia adipocitelor indusă de HFD în WAT, a prevenit steatoza hepatică și a promovat formarea BAT.

FIG. 3.

LKB1 a modificat histopatologia șobolanilor. (A) Secțiunile WAT încorporate în parafină au fost colorate cu hematoxilină și eozină. (B) S-a măsurat conținutul de ADN al WAT epididimului (mărire: × 200; bară de scală: 100 µm). (C) Secțiunile de ficat înghețate au fost colorate cu roșu de ulei O. (D) Nivelurile de TG ale ficatului au fost măsurate în toate grupurile. (E) BAT în regiunea interscapulară. (F) S-a măsurat greutatea BAT interscapulară. Datele sunt media ± SEM. * p # p ### p ### p # p ### p ╄╄╄ p ** p *** p # p ### p ╄╄╄ p