Srinivas D. Sithu, Marina V. Malovichko, Krista A. Riggs, Nalinie S. Wickramasinghe, Millicent G. Winner, Abhinav Agarwal, Rihab E. Hamed-Berair, Anuradha Kalani, Daniel W. Riggs, Aruni Bhatnagar și Sanjay Srivastava

Institutul de Cardiologie Moleculară și Centrul de Diabet și Obezitate, Universitatea din Louisville, Louisville, Kentucky, SUA.

metabolică

Adresă corespondență către: Sanjay Srivastava, Departamentul de Medicină, Divizia de Medicină Cardiovasculară, 204 F, Clădirea Delia Baxter, 580 South Preston Street, Universitatea din Louisville, Louisville, Kentucky 40202, SUA. Telefon: 502.852.5834; E-mail: [email protected].

Institutul de Cardiologie Moleculară și Centrul de Diabet și Obezitate, Universitatea din Louisville, Louisville, Kentucky, SUA.

Adresă corespondență către: Sanjay Srivastava, Departamentul de Medicină, Divizia de Medicină Cardiovasculară, 204 F, Clădirea Delia Baxter, 580 South Preston Street, Universitatea din Louisville, Louisville, Kentucky 40202, SUA. Telefon: 502.852.5834; E-mail: [email protected].

Găsiți articole de Malovichko, M. în: JCI | PubMed | Google Scholar

Institutul de Cardiologie Moleculară și Centrul de Diabet și Obezitate, Universitatea din Louisville, Louisville, Kentucky, SUA.

Adresă corespondență către: Sanjay Srivastava, Departamentul de Medicină, Divizia de Medicină Cardiovasculară, 204 F, Clădirea Delia Baxter, 580 South Preston Street, Universitatea din Louisville, Louisville, Kentucky 40202, SUA. Telefon: 502.852.5834; E-mail: [email protected].

Institutul de Cardiologie Moleculară și Centrul de Diabet și Obezitate, Universitatea din Louisville, Louisville, Kentucky, SUA.

Adresă corespondență către: Sanjay Srivastava, Departamentul de Medicină, Divizia de Medicină Cardiovasculară, 204 F, Clădirea Delia Baxter, 580 South Preston Street, Universitatea din Louisville, Louisville, Kentucky 40202, SUA. Telefon: 502.852.5834; E-mail: [email protected].

Găsiți articole de Wickramasinghe, N. în: JCI | PubMed | Google Scholar

Institutul de Cardiologie Moleculară și Centrul de Diabet și Obezitate, Universitatea din Louisville, Louisville, Kentucky, SUA.

Adresă corespondență către: Sanjay Srivastava, Departamentul de Medicină, Divizia de Medicină Cardiovasculară, 204 F, Clădirea Delia Baxter, 580 South Preston Street, Universitatea din Louisville, Louisville, Kentucky 40202, SUA. Telefon: 502.852.5834; E-mail: [email protected].

Institutul de Cardiologie Moleculară și Centrul de Diabet și Obezitate, Universitatea din Louisville, Louisville, Kentucky, SUA.

Adresă corespondență către: Sanjay Srivastava, Departamentul de Medicină, Divizia de Medicină Cardiovasculară, 204 F, Clădirea Delia Baxter, 580 South Preston Street, Universitatea din Louisville, Louisville, Kentucky 40202, SUA. Telefon: 502.852.5834; E-mail: [email protected].

Găsiți articole de Agarwal, A. în: JCI | PubMed | Google Scholar

Institutul de Cardiologie Moleculară și Centrul de Diabet și Obezitate, Universitatea din Louisville, Louisville, Kentucky, SUA.

Adresă corespondență către: Sanjay Srivastava, Departamentul de Medicină, Divizia de Medicină Cardiovasculară, 204 F, Clădirea Delia Baxter, 580 South Preston Street, Universitatea din Louisville, Louisville, Kentucky 40202, SUA. Telefon: 502.852.5834; E-mail: [email protected].

Găsiți articole de Hamed-Berair, R. în: JCI | PubMed | Google Scholar

Institutul de Cardiologie Moleculară și Centrul de Diabet și Obezitate, Universitatea din Louisville, Louisville, Kentucky, SUA.

Adresă corespondență către: Sanjay Srivastava, Departamentul de Medicină, Divizia de Medicină Cardiovasculară, 204 F, Clădirea Delia Baxter, 580 South Preston Street, Universitatea din Louisville, Louisville, Kentucky 40202, SUA. Telefon: 502.852.5834; E-mail: [email protected].

Institutul de Cardiologie Moleculară și Centrul de Diabet și Obezitate, Universitatea din Louisville, Louisville, Kentucky, SUA.

Adresă corespondență către: Sanjay Srivastava, Departamentul de Medicină, Divizia de Medicină Cardiovasculară, 204 F, Clădirea Delia Baxter, 580 South Preston Street, Universitatea din Louisville, Louisville, Kentucky 40202, SUA. Telefon: 502.852.5834; E-mail: [email protected].

Institutul de Cardiologie Moleculară și Centrul de Diabet și Obezitate, Universitatea din Louisville, Louisville, Kentucky, SUA.

Adresă corespondență către: Sanjay Srivastava, Departamentul de Medicină, Divizia de Medicină Cardiovasculară, 204 F, Clădirea Delia Baxter, 580 South Preston Street, Universitatea din Louisville, Louisville, Kentucky 40202, SUA. Telefon: 502.852.5834; E-mail: [email protected].

Găsiți articole de Bhatnagar, A. în: JCI | PubMed | Google Scholar

Institutul de Cardiologie Moleculară și Centrul de Diabet și Obezitate, Universitatea din Louisville, Louisville, Kentucky, SUA.

Adresă corespondență către: Sanjay Srivastava, Departamentul de Medicină, Divizia de Medicină Cardiovasculară, 204 F, Clădirea Delia Baxter, 580 South Preston Street, Universitatea din Louisville, Louisville, Kentucky 40202, SUA. Telefon: 502.852.5834; E-mail: [email protected].

Găsiți articole de Srivastava, S. în: JCI | PubMed | Google Scholar

Publicat pe 4 mai 2017 - Mai multe informații

Deși investigațiile care utilizează șoareci modificați genetic au dat rezultate importante mecanismice asupra aterogenezei, aceste modele au limitări semnificative. Leziunile aterosclerotice la șoareci se dezvoltă numai sub hipercolesterolemie severă, iar rata, locul și natura acestor leziuni sunt distinct diferite de cele ale plăcilor aterosclerotice umane (2). Mai mult, utilizarea exclusivă a modelelor de șoarece face dificilă excluderea efectelor dependente de model și de specie sau identificarea caracteristicilor suplimentare ale aterosclerozei care ar putea fi importante la om, dar nu evidente la șoareci. Prin urmare, sunt necesare noi modele animale pentru a studia procesul aterogenezei și pentru a evalua rolul hipercolesterolemiei și al altor factori care contribuie la formarea leziunilor aterosclerotice. În acest manuscris, descriem un nou model de șobolan dezvoltat prin ștergerea Ldlr. Acest model ar putea fi util pentru studierea nu numai a aterogenezei, ci și a obezității și a rezistenței la insulină.

Dislipidemie în Ldlr-Șobolani KO. Șobolanii au fost menținuți pe chow normal (NC) timp de 64 de săptămâni, iar sângele și ficatul au fost colectate după un post de 6 ore. (A) Western blots reprezentative (n = 3-4/grup) de omogenate hepatice ale Ldlr-Șobolanii KO și WT testați cu receptor anti-LDL; casetă anti-ATP, subfamilie A, membru 1 (ABCA1); și casetă anti-ATP, anticorpi subfamilia G1 (ABCG1). (B) Analize PCR cantitative pentru expresia ARNm a receptorilor de lipoproteine ​​din ficatul Ldlr-Șobolani KO și WT (n = 5/grup). (C și D) Cursul de timp al colesterolului plasmatic și, respectiv, al trigliceridelor Ldlr-KO (n = 5-9) și WTn = 5-9) șobolani. (E) Nivelurile de proproteină convertază plasmatică subtilizină kexin 9 (PCSK9) la nivelurile șobolanilor în vârstă de 62 de săptămâni (n = 6-8/grup). Student cu două cozi fără pereche t testul a fost utilizat pentru analiza datelor din panouri B și E, și ANOVA cu 2 căi a fost utilizat pentru analiza datelor în panouri C și D. Valorile sunt medii ± SEM. *P 6), cu excepția că - spre deosebire de Ldlr-Șoareci KO, care prezintă niveluri normale de trigliceride - Ldlr-Șobolanii KO au prezentat niveluri de trigliceride plasmatice de 1,8 ori mai mari decât șobolanii WT.

Lipoproteine ​​plasmatice în Ldlr-Șobolani KO. Profilurile lipoproteice ale WT și Ldlr-Șobolanii KO au fost menținuți pe chow normal (NC) timp de 64 de săptămâni. (A) Cromatogramă reprezentativă a separării lipoproteinelor pe cromatografie lichidă rapidă pe proteine ​​(FPLC) pe o coloană Superose 6 echilibrată cu PBS. Plasma a fost aplicată pe coloană, iar probele au fost eluate izocratic cu PBS. Colesterolul recuperat în eluat FPLC (fracții de 0,5 ml) a fost măsurat așa cum este descris în Metode. Datele arată nivelul colesterolului în 125 ml WT și 50 ml plasmă KO. (B) Abundența lipoproteinelor totale în plasmă (n = 5/grup). (C și D) Nivelurile apolipoproteinei totale B (apoB) în plasmă (n = 6-8/grup) și distribuția relativă a apoB100 și apoB48 în VLDL obținută din plasma delipidată (grupată de la 5 șobolani/grup), separată pe 3% SDS-PAGE și colorată cu argint. (E și F) Nivelurile apolipoproteinei plasmatice A-V (apoA-V) și, respectiv, activitatea lipoproteinelor lipazice (n = 5-8/grup). Student cu două cozi fără pereche t testul a fost utilizat pentru analiza datelor. Valorile sunt medii ± SEM. *P Parametri măsurați în plasmă și ficat la șobolani Ldlr-KO

Caracterizarea ulterioară a lipoproteinelor la șobolanii KO nu a indicat nicio modificare apreciabilă a dimensiunii particulelor diferitelor clase de lipoproteine ​​(Tabelul 1). Deoarece nivelurile VLDL au fost crescute la șobolanii KO, am examinat modificările nivelurilor plasmatice ale apolipoproteinei B (apoB), care este proteina majoră asociată cu VLDL. Deficitul de Ldlr nu a afectat nivelurile totale de apoB din plasmă (Figura 2C); cu toate acestea, colorarea cu argint a proteinei separate pe SDS-PAGE a dezvăluit că Ldlr deficiența a fost asociată cu o creștere a nivelurilor de apoB100 și a raportului apoB100/apoB 48 (Figura 2D). La rozătoare, apoB100 este eliminat în principal de LDLR (11), în timp ce apoB48, care nu conține regiunea de legare a LDLR (12), nu este recunoscută de receptor. Prin urmare, creșterea relativă a apoB100 vs. apoB48 la șobolani KO sugerează o lipsă de Ldlr-clearance-ul mediat al apoB100 conținând particule VLDL. O creștere similară a apoB100, comparativ cu apoB48, a fost observată în Ldlr-Șoareci KO (11).

pentru că Ldlr deficiența a fost asociată cu o creștere a trigliceridelor, am examinat dacă Ldlr deficiența afectează sinteza sau degradarea hepatică a trigliceridelor. Pentru a măsura producția hepatică de trigliceride, independent de îndepărtarea lor, am inhibat clearance-ul trigliceridelor plasmatice folosind tiloxapol și am măsurat aspectul trigliceridelor în plasmă. Am constatat că rata secreției de trigliceride la șobolani KO a fost comparabilă cu cea obținută cu șobolani WT (Figura suplimentară 1; material suplimentar disponibil online cu acest articol; https://doi.org/10.1172/jci.insight.86442DS1), sugerând că este puțin probabil ca creșterea trigliceridelor plasmatice să fie datorată creșterii producției hepatice de trigliceride. Pentru a examina modificările degradării trigliceridelor, am examinat axa apoA-V - lipoproteină lipază (LPL). Studiile anterioare au arătat că apoA-V, asociat cu particule HDl și VLDL, promovează hidroliza trigliceridelor prin activarea LPL (13). Așa cum se arată în Figura 2E, nivelurile de apoA-V au fost cu 18% mai mici la KO decât șobolanii WT. Aceasta a fost însoțită de o scădere de 75% a activității LPL (Figura 2F). Luate împreună, aceste observații sugerează că hipertrigliceridemia la șobolanii KO poate fi parțial legată de scăderea lipolizei și catabolismul trigliceridelor prin LPL.

Nivelurile de citokine plasmatice la șobolanii Ldlr-KO

Găzduirea și dieta animalelor. Ldlr-Șobolanii KO au fost generați la laboratorul SAGE. Pe scurt, un total de 337 bp au fost șterse la joncțiunea intronului 3 și exonului 4 (pe cromozomul 8), iar 4 bp ccgt au fost inserate utilizând tehnologia degetului de zinc. Deleția a fost efectuată cu următoarea secvență: agagacaggtgtgttgtagctttctgggcctttgcctactaccaccatgtttttttgaggcacagggtcctgtctgtgagtaggctggtgtgtggtggtatgagccatagcatgacagggcgctctcctctctgtgcacccccacagcccccaagacgtgctccctggatgagttccgctgccaggatggcaagtgcatctcccggcagtttgtgtgtgaccaagactgggattgcctggatggctctgacgaggcccactgtgcggccaccacttgtggccctgctcacttccgctgcaactcctcttcctgcatccccagcctgtgggcctgcga. Detaliile kiturilor de nuclează cu degetul de zinc sunt descrise în tabelele suplimentare 1-3. Nucleaze deget de zinc transcrise ARNm (in vitro) au fost injectate la embrioni de șobolan la concentrația de 5 ng/μl. Au fost injectate un total de 299 de embrioni, dintre care 181 de embrioni au supraviețuit și au fost transferați la 4 destinatari. Acest lucru a dus la nașterea a 35 de pui. Unul din 35 de pui era mutant. Deși rata generării indel a fost scăzută la acești șobolani, șobolanul rezultat a fost fertil și suficient pentru a stabili colonia de Ldlr-Șobolani KO. Eficiența generării de indel poate fi îmbunătățită prin editarea genomului direcționată de CRISPR/Cas9 (59).

Experimentele au fost efectuate la șobolani care au fost încrucișați timp de 5-7 generații pe fondul Sprague-Dawley. Bărbat de șase săptămâni Ldlr-Șobolanii KO și WT Sprague-Dawley (laboratoarele Harlan) au fost adăpostiți în condiții fără patogeni în vivariul Universității din Louisville sub temperatură controlată și ciclu de lumină de 12 ore/întuneric de 12 ore și menținut pe NC (5,5% grăsime; LabDiet). Începând cu vârsta de 12 săptămâni, șobolanii au fost fie hrăniți cu WD (42% grăsime; Harlan Laboratories; WT [n = 10] și Ldlr-KO [n = 16]) sau a continuat să fie menținut pe NC [WT [n = 9] și LDLR-KO [n = 8]). Șobolanii au fost eutanasiați după 16, 34, 42 și 52 de săptămâni de WD, iar plasma, inima, aorta și ficatul lor au fost recoltate.

Izolarea ARN și analize PCR cantitative. Primeri pentru receptorii lipoproteinelor au fost obținuți din Qiagen, iar analiza cantitativă PCR (qPCR) a fost efectuată așa cum este descris (60).

Analize Western blot. Anticorpii anti-LDLR (AB30532; 1: 1.000) și anti-ABCA1 (AB.H10; 1: 1.000) au fost obținuți de la Abcam; anticorpul anti-ABCG1 (NB110-55438; 1: 5.000) a fost achiziționat de la Novus Biologicals; și anticorpul anti-tublin (T6074; 1: 3.000) a fost cumpărat de la Sigma-Aldrich. Western blot a fost efectuat pe omogenate hepatice folosind tehnici standard.

Analize ale glicemiei și lipoproteinelor plasmatice. Sângele a fost colectat la fiecare 4 săptămâni din vena cozii după un post de 6 ore, iar glicemia a fost măsurată cu ajutorul unui glucometru ACCU-CHEK Aviva. Nivelurile de colesterol și trigliceride din plasmă au fost măsurate conform descrierii (61, 62). Pentru cuantificarea colesterolului și a trigliceridelor din ficat, țesutul a fost pulverizat și lipidele au fost extrase așa cum este descris de Bligh și Dyer (63). Solvenții au fost evaporați sub azot, iar reziduul a fost dizolvat în 5% BSA. Colesterolul și trigliceridele au fost măsurate așa cum s-a descris mai sus. Distribuția colesterolului în lipoproteine ​​a fost evaluată prin cromatografie de excludere a mărimii pe FPLC (62). Dimensiunea particulelor lipoproteinelor a fost măsurată prin RMN așa cum este descris (64).

Secreția de trigliceride hepatice. Viteza de secreție a trigliceridelor hepatice a fost măsurată așa cum a fost descris de Huang și colab. (65). Pe scurt, șobolanii au fost postiti peste noapte pentru a îndepărta chilomicronii din plasmă. După obținerea probelor de bază, șobolanii au primit o injecție în bolus de tiloxapol (triton WR1339, Sigma-Aldrich; 300 mg/kg, i.v.) în vena cozii. Probele de sânge au fost colectate la 0, 60, 90, 120 și 150 de minute după injecția cu tiloxapol, iar conținutul de trigliceride a fost măsurat în plasmă. Ratele de secreție a trigliceridelor pentru fiecare șobolan au fost calculate prin regresia liniară simplă a nivelurilor trigliceridelor plasmatice (mg/kg greutate corporală) ca variabilă dependentă și timpul de măsurare (ore) ca variabilă independentă.

Test de toleranță la glucoză și insulină. GTT-urile au fost efectuate după un post de 18 ore prin injectarea D-glucozei (1 g/kg; i.p.) în ser fiziologic steril, așa cum este descris (66). Testele de toleranță la insulină au fost efectuate pe animale non-fastid prin injectarea de Humulin R (1,5 U/kg, i.p.; Lilly) (66).

Parametrii de chimie clinică. Proteina totală, albumina, ALT, AST, creatinina, CK și NEFA din plasmă au fost măsurate pe analizorul chimic MIRA așa cum este descris (64).

ELISA. Niveluri de leptină (Eve Technologies Corporation), adiponectină (sisteme de cercetare și dezvoltare), insulină (Mercodia), PCSK9 (MBL International), fibrinogen (cercetare inovatoare), PAI-1 (cercetare inovatoare), apoB (MyBioSource), apolipoproteină AV (Navatein Biosciences ) și lipoprotein lipaza (Cercetarea anticorpilor) din plasmă au fost măsurate prin ELISA conform instrucțiunilor producătorului. Activitatea lipoproteinei lipazei plasmatice a fost măsurată folosind trusa de la Cell Biolabs Inc. (Catalog STA-610).

Electroforeza apoB100 și apoB48. VLDL plasmatic a fost izolat prin ultracentrifugare (67). VLDL a fost delipidat, electroforizat pe un gel de acrilamidă 3% (în casă) și colorat cu argint (24).

Analiza leziunilor aterosclerotice. Leziunile au fost examinate în tot arborele aortic așa cum este descris (61, 62, 64, 68). Leziunile din supapa aortică au fost examinate în secțiunile fixate OCT la mărire de 2 × după colorarea cu roșu uleios. Leziunile din artera coronariană au fost examinate după colorarea cu H&E.

Analiza imunohistochimică. Analizele imunohistochimice au fost efectuate pe secțiuni fixate în formalină ale aortei abdominale, așa cum s-a descris anterior (62, 68). Pe scurt, secțiunile (5 μm) au fost deparafinizate și rehidratate. Secțiunile au fost incubate cu anticorpi anti-CD68 (MCA1957A647, clona FA-11, Bio-Rad), anti-TNFα, anti - MCP-1 și anti - IL-6 (ab6671, ab25124 și, respectiv, ab9324; Abcam) anticorpi pentru 18 ore la 4 ° C urmată de colorare cu IgG - Alx488 anti - iepure sau anti - șoarece și capră (A11008 și respectiv A11001, Invitrogen). Imaginile digitale au fost achiziționate la mărire × 60.

Statistici. Datele sunt exprimate ca medie ± SEM. Student cu două cozi fără pereche t testul a fost utilizat pentru analiza datelor atunci când datele au fost limitate la 2 grupuri. ANOVA bidirecțională urmată de post-testele Bonferroni au fost utilizate pentru a compara mai mult de 2 grupuri experimentale. Semnificația statistică a fost acceptată la P Aprobarea studiului. Protocoalele animale pentru studiu au fost aprobate de către comitetul de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea din Louisville (numărul IACUC 16670).

SS și AB au proiectat experimentele, au făcut analize critice ale datelor, au furnizat resursele și au scris manuscrisul. SDS, MVM, NSW, AA, AK și REHB au efectuat experimentele, au achiziționat și au analizat datele și au scris secțiuni ale manuscriselor. KAR, MGW și DWR au efectuat experimentele, au obținut date și au efectuat analize de date.

Această lucrare a fost susținută parțial de granturile NIH HL95593, HL120746 și ES17260 (către SS) și GM 103492 și P50 HL120163 către (AB).

Conflict de interese: Autorii au declarat că nu există niciun conflict de interese.