Roluri Conceptualizare, Curarea datelor, Analiza formală, Scriere - schiță originală

congenitală

Divizia de afiliere a patologiei anatomice și moleculare, Departamentul de patologie și imunologie, Washington University School of Medicine, St. Louis, MO, Statele Unite ale Americii

Roluri Conceptualizare, curatarea datelor

Divizia de afiliere a patologiei anatomice și moleculare, Departamentul de patologie și imunologie, Washington University School of Medicine, St. Louis, MO, Statele Unite ale Americii

Roluri Curarea datelor, investigații, validare

Divizia de afiliere a laboratorului și medicinii genomice, Departamentul de patologie și imunologie, Școala de Medicină a Universității Washington, St. Louis, MO, Statele Unite ale Americii

Roluri Curarea datelor

Divizia de afiliere a patologiei anatomice și moleculare, Departamentul de patologie și imunologie, Washington University School of Medicine, St. Louis, MO, Statele Unite ale Americii, Centrul de Medicină Translațională, Primul spital afiliat al Universității Xi’an Jiaotong, Xi’an, Shanxi, Republica Populară Chineză

Roluri Conceptualizare, curatarea datelor

Divizia de afiliere a bolilor osoase și minerale, Departamentul de Medicină, Școala de Medicină a Universității Washington, St. Louis, MO, Statele Unite ale Americii

Roluri Conceptualizare, curatarea datelor

Divizia de afiliere a bolilor osoase și minerale, Departamentul de Medicină, Școala de Medicină a Universității Washington, St. Louis, MO, Statele Unite ale Americii

Roluri Curarea datelor

Departamentul de Afiliere pentru Chirurgie Ortopedică, Washington University School of Medicine, St. Louis, MO, Statele Unite ale Americii

Roluri Curarea datelor

Departamentul de Afiliere pentru Chirurgie Ortopedică, Washington University School of Medicine, St. Louis, MO, Statele Unite ale Americii

Roluri Conceptualizare, Scriere - recenzie și editare

Departamentul de Afiliere pentru Chirurgie Ortopedică, Washington University School of Medicine, St. Louis, MO, Statele Unite ale Americii

Roluri Conceptualizare, Analiză formală, Vizualizare

Divizia de afiliere pentru endocrinologie, metabolizare și cercetarea lipidelor, Departamentul de Medicină, Școala de Medicină a Universității Washington, St. Louis, MO, Statele Unite ale Americii

Roluri Conceptualizare, achiziție de fonduri, supraveghere, scriere - revizuire și editare

Divizia de afiliere a patologiei anatomice și moleculare, Departamentul de patologie și imunologie, Washington University School of Medicine, St. Louis, MO, Statele Unite ale Americii, Divizia de Boli osoase și minerale, Departamentul de Medicină, Școala de Medicină a Universității Washington, St. Louis. Louis, MO, Statele Unite ale Americii

  • Wei Zou,
  • Nidhi Rohatgi,
  • Jonathan R. Brestoff,
  • Yan Zhang,
  • Erica L. Scheller,
  • Clarissa S. Craft,
  • Michael D. Brodt,
  • Nicole Migotsky,
  • Matthew J. Silva,
  • Charles A. Harris

Cifre

Abstract

Lipodistrofia generalizată congenitală Berardinelli-Seip este asociată cu creșterea masei osoase sugerând că țesutul adipos reglează scheletul. Deoarece există puține informații mecaniciste cu privire la această problemă, am generat șoareci „fără grăsimi” (FF) lipsiți complet de grăsime viscerală, subcutanată și brună vizibilă. Datorită activității osteoblastice robuste, volumul osos trabecular și cortical este semnificativ îmbunătățit la aceste animale. Șoarecii FF, la fel ca pacienții Berardinelli-Seip, sunt diabetici, dar normalizează toleranța la glucoză și reduc semnificativ insulina circulantă care nu își modifică fenotipul scheletic. Important, fenotipul scheletal al șoarecilor FF este complet salvat prin transplant de precursori adipocitari sau depozite de grăsime albă sau brună, indicând faptul că produsele derivate din adipocite reglează masa osoasă. Confirmând acest lucru este cazul, transplantul de grăsime derivată din șoareci adiponectină și leptină dublă knockout, spre deosebire de cel obținut de la omologii lor WT, nu reușește să normalizeze osul FF. Aceste observații sugerează o lipsă de leptină și adiponectină poate contribui la creșterea masei osoase a pacienților cu Berardinelli-Seip.

Rezumatul autorului

Lipodistrofia generalizată congenitală Berardinelli-Seip este o tulburare umană asociată cu creșterea masei osoase, sugerând că grăsimea, în sine, reglează scheletul. Pentru a testa această ipoteză am generat un model murin de lipodistrofie congenitală generalizată în care atât țesutul adipos maro, cât și cel alb sunt complet epuizate în timpul embriogenezei. Aceste „fără grăsimi” (FF) prezintă o creștere semnificativă a masei osoase pe tot corpul. Masa osoasă crescută reprezintă stimularea formării osoase și nu descompunerea osoasă întârziată. În plus, masa osoasă crescută a șoarecilor FF crește semnificativ rezistența scheletului și rezistența la fractură. La fel ca pacienții cu lipodistrofie congenitală, șoarecii FF sunt diabetici, însă starea lor metabolică nu contribuie la creșterea masei osoase. Pentru a identifica moleculele produse de grăsime care reglează masa osoasă, am transplantat țesut adipos modificat genetic în șoareci FF, ceea ce a stabilit că absența moleculelor produse de grăsime, adiponectina și leptina, îmbunătățește semnificativ formarea osoasă. Aceste observații sugerează că reducerea efectului combinat al adiponectinei și leptinei asupra osului va crește abundența și rezistența la fractură.

Citare: Zou W, Rohatgi N, Brestoff JR, Zhang Y, Scheller EL, Craft CS și colab. (2019) Lipodistrofia congenitală induce osteoscleroză severă. PLoS Genet 15 (6): e1008244. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1008244

Editor: Roland Baron, Medicină Orală, Infecție și Imunitate Harvard School of Dental Medicine, STATELE UNITE

Primit: 2 ianuarie 2019; Admis: 12 iunie 2019; Publicat: 24 iunie 2019

Disponibilitatea datelor: Toate datele relevante se află în manuscris și în fișierele sale de informații suport.

Finanțarea: Această lucrare a fost susținută de subvenția MI-F-2019-795 (JRB) a Institutului de descoperire a copiilor; Institutele Naționale de Sănătate acordă R37 AR046523 (SLT), R01 DK111389 (SLT), P30 AR057235 (SLT, CSC și MJS), R00 DE024176 (ELS), R01 AR047867 (MJS) și R01 DK106083 (CAH). Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Ultimele decenii au asistat la studii elegante despre relația dintre metabolismul energetic și os, concluzionând că acestea se reglează reciproc. Prin acest scenariu, adipokinele selectate influențează masa scheletică, vizând direct și indirect osteoblastele și osteoclastele [1-4]. Aceste studii, dintre care multe furnizează date contradictorii, implică de obicei modificarea farmacologică sau genetică a abundenței adipokinei. Realizarea faptului că diferite depozite de țesut adipos alb (WAT) au efecte fiziologice distincte au oferit o perspectivă asupra acestei enigme [5-7]. În timp ce grăsimea subcutanată, rezidând predominant în coapse și fese, se corelează cu creșterea masei osoase, grăsimea viscerală crescută, care caracterizează sindromul metabolic, este asociată cu osteoporoză [1-3, 6]. De ce apare această distincție este, totuși, complet necunoscut și nu există dovezi mecaniciste ale unei relații cauză/efect între grăsime și abundența oaselor.

Rezultate

Generarea șoarecilor FF

Așa cum s-a descris [9] generația de șoareci FF implică traversarea celor care poartă o transgenă de toxină difterică (DTA) în aval de un codon oprit floxat (DT-STOP fl/fl) la șoareci care exprimă adiponectină Cre (+/-). Colegii de serviciu servesc drept control. În conformitate cu expresia unică a adiponectinei Cre în adipocite și precursorii acestora, toate produsele Cre + ale împerecherii nu conțin niciun WAT discernabil confirmat de adiponectină sau leptină circulantă practic nedetectabilă, precum și de visfatină și, rezistină [10] (Fig 1). BAT este, de asemenea, absentă și, ca rezultat, șoarecii FF sunt intoleranți la frig, deoarece necesită adăpostire la 30 ° C pentru a supraviețui înainte de înțărcare. În mod neașteptat, abundența adipocitelor măduvei este nealterată la șoarecii FF. Greutatea corporală a șoarecilor FF scade progresiv odată cu vârsta, comparativ cu WT, dar diferența nu atinge semnificație statistică până la 20 de săptămâni. Nu există nicio modificare a creșterii, așa cum se dovedește a lungimii femurale, iar șoarecii FF au splenomegalie substanțială (Fig. S1).

Adipokine serice de control și șoareci FF. Datele sunt prezentate ca medie ± SD. *** p Fig 2. Absența congenitală a grăsimii favorizează osteoscleroza.

A) Radiografii ale femurilor la șoareci martori de 3 luni și FF. B) Imagini μCT dependente de vârstă ale femurelor FF și ale controlului colegilor. C) Analiza μCT cantitativă a B. D) Analiza histomorfometrică a volumului osos trabecular al FF în vârstă de 3 luni și tibia de control. E) imagini μCT ale vertebrelor (L3-5) ale martorului de 3 luni și ale colegilor de litere FF. F) Analiza μCT cantitativă a volumului osos trabecular și a densității minerale osoase a E. Datele sunt prezentate ca medie ± SD. * p Fig 3. Absența congenitală a grăsimii favorizează formarea oaselor.

A) Osteocalcina serică a șoarecilor FF și de control. B) Analiza qPCR a markerilor de diferențiere a osteoblastilor prezenți în ARN extras din femurele șoarecilor martor FF vechi de 6 săptămâni. C) Imagini microscopice cu fluorescență ale femurului distal de șoareci martor și FF cărora li s-a administrat calceină la distanță de timp. Bara de scalare: 400 μm. D) Analiza histomorfometrică a ratei de formare osoasă totală (BFR), rata de formare a oaselor pe mm suprafață trabeculară (BFR/BS) și rata de apoziție minerală (MAR) a osului trabecular. E) Control colorat TRAP (produs de reacție roșu) și femur FF. Suprafața endocorticală FF este căptușită de osteoblaste coloane (săgeți) caracteristice formării osoase robuste. Bara de scalare: 800 μm. F) Analiza histomorfometrică a MAR endocortical. D) Analiza histomorfometrică a MAR periostal. Datele sunt prezentate ca medie ± SD. * p Fig 4. Absența congenitală a grăsimii crește numărul osteoclastelor, dar nu funcționează.

A) TRAP5b seric al șoarecilor FF și de control. B) Analiza histomorfometrică a numărului de osteoclasti/mm suprafață osoasă. C) analiza qPCR a markerilor de diferențiere a osteoclastelor prezenți în ARN extras din femurele șoarecilor martor FF vechi de 6 săptămâni. D) TRAF colorat FF și oase de control. Scară Bară: 100 μm. E) Raportul CTx seric la TRAP5b al șoarecilor FF și martor. Datele sunt prezentate ca medie ± SD. * p Fig 5. Absența congenitală a grăsimii sporește rezistența osoasă.

Analiza testelor de îndoire a FF și controlul rigidității femurale (A) și (B) a forței finale (o măsură a rezistenței oaselor întregi). (C) analiza μCT a zonei osoase diafizare. (D) Moment polar de inerție. (E) Deplasare post-randament. (F) Lucrați pentru fracturi. Datele sunt prezentate ca medie ± SD. * p Fig 6. Osteoscleroza șoarecilor FF nu este cauzată de sindromul metabolic.

A) Stânga: Masă grasă (săgeată) la șoarece FF la 4 luni după transplantul MEF subcutanat. Dreapta: transplantul WT MEF normalizează dimensiunea ficatului ficatului FF (stea). B) Imaginea histologică a masei grase la șoarece FF la 4 luni după transplantul subcutanat de MEF; Bara de scalare: 1 mm. C) Imagini histologice ale ficatului FF care prezintă steatoză severă (panoul din stânga) la șoareci operați fals și eliminarea acestuia prin transplant MEF (panoul din dreapta). Bara de scalare: 400μm. D) imagini μCT și E) analiză cantitativă a volumului trabecular și a densității minerale osoase a femurului distal al șoarecilor FF la 4 luni după operația simulată sau transplantul MEF. F) Analiza histomorfometrică a volumului osos trabecular tibial și a numărului de osteoclaste la martorii WT și la șoarecii FF la 4 luni după intervenția chirurgicală simulată sau transplantul MEF. G) Radiografii ale femurilor șoarecilor FF la 3 luni după intervenția chirurgicală simulată sau transplantul diferitelor depozite de grăsime. H) Analiza μCT a volumului osos trabecular și a densității minerale osoase a femurului distal al șoarecilor FF la 3 luni după intervenția chirurgicală simulată sau transplantul diferitelor depozite de grăsime. Datele sunt prezentate ca medie ± SD. * p Fig 8. Absența leptinei și adiponectinei moderează osteoscleroza FF.

A) Depozite de grăsime transplantate la 3 luni după operație. B) Greutatea depozitului de grăsime la 3 luni după transplant. C) Leptina serică și adiponectina șoarecilor FF la 3 luni după transplantul de grăsimi. WT și șoarecii FF netransplantați servesc drept martor. D) Analiza μCT a volumului osos trabecular și a densității minerale osoase a femurului distal al șoarecilor FF la 3 luni după operația simulată sau transplantul de grăsime derivată de la șoareci WT sau cu deficit de adipokină. Datele sunt prezentate ca medie ± SD. ** p -, TER-119 -, CD41 -, CD11b -, celule LepR +.

GTT și ITT

Testele de toleranță la glucoză (GTT) au fost efectuate pe șoareci masculi de 2 luni în cuști curate supuse foametei cu acces gratuit la apă timp de 6 ore. Șoarecii au fost cântăriți și o cantitate mică de sânge a fost obținută din vena cozii pentru măsurarea inițială (timp 0) a glucozei. Șoarecii au fost apoi injectați intraperitoneal cu 50% dextroză sterilă (1 mg/g greutate corporală). Glicemia din coadă a fost determinată la 15, 30, 60, 90 și 120 de minute după provocare folosind un glucometru Bayer Contour. Pentru testul de toleranță la insulină (ITT), șoarecii masculi de 2 luni au fost plasați în cuști curate fără alimente și acces gratuit la apă. După un repaus de 6 ore, șoarecii au fost cântăriți și citirea inițială a glucozei a fost luată folosind un glucometru Bayer Contour. Șoarecii au fost injectați intraperitoneal cu insulină umană (Humulin, Eli-Lilly) la o doză de 0,7 U/Kg greutate corporală și glicemie măsurată la 15, 30, 45, 60, 90, 120 min după injectarea insulinei.

Histologie și histomorfometrie

Femurul și Tibia au fost fixate în 10% formalină tamponată neutră, urmată de decalcificare în 14% EDTA timp de 10 zile, încorporarea parafinei și colorarea TRAP. Parametrii histomorfometrici statici și dinamici au fost măsurați folosind BioQuant OsteoII (BioQuant Image Analysis Corporation, Nashville, TN) într-un mod orbit.

Etichetarea calceinei

FF masculin de 2 luni și colegii de control au fost injectați intraperitoneal cu calceină (Sigma) (7,5 mg/kg greutate corporală) în zilele 6 și 2 înainte de sacrificiu. Secțiunile histologice nedescalcificate ale femurului au fost analizate folosind BioQuant OsteoII (BioQuant Image Analysis Corporation, Nashville, TN).

Tomografie microcomputată (μCT)

Osul trabecular a fost scanat folosind un scaner μCT40 (Scanco Medical AG, Bassersdorf, Elveția; 55 kVp, 145 μA, 300 ms timp de integrare, 16 μm dimensiune voxel). Un prag mai mic de 250 a fost utilizat pentru evaluarea tuturor scanărilor. Regiunea osoasă trabeculară de interes a constat din 100 de felii care au fost trase începând cu prima felie în care condilii și spongioza primară nu mai erau vizibile, având o lungime de 1,6 mm. Regiunea de interes a analizelor corticale a constat din 50 de felii care acoperă o lungime de 0,8 mm la axul femural.

Transplantul de grăsime

Fibroblastele embrionare primare de șoarece (MEF) au fost preparate din embrioni WT C57/BL6 E14 așa cum este descris [9, 45]. MEF-urile au fost injectate subcutanat la sternul șoarecilor FF în vârstă de 2 luni, după cum sa raportat [9, 46]. Șoarecii au fost sacrificați la 4 luni după transplant.

Depozitele de grăsimi mature au fost transplantate conform descrierii [47] cu ușoară modificare. Șoarecii FF în vârstă de 2 luni au fost anesteziați cu izofluran. Plăcuțele de grăsime donatoare de la șoareci cu vârsta de 6-8 săptămâni WT sau șoareci cu deficit de adipokină au fost plasate în PBS sterile și tăiate în bucăți de 100-150 mg. Grefele au fost implantate subcutanat prin mici incizii în pielea rasă a spatelui, cu 1 bucată pe incizii. 6 bucăți de grefă de grăsime au fost implantate în fiecare șoarece FF. După operație șoarecii au fost adăpostiți individual timp de o săptămână și apoi 5 șoareci pe cușcă. Șoarecii au fost sacrificați la 3 luni după transplant.

Biomecanică

Femora (n = 5 per grup) a fost scanată prin microCT la arborele mediu (Scanco uCT40; 70 kVp, 114 mA, 300 ms timp de integrare, dimensiunea voxelului de 10 um, 100 felii) pentru a determina proprietățile geometrice ale secțiunii transversale. Au fost apoi testați mecanic până la eșec în trei puncte în așteptare (Instron 8841; interval de suport: 7 mm; rata de deplasare: 0,1 mm/sec). Eșecul a apărut direct sub punctul de încărcare, la lungimea de 50% a femurului. Datele despre deplasarea forței au fost colectate și analizate pentru a determina proprietățile mecanice osoase (structurale) (rigiditate, forță finală, deplasare post-randament, lucru până la fractură) [14].

Statistici