Abstract

Introducere

Folatul dietetic, metionina, vitamina B6, vitamina B12 și alcoolul au fost asociate cu cancerul de colon în unele studii epidemiologice, dar nu în toate (1, 2, 3, 4). Nu se cunosc mecanismele care stau la baza acestor factori dietetici asociați cu cancerul de colon. Un mecanism de unificare ipotezat este că acești factori acționează împreună prin implicarea lor în procesele de metilare a ADN-ului (1, 2). Metilarea ADN-ului joacă un rol important în reglarea genelor (5, 6). În neoplasmele colonice, hipometilarea generalizată împreună cu hipermetilarea unor zone bogate în citozină nemetilată pot fi întâlnite frecvent (7, 8, 9). Se consideră că acest dezechilibru în metilarea ADN-ului duce la expresia anormală a oncogenelor și a genelor supresoare tumorale (10). Procesul de metilare implică mai mulți pași și mai mulți factori dietetici, cum ar fi folatul, metionina, vitamina B12 și vitamina B6 sunt potențial implicați în aceste procese. Calea folatului este, de asemenea, importantă în determinarea disponibilității nucleotidelor pentru sinteza ADN-ului.

reductază

MTHFR3 catalizează reducerea 5,10-metilenetetrahidrolatului la 5-metiltetrahidrofolat, forma circulatorie majoră a folatului și a donatorului de carbon pentru remetilarea homocisteinei la metionină. Folatul, sub formă de metiltetrahidrofolat și vitamina B12 transmetilază, este implicat în aceste căi (11, 12), la fel ca și vitamina B6, cofactorul serinei-hidroximetiltransferazei, care ar putea avea un impact asupra disponibilității 5,10-metilenetetrahidrofolatului. Metionina este un precursor al S-adenosilmetioninei, donatorul de metil pentru majoritatea reacțiilor biologice de transmetilare din organism, inclusiv a ADN-ului (11, 12). Modificările în homocisteina plasmatică pot rezulta din tulburări genetice sau legate de nutrienți în căile de transsulfurare sau remetilare ale metabolismului homocisteinei (13). Astfel, MTHFR este implicat în reglarea concentrației plasmatice de homocisteină și menținerea unui fond adecvat de metionină.

O variantă a genei umane MTHFR care are ca rezultat o substituție alanină cu valină a fost descrisă la pb 677. Această mutație codifică o enzimă termolabilă cu activitate MTHFR redusă, rezultând niveluri crescute de homocisteină plasmatică. Persoanele care sunt homozigote pentru această variantă (TT) au fost raportate ca având 30% din activitatea enzimatică normală, iar heterozigoții (CT) au fost raportate ca având 65% din activitatea enzimatică normală (13). Modul în care factorii dietetici interacționează cu variațiile MTHFR în raport cu cancerul de colon este, în general, necunoscut. Folosind datele dintr-un amplu studiu caz-control al incidentului de cancer de colon, am explorat aceste asociații.

Materiale și metode

Populația de studiu.

Au fost raportate metode utilizate pentru a stabili controalele (14). Subiecții de control din KPMCP au fost selectați aleatoriu din listele de membri. În Utah, subiecții de control cu ​​vârsta sub 65 de ani au fost identificați prin apelare aleatorie cu cifre și liste de persoane cu un permis de conducere Utah actual sau o identificare de stat; subiecții de control cu ​​vârsta de 65 de ani și peste au fost identificați aleatoriu din listele Administrării finanțării asistenței medicale (securitate socială). În Minnesota, subiecții de control au fost identificați din listele de persoane cu permis de conducere din Minnesota sau identificare de stat. Controalele au fost corelate cu cazurile pe grupe de vârstă de 5 ani și sex. Dintre toate controalele solicitate să participe, 64% au cooperat. Motivele neparticipării au fost descrise (15). Motivul principal al neparticipării a fost că nu am reușit să localizăm subiecții (752 controale selectate). Dintre acestea, 663 au fost selectate din Minnesota, unde au fost adăugați în mod regulat noi titulari de permise de conducere, dar persoanele care au murit sau s-au mutat nu au fost eliminate. Acest lucru a dus la o diferență globală de 10% a ratei de răspuns, în funcție de faptul dacă aceste 663 de controale au fost păstrate în numitor sau lăsate în afara calculelor.

Colectare de date.

Datele au fost colectate de la participanții la studiu de către intervievatori instruiți și certificați care utilizează computere laptop. Perioada de referință pentru studiu a fost anul cu 2 ani înainte de data selecției (data diagnosticului pentru cazuri sau data selecției pentru controale). Interviul a durat aproximativ 2 ore. Au fost descrise metodele de control al calității studiului (16, 17) .

Aport alimentar.

Suplimentele de vitamine și minerale.

Participanții la studiu au fost întrebați dacă au luat multivitamine în mod regulat, definit de cel puțin trei ori pe săptămână timp de o lună în timpul anului de referință. S-a obținut frecvența administrării multivitaminelor, deși durata de utilizare pe termen lung nu a fost. Utilizarea multivitaminelor a fost raportată de 27,5% din cazurile masculine și 29,4% din martorii masculini și 36,5% din cazurile feminine și 37,5% din martorii feminini. Participanții au fost, de asemenea, întrebați dacă au luat alte suplimente de vitamine sau minerale. Mai puțin de 1% dintre participanți au raportat că au luat suplimente individuale de folat, vitamina B12 sau vitamina B6; ≈1% au raportat că au luat un supliment complex B. Pentru acest studiu, utilizarea multivitaminelor a fost clasificată după cum urmează: utilizarea suplimentelor, dacă au raportat administrarea unor suplimente multivitamine, folat, vitamina B12, vitamina B6 sau complex B; sau nu folosesc suplimente, dacă nu au raportat că au luat aceste suplimente în perioada de referință.

MTHFR.

Dintre cele 4403 de cazuri și controale cu date de studiu valide, 3680 (84%) au primit sânge recoltat. ADN-ul genomic pentru probele de la Universitatea din Minnesota și KPMCP a fost extras la Universitatea din Utah folosind un kit PureGene (Gentra Systems, Inc., Minneapolis, MN). Probele de la Universitatea din Utah au fost obținute din celule imortalizate. Aceste linii celulare au fost crescute, iar ADN-ul a fost extras folosind fenol cloroform. Dintre cei 3680 de indivizi cu ADN, 3283 aveau date de genotip MTHFR. Aceasta reprezintă aproximativ 75% dintre cei care au fost intervievați. Datele MTHFR nu au fost disponibile pentru 397 de indivizi deoarece fie ADN-ul insuficient a fost disponibil pentru efectuarea testului, fie calitatea ADN-ului a fost de așa natură încât a fost dificil să se determine în mod clar genotipul individual. Metodele de control al calității utilizate au inclus rularea a trei probe de control pe fiecare tavă cu 96 de godeuri.

ADN-ul genomic a fost amplificat folosind PCR. Varianta de alelă este creată de o modificare de la C la T bp la nucleotida 677 care creează un situs de restricție HinfI. Identificarea testului genotipului MTHFR a fost detectată prin PCR, urmată de un digest enzimatic HinfI. Această regiune a ADN-ului genomic a fost amplificată utilizând PCR, așa cum s-a descris anterior (13). Produsul PCR netăiat a cuprins 198 de baze. Digestia ADN-ului cu HinfI pentru polimorfismul alanină-valină a îndepărtat 23 de baze din acest produs, ducând la un produs de 175 bp. Prin urmare, ADN-ul de la indivizi homozigoti pentru acest polimorfism a arătat doar această bandă de 175 bp; heterozigoții au prezentat atât benzile de 175, cât și cele de 198 bp; iar indivizii homozigoti de tip sălbatic au prezentat doar banda de 198 bp. Cazurile și controalele au fost clasificate ca TT dacă erau homozigoți pentru alela C677T, TC dacă erau heterozigoți pentru alela C677T și CC dacă erau homozigoți pentru alela C677 (de tip sălbatic).

Metode statistice.

Analizele inițiale au fost făcute folosind modele de regresie spline. Acest lucru a fost făcut pentru a determina vizual dacă diferențele în asocierile cu factorii dietetici existau după genotip. Modelele de regresie logistică au fost rulate în două moduri de estimare a asocierilor. (a) Am evaluat interacțiunea utilizând ca punct de referință comun pe cei cu cel mai mare risc: genotipul CC și aportul scăzut de substanțe nutritive. Efectuarea analizelor în acest mod ne-a permis să stabilim dacă a existat o diferență în asociere între categoriile combinate de factor dietetic și genotip. (b) Am stratificat datele după genotip. În aceste analize, am abordat întrebarea, care este riscul de cancer de colon, având în vedere un anumit genotip, la niveluri specifice de aport nutritiv?

OR și 95% CI au fost calculate din aceste modele de regresie logistică necondiționată. La aceste modele, vârsta la selecție, IMC [greutate/(înălțime) 2 pentru bărbați; greutate/(înălțime) 1,5 pentru femei] raportate pentru perioada de referință, activitate fizică viguroasă pe termen lung, determinată utilizând o adaptare a istoricului activității fizice CARDIA (21, 22), aportul total de energie, fibrele dietetice și numărul obișnuit de țigări fumate pe zi (persoanele care nu au fumat niciodată au fost grupul referent) în mod regulat au fost incluse ca covariabile. Categoriile de expunere la nutrienți s-au bazat pe distribuția în populația martor separat pentru bărbați și femei. Deoarece s-au observat puține diferențe de risc pentru cele trei chintile medii și s-au obținut estimări mai stabile ale riscului, am făcut trei categorii de cvintila cea mai mică pentru bărbați și femei, cvintilele medii și aproximativ cvintila superioară a aportului. Nutrienții au fost exprimați la 1000 kcal.

Analizele au fost efectuate separat pentru bărbați și femei pentru a determina dacă diferențele existau în funcție de sex și pentru că majoritatea literaturii s-au concentrat fie pe bărbați, fie pe femei. Analizele specifice vârstei au fost efectuate folosind vârsta de 60 de ani ca punct de limitare. Acest lucru a fost făcut pentru a permite comparații cu studii axate pe adenoame. Site-ul tumorii din colon a fost definit ca proximal (cecum prin colon transvers) sau distal (flexura splenică, colon descendent și sigmoid), clasificat după registrele tumorale. S-au făcut analize specifice site-ului, deoarece o mare parte din literatură sugerează că se observă asocieri mai puternice între folat și alcool pentru tumorile de colon distal. Epidemiologia de supraveghere și rezultatele finale ale datelor de etapă rezumate (locale, regionale și la distanță) au fost utilizate pentru a evalua asociațiile în funcție de etapă la momentul diagnosticului.

Rezultate

Dintre toate cazurile, 45,9% au avut genotipul CC, 44,7% au avut genotipul CT și 9,5% au avut genotipul TT (Tabelul 1); distribuția între controale a fost de 45,4, 43,2 și, respectiv, 11,4%. Nu am observat diferențe în ceea ce privește riscul de cancer de colon asociat cu genotipul MTHFR în funcție de sex sau subsite. Rezultatele sunt raportate cu genotipul CC ca grup referent; totuși, dacă genotipurile CC și CT sunt combinate și utilizate ca grup referent, OR pentru genotipul TT este același, la 0,8, deși estimarea este mai precisă (IC 95% = 0,7-1,1 comparativ cu 0,5-1,3).

Asocieri între MTHFR și cancerul de colon

Aporturile ridicate de folat, vitamina B6 și vitamina B12 au fost asociate cu o reducere cu 30-40% a riscului de cancer de colon în rândul celor cu genotipul TT față de cei cu niveluri scăzute de aport care au fost genotip CC (Tabelul 2). Asociațiile pentru utilizatorii de suplimente de metionină, alcool și multivitamine nu au variat semnificativ în funcție de genotipul MTHFR. Diferențe semnificative statistic în asociere nu au fost observate în funcție de sex, deși puterea unor asociații a variat în funcție de sex (datele nu sunt prezentate).

Asocieri între nutrienți și statutul MTHFR la bărbați și femei

Asocierile combinate pentru genotipul MTHFR cu aportul alimentar de folat, vitamina B6 și vitamina B12 au fost cele mai marcate pentru cei cu tumori proximale (Tabelul 3). În acest subgrup al populației, aportul ridicat de substanțe nutritive a fost asociat cu o reducere la jumătate a riscului pentru cei cu genotipul TT față de genotipul CC și niveluri scăzute de aport. Această combinație nu părea să aibă aceeași forță de asociere cu tumorile distale, așa cum am observat pentru tumorile proximale. Nici alcoolul, nici metionina nu au prezentat aceste asociații specifice site-ului atunci când bărbații și femeile au fost evaluați împreună. Asocieri cu folat, vitamina B6 și vitamina B12 au fost observate atât pentru bărbați, cât și pentru femei, separat, deși asocierea inversă cu folat a fost mai puternică în rândul bărbaților (date neprezentate), iar nivelurile ridicate ale aportului de metionină au fost asociate cu o creștere de 2 ori a riscului printre femei (datele nu sunt prezentate).

Asocieri între nutrienți și starea MTHFR după locul tumorii

Asocierile inverse observate cu vitamina B6 și vitamina B12 ridicate și genotipul TT MTHFR au fost mai puternice în rândul celor care au fost diagnosticați la vârsta de peste 60 de ani (Tabelul 4). Deși aceste tendințe de asociere au fost diferite în funcție de vârstă la momentul diagnosticului, termenii de interacțiune incluzând vârsta, nutrienții și genotipul MTHFR nu au îmbunătățit semnificativ potrivirea modelelor de regresie la nivelul P = 0,05.

Asocieri între nutrienți și starea MTHFR după vârstă la momentul diagnosticului

Evaluarea riscului de cancer de colon prin examinarea nivelurilor de folat și metionină (Tabelul 5) coroborat cu genotipul MTHFR a arătat că cei cu cel mai scăzut risc de cancer de colon au fost participanții care au avut genotipul TT și aporturi mari atât de folat cât și de metionină. Deși estimările de risc au fost foarte imprecise, un efect protector pentru acești factori combinați părea să existe atât pentru consumatorii de alcool, cât și pentru cei care consumă alcool.

Efecte combinate ale folatului, metioninei și alcoolului asupra riscului de cancer de colon

Evaluarea efectului combinat al acestor variabile prin gruparea lor în categorii de risc scăzut, intermediar și ridicat (Tabelul 6) a indicat faptul că genotipul TT a fost invers asociat cu riscul în prezența unui model dietetic cu risc scăzut. În prezența unei diete cu risc ridicat, asocierea inversă cu genotipul TT a dispărut pentru populația totală și persoanele în vârstă și nu a fost semnificativă statistic, deși valorile au fost foarte imprecise în rândul persoanelor mai tinere.

Asocieri între MTHFR și dietele cu risc ridicat și scăzut, determinate de nivelurile combinate de folat, metionină și alcool

Evaluarea asocierilor în fiecare etapă a diagnosticului a fost efectuată pentru a permite o mai bună comparație cu datele din studiile adenoamelor. Nu am observat diferențe în asocieri pentru nutrienții examinați împreună cu starea MTHFR în funcție de etapă la momentul diagnosticului (datele nu sunt prezentate).

Discuţie

MTHFR transformă 5,10-metilenetetrahidrofolat în 5-metiltetrahidrofolat, forma circulatorie majoră a folatului din organism și principalul donator de metil pentru metilarea homocisteinei în metionină. Această cale este esențială în metilarea ADN-ului, iar anomaliile în acest proces pot duce la modificarea expresiei oncogenelor și a genelor supresoare tumorale (10). Deși s-a demonstrat că variantele genei MTHFR au ca rezultat diferite niveluri de activitate enzimatică, nu se știe în general modul în care dieta și alți factori de mediu influențează procesul carcinogen, având în vedere variația inerentă a nivelului enzimatic.

Descoperirile noastre privind asocierile cu factorii dietetici și genotipul MTHFR variază ușor față de cele prezentate de Chen și colab. (23); cu toate acestea, în aproape toate cazurile, estimarea noastră punctuală se încadrează în IC raportate de 95%. Rezultatele au fost similare pentru folat, deoarece aportul mare de folat a fost asociat cu un risc redus de cancer de colon pentru cei cu genotipul TT. Astfel, dacă asociațiile sunt considerate ca fiind cauzale, persoanele cu activitate enzimatică redusă obțin cea mai mare protecție împotriva nivelurilor ridicate de aport de folat, vitamina B6 și vitamina B12. Evaluarea suplimentelor de vitamine a arătat tendințe de asociere care au fost similare, dar mai slabe decât cele observate pentru alți nutrienți. Cu toate acestea, informațiile suplimentare au fost obținute pentru perioada de referință și alte studii au sugerat că suplimentele de folat sunt protectoare numai dacă sunt luate timp de peste 15 ani (26). Studiul nostru asupra adenoamelor arată că riscul în rândul indivizilor cu genotipul TT și al aportului adecvat sau ridicat de folat și așa mai departe diferă puțin de cel dintre cei cu genotipul TT singur; cu toate acestea, cei cu un aport scăzut și genotipul TT prezintă un risc crescut de adenom.4

Asociațiile nu au fost examinate anterior în funcție de vârstă la diagnosticul sau locul tumorii din colon. Cu toate acestea, majoritatea studiilor s-au concentrat asupra bărbaților mai tineri (2) sau asupra populațiilor mai tinere din studiile adenoamelor (24). Am observat asociații mai puternice cu un aport scăzut de substanțe nutritive, independent de genotip, pentru cei diagnosticați la o vârstă mai mică, în timp ce printre cei diagnosticați la vârste mai înaintate, nivelurile ridicate de folat, vitamina B6 și vitamina B12 au fost mai asociate cu un risc redus la persoanele cu TT genotip. Concentrațiile plasmatice ale homocisteinei s-au dovedit a crește odată cu înaintarea în vârstă, independent de starea de vitamina B (27). Se crede că acest lucru va rezulta dintr-o scădere legată de vârstă a cistationinei β-sintazei și posibil a altor enzime implicate în metabolismul homocisteinei (27). În studiul nostru, asociațiile par a fi cele mai puternice pentru cei cu tumori proximale. Motivul acestei asociații specifice site-ului nu este clar. Alte gene implicate în procesele de metilare, cum ar fi metionina sintază (28), pot fi implicate în procesele de metilare a ADN și pot fi influențate de factori dietetici. Incorporarea datelor privind alte variații genotipice poate modifica estimările asociațiilor cu risc de cancer de colon.

Nu toți indivizii incluși în studiul original au avut ADN disponibil pentru analize. Prin urmare, este posibil să existe diferențe în expunerile de interes dintre cei cu și fără ADN. Evaluarea diferențelor potențiale în aceste două grupuri a arătat că nu au existat diferențe în nivelurile de IMC, activitate fizică, sex, locul tumorii, aportul total de energie, folat, vitamina B6, vitamina B12 sau metionină. Cu toate acestea, cei cu date despre genotip au fost mai predispuși să raporteze consumul de alcool (14,6 g pe zi pentru băutori) decât cei fără date despre genotip (consum de alcool, 12,13 g pe zi; P = 1 Acest studiu a fost finanțat de NIH Grants CA48998 (către MLS) și CA59045 (către JDP). Identificarea și verificarea cazurilor au fost susținute de Utah Cancer Registry, Northern California Cancer Registry, Sacramento Tumor Registry și Minnesota Cancer Surveillance System. Investigația a fost susținută și de Grantul de cercetare pentru servicii de sănătate publică M01-. RR00064 de la Centrul Național pentru Resurse de Cercetare Conținutul acestui manuscris este exclusiv responsabilitatea autorilor și nu reprezintă neapărat punctul de vedere oficial al Institutului Național al Cancerului.

↵ 2 Cui îi trebuie adresate cererile de reeditare, la Universitatea din Utah Medical School, 546 Chipeta Way, Suite 1100, Salt Lake City, UT 84108.

↵ 3 Abrevierile utilizate sunt: ​​MTHFR, 5,10-metilenetetrahidrofolat reductază; KPMCP, Programul permanent de îngrijire medicală Kaiser; SAU, raportul de cote; CI, interval de încredere; IMC, indicele de masă corporală.

↵ 4 C. M. Ulrich, E. Kampman, J. Bigler, S. M. Schwartz, C. Chen, R. Bostick, L. Fosdick, S. A. Beresford, Y. Yasui și J. D. Potter. Adenoamele colorectale și polimorfismul C677T MTHFR: dovezi pentru interacțiunea genă-mediu?, Trimise spre publicare.

    • Acceptat la 5 aprilie 1999.
    • Primit la 3 noiembrie 1998.
    • Revizuirea a primit 29 martie 1999.