Caracterizarea interacțiunilor ARN metiltransferază Mettl3 cu 5'-ETS de 47S pre-ARNr. (A) Schema locațiilor primerului RT-qPCR pe ARNr pre-47S. (B) Cantități relative de fragmente de ARNr în imunoprecipitați obținute cu anticorpi anti-m6A din celule martor și Mettl3 KD, cuantificate prin analiza RT-qPCR (* ppp ® N6-Methyladenosine Enrichment Kit) A'-A0 (primeri pentru amplificarea A ' -A0 distanțier), 5'-ETS (primeri pentru amplificarea părții pre-rRNA 47S înainte de A '), nucleolină (mRNA m6A metilat pe baza datelor browserului MeT-DB2.0). (C) Îmbogățirea fragmentelor de ARNr în imunoprecipitați obținute cu anticorpi anti-Mettl3 din celule martor, cuantificate prin analiza RT-qPCR. (D) Schema 5'-ETS în ARNr cu adenozine desemnate în contextul secvențelor DRACH prezise. (E) Analiza PCR a testului ARN ligazei T4 pentru pre-ARNr din celulele martor și Mettl3 KD (vizualizarea fragmentelor separate folosind gel-electroforeză și cuantificarea lor relativă).

Modificări în procesarea pre-ARNr după 4 zile de Mettl3 KD. (A) Analiza RT-qPCR a ARNr 18S, 28S și 5.8S maturi în fracțiunea nucleară și citoplasmatică, ARN total și ARN naștent în celulele de control și celulele Mettl3 KD. ARNm Gapdh a fost utilizat ca control pentru fracția citoplasmatică și ARN total, u2 (pentru fracțiunea nucleară) (* pp B) Analiza eficacității clivajului pre-ARNr prin RT-qPCR la siturile de scindare A ', A0 (primerii au fost proiectați în jurul clivajului site) și cuantificarea distanțierului ARN A0-A1 în analiza FISH a ARN-ului total (* pp C) al 5'-ETS al pre-rARN 47S, distanțierului ARN A'-A0 în control și celulele Mettl3 KD. ADN-ul a fost colorat cu DAPI și rARN cu sonde marcate cu Cy3 (Tabelul S3). (D) Estimarea ratei de procesare pre-ARN la siturile de scindare A0 și A ’în celule martor și celule Mettl3 KD prin testul actinomicinei D.

Modificări ale mașinilor de prelucrare pre-ARN după 4 zile de Mettl3 KD. (A) Cuantificarea datelor RT-qPCR (* p p B) Analiza Western blot a factorilor de procesare a ARNr în celulele control și Mettl3 KD. (C) Alinierea secvenței multiple a părții 5'-ETS cu nucleotida m6A modificată (marcată cu galben) la diferite specii. Nucleotidele secvenței DRACH sunt marcate cu verde.

Structura secundară prezisă a primelor 415 pb de 5'-ETS în pre-rRNA 47S. Pătratul negru marchează helixul cu adenozină 196 (indicat de săgeata neagră).

Abstract

complet

Caracterizarea interacțiunilor ARN metiltransferază Mettl3 cu 5'-ETS de 47S pre-ARNr. (A) Schema locațiilor primerului RT-qPCR pe ARNr pre-47S. (B) Cantități relative de fragmente de ARNr în imunoprecipitați obținute cu anticorpi anti-m6A din celule martor și Mettl3 KD, cuantificate prin analiza RT-qPCR (* ppp ® N6-Methyladenosine Enrichment Kit) A'-A0 (primeri pentru amplificarea A ' -A0 distanțier), 5'-ETS (primeri pentru amplificarea părții pre-rRNA 47S înainte de A '), nucleolină (mRNA m6A metilat pe baza datelor browserului MeT-DB2.0). (C) Îmbogățirea fragmentelor de ARNr în imunoprecipitați obținute cu anticorpi anti-Mettl3 din celule martor, cuantificate prin analiza RT-qPCR. (D) Schema 5'-ETS în ARNr cu adenozine desemnate în contextul secvențelor DRACH prezise. (E) Analiza PCR a testului ARN ligazei T4 pentru pre-ARNr din celule martor și Mettl3 KD (vizualizarea fragmentelor separate folosind gel-electroforeză și cuantificarea lor relativă).

Modificări în procesarea pre-ARNr după 4 zile de Mettl3 KD. (A) Analiza RT-qPCR a ARNr 18S, 28S și 5.8S maturi în fracțiunea nucleară și citoplasmatică, ARN total și ARN naștent în celulele de control și celulele Mettl3 KD. ARNm Gapdh a fost utilizat ca martor pentru fracția citoplasmatică și ARN total, u2 (pentru fracția nucleară) (* pp B) Analiza eficacității clivajului pre-ARNr prin RT-qPCR la siturile de scindare A ', A0 (primerii au fost proiectați în jurul clivajului site) și cuantificarea distanțierului ARN A0-A1 în analiza FISH a ARN-ului total (* pp C) al 5'-ETS al pre-rARN 47S, distanțierului ARN A'-A0 în control și celulele Mettl3 KD. ADN-ul a fost colorat cu DAPI și rARN cu sonde marcate cu Cy3 (Tabelul S3). (D) Estimarea ratei de procesare pre-ARN la siturile de scindare A0 și A ’în celule martor și celule Mettl3 KD prin testul actinomicinei D.

Modificări ale mașinilor de prelucrare pre-ARN după 4 zile de Mettl3 KD. (A) Cuantificarea datelor RT-qPCR (* p p B) Analiza Western blot a factorilor de procesare a ARNr în celulele de control și Mettl3 KD. (C) Alinierea secvenței multiple a părții 5'-ETS cu nucleotida m6A modificată (marcată cu galben) la diferite specii. Nucleotidele secvenței DRACH sunt marcate cu verde.

Structura secundară prezisă a primelor 415 pb de 5'-ETS în pre-rRNA 47S. Pătratul negru marchează helixul cu adenozină 196 (indicat de săgeata neagră).