Departamentul de Medicină pentru Afiliere, Divizia de Endocrinologie, Diabet și Metabolism, Universitatea din Pennsylvania Școala de Medicină Perelman, Philadelphia, Pennsylvania, Statele Unite ale Americii

metabolismului

Departamentul de Medicină pentru Afiliere, Divizia de Endocrinologie, Diabet și Metabolism, Universitatea din Pennsylvania Școala de Medicină Perelman, Philadelphia, Pennsylvania, Statele Unite ale Americii

Departamentul de afiliere pentru biochimie și biofizică, Universitatea din Pennsylvania Școala de medicină Perelman, Philadelphia, Pennsylvania, Statele Unite ale Americii

Departamentul de afiliere pentru biochimie și biofizică, Universitatea din Pennsylvania Școala de medicină Perelman, Philadelphia, Pennsylvania, Statele Unite ale Americii

Affiliation Bioinformatics Group, Penn Molecular Profiling Facility, Universitatea din Pennsylvania Perelman School of Medicine, Philadelphia, Pennsylvania, Statele Unite ale Americii

Departamentul de afiliere pentru medicină internă, Strelitz Diabetes Center, Eastern Virginia Medical School, Norfolk, Virginia, Statele Unite ale Americii

Departamentul de Medicină pentru Afiliere, Divizia de Endocrinologie, Diabet și Metabolism, Universitatea din Pennsylvania Școala de Medicină Perelman, Philadelphia, Pennsylvania, Statele Unite ale Americii

Departamentul de Medicină al Afilierilor, Divizia de Endocrinologie, Diabet și Metabolism, Facultatea de Medicină Perelman din Universitatea Pennsylvania, Philadelphia, Pennsylvania, Statele Unite ale Americii, Departamentul de Medicină Internă, Centrul de Diabet Strelitz, Școala de Medicină din Virginia de Est, Norfolk, Virginia, Statele Unite Statele din America

  • Regan Roat,
  • Vandana Rao,
  • Nicolai M. Doliba,
  • Franz M. Matschinsky,
  • John W. Tobias,
  • Eden Garcia,
  • Rexford S. Ahima,
  • Yumi Imai

Cifre

Abstract

Citare: Roat R, Rao V, Doliba NM, Matschinsky FM, Tobias JW, Garcia E și colab. (2014) Modificări ale structurii insulelor pancreatice, metabolismului și expresiei genei la șoarecii obezi C57BL/6J induse de dietă. PLOS ONE 9 (2): e86815. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0086815

Editor: Kathrin Maedler, Universitatea din Bremen, Germania

Primit: 9 aprilie 2013; Admis: 19 decembrie 2013; Publicat: 5 februarie 2014

Finanțarea: Studiul a fost susținut parțial de subvenții de la Institutele Naționale de Sănătate (K08-DK071536 la YI), un Institut pentru Obezitate și Metabolism al Diabetului de la Universitatea din Pennsylvania și Grant de fezabilitate (la YI), P01-DK049210 (la RSA), Centrul de Cercetare a Diabetului, Fenotiparea Șoarecilor și Nucleele de Biologie a Insulelor (P30-DK19525), Institutul Penn Genomes Frontiers și o subvenție cu Departamentul de Sănătate din Pennsylvania (către JT). Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Rezistența la insulină observată frecvent la obezitate este considerată un factor de risc pentru dezvoltarea diabetului de tip 2 (T2D) [1]. Cu toate acestea, eșecul secreției de insulină a insulelor pancreatice pentru a compensa rezistența la insulină este patologia critică care duce în cele din urmă la T2D [2] - [4]. Rolul critic pe care îl joacă insulele în patogeneza T2D este evidențiat de studii de asociere la nivel de gene (GWAS) care au identificat loci de susceptibilitate pentru T2D mai frecvent asociate cu funcțiile insulelor decât sensibilitatea la insulină [5]. Mai mult, se consideră că înrăutățirea progresivă a T2D la om rezultă dintr-o pierdere treptată a masei funcționale a celulelor β [3]. Astfel, există un interes puternic în disecarea căilor moleculare care duc la scăderea masei și funcției celulelor β în T2D, mai ales că boala rămâne o provocare gravă pentru sănătatea publică, cu un număr limitat de terapii eficiente pentru a inversa patologia [6].

Materiale și metode

Studii pe animale

Experimentele au fost efectuate în conformitate cu liniile directoare ale Comitetului instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor, cu aprobările sale. Șoarecii masculi BL6J de 4 săptămâni (Laboratoarele Jackson) au fost găzduiți n = 5/cușcă în ciclu de lumină 12: întuneric, la temperatura ambiantă de 22 ° C și au permis accesul gratuit la alimente și apă. Grupuri de șoareci au fost hrăniți cu rozătoare normale (NC) (4 kcal% grăsime; 5001 din Lab Diet) sau cu o dietă bogată în grăsimi (HF) (45 kcal% grăsimi; D124551 de la Research Diets, Inc.,). Șoarecii au fost recoltați pentru studii histologice și pentru izolarea insulelor după 14 săptămâni pe dietă NC sau HF.

Homeostazia glucozei in vivo

Greutatea corporală a fost monitorizată săptămânal la șoareci conștienți la hrănirea ad libitum. Glicemia din coadă a fost măsurată cu un glucometru în timpul zilei în timpul hrănirii ad libitum (One Touch Ultra; Lifescan, Johnson & Johnson). Testele de toleranță la glucoză au fost efectuate după repaus peste noapte (16 ore). După măsurarea glicemiei din coadă, s-a injectat 1,5 g/kg soluție de glucoză IP, iar sângele din coadă a fost extras în diferite momente. Pentru a evalua secreția de insulină stimulată de glucoză in vivo, șoarecii au fost posti timp de 5 ore dimineața, li s-au administrat 3 gm/kg IP glucoză și s-au obținut 20 de sânge din coadă la momentele indicate pentru măsurarea insulinei de către ELISA (Crystal Chem Inc.) . Nivelurile serice de insulină au fost, de asemenea, măsurate în sângele cardiac obținut în momentul sacrificării.

Test de proliferare

Șoarecii au fost etichetați continuu cu bromodeoxiuridină (5-bromo-2-deoxiuridină, BrdU) prin furnizarea a 1 mg/ml de BrdU (Sigma-Aldrich) în apa potabilă timp de 2 săptămâni [11]. Incorporarea BrdU în celulele β a fost vizualizată prin analiza imunohistologică a pancreasului recoltat, așa cum este descris mai jos.

Histologie

Izolarea insulelor și testul de perifuzie ex vivo

Șoarecii au fost anesteziați cu pentobarbital de sodiu (50 mg/kg i.p.), iar insulele pancreatice au fost izolate folosind digestia colagenazei urmată de centrifugarea cu gradient de densitate Ficoll, așa cum s-a descris mai înainte [13]. Aproximativ 100 de insule proaspăt izolate au fost încărcate într-un aparat de perifuzie și perifuzate timp de 35 de minute cu tampon Krebs (pH 7,4) conținând 2,2 mM Ca 2+, 0,25% albumină serică bovină (BSA), 10 mM HEPES și 3 mM glucoză sub 5 % Atmosferă de CO2 la 37 ° C, urmată de tamponul Krebs cu 30 mM glucoză timp de 20 de minute. La sfârșitul fiecărui experiment, insulele au fost testate pentru secreția maximă de insulină prin adăugarea de 30 mM KCl la perifusat. Probele au fost colectate la 1 ml/min pentru măsurarea insulinei prin radioimunotest (Linco research, Inc.) [13].

Consumul de oxigen

Analiza extracției ARN și a expresiei genelor

ARN a fost extras din insulele proaspăt izolate folosind kitul RNeasy (Qiagen), iar ADNc a fost generat de SprintPowerScript pentru sinteza ADNc (Clontech) folosind 500 ng de ARN insulă ca șablon. Expresia genică a fost analizată cu sistemul de detectare a secvenței ABI Prism 7900HT (Applied Biosystems) cu grunduri comerciale pentru sistem. Rezultatele au fost exprimate folosind expresia genei 36B4 ca standard intern.

Analize microarray

Statistici

Datele sunt prezentate ca medie ± SEM. Diferențele dintre cele două grupuri au fost evaluate cu o măsură repetată ANOVA sau testul t al Studentului nepereche. p Figura 1. Homeostazia glucozei in vivo și secreția de insulină în BL6J pe dieta bogată în grăsimi.

(A - C) Șoarecii de sex masculin Bl6J au fost înțărcați la un rozător regulat (NC, 4,5% kcal diet de grăsimi) sau dieta bogată în grăsimi (HF, 45% kcal diet de grăsimi) și au permis accesul gratuit la alimente. Greutatea corporală (BW, A), glicemia din coadă (B) și nivelurile de insulină din sânge (C) au fost determinate la momentul indicat. (D - F) I.P. Testul de toleranță la glucoză a fost efectuat la șoareci Bl6J pe dietă NC sau HF timp de 3 luni. (D) Nivelurile de glucoză din sânge și (E) nivelurile de insulină în timpul testului. (F) Creșterea nivelurilor serice de insulină a fost exprimată luând valoarea la momentul 0 ca 100%. Datele sunt medii ± s.m., (A - B) atât n = 7, cât și măsurători repetate ANOVA p până în a 14-a săptămână pe dieta HF (Fig. 2F) și au analizat încorporarea BrdU în celulele β. Așa cum se arată în Fig. 2E - F, încorporarea totală a BrdU în celulele β la șoareci vechi de o lună a fost de 10 ori mai mare decât la șoareci vechi de 4 luni atât pe dietele HF, cât și pe cele NC, confirmând o proliferare activă a celulelor β la șoarecii mai tineri [17]. Incorporarea BrdU în celulele HF β a fost de 1,43 ori mai mare decât NC (p Figura 2. Analiza morfometrică a evaluat insulele din BL6J alimentate cu HF.

(A) Suprafața totală a celulelor β pe pancreas, (B) masa celulară β și (C) suprafața medie a unei insule individuale în secțiuni pancreatice de la șoareci pe dieta normală a rozătoarelor (NC) și dieta bogată în grăsimi (HF) au fost comparate Distribuția suprafeței unei insule individuale este prezentată în (D). Au fost analizate 6 secțiuni pentru NC și 5 secțiuni pentru șoareci alimentați cu HF (A - B). Au fost analizate 4 secțiuni pe grup de la șoareci hrăniți NC și HF cu un total de 448 insulițe pentru NC și 653 insule pentru HF (C - D). (E - H) Procentul de celule β pozitive pentru anticorpul anti BrdU a fost comparat între șoarecii hrăniți NC și HF etichetați cu BrdU la vârsta de 1 lună (E) și vârsta de 4 luni (F). 4 secțiuni pe grup au fost analizate pentru (E) și 5 secțiuni pe grup au fost analizate pentru (F). Sunt prezentate fotografii reprezentative dintr-o insulă etichetată la vârsta de 1 lună pe NC (G) și HF (H). Colorare verde: BrdU. Colorare roșie: insulină. Barele de scară indică 50 µm. Datele sunt medii ± s.m., n = 4-5 pentru (E) și (F). ** p Figura 3. Modificări ale funcțiilor secretoare și metabolice și ale expresiei genetice în insulele din BL6J alimentate cu HF.

(A) Secreția de insulină stimulată de glucoză (GSIS) a fost comparată ex vivo între insulele de la șoareci din dietele NC față de dietele HF. Sunt prezentate profilurile secreției de insulină, zona sub curba (ASC) a secreției de insulină și raportul dintre primul și al doilea vârf de secreție de insulină. (B) Consumul de oxigen a fost comparat între insulele din NC și HF incubate fără glucoză (0), urmat de tratament cu 25 mM glucoză (Glu) și apoi cu cianură de carbonil-4-trifluorometoxifenilhidrazonă (FCCP). (C) rtPCR a comparat proteina 1 (Hyou1) reglată în sus a hipoxiei, receptorul activat al proliferatorului peroxizomului gamma coactivator 1-alfa, (Ppargc1a), colagenul, tipul I, alfa 1, (Col1a1) și asporina (Aspn) între insulele din grupurile NC și HF. Rezultatele au fost exprimate folosind expresia genei 36B4 ca intern. Datele sunt medii ± s.m., n = 4-5. * p 2+ [23], [28]. Aceste anomalii pot afecta reacția la glucoză a celulelor β atunci când sunt expuse neîntrerupt la condiții hiperglicemice in vivo (Fig. 1E). Alternativ, factorii neurologici și paracrini pot juca un rol în tocirea secreției de insulină stimulată de glucoză in vivo.

Analiza noastră de microarray a identificat Pgc1α ca una dintre genele reglate în sus în insulele HF. S-a raportat, de asemenea, că expresia Pgc1α în insule a fost crescută la mai multe modele animale care au crescut cererea de secreție de insulină, cum ar fi șoareci ob/ob, șoareci după pancreatectomie parțială și șobolani Zucker Diabetic Fatty (ZDF). Cu toate acestea, reglementarea expresiei PGC1α și funcția acesteia în insule pare complexă. Același studiu a propus că PGC1α în insule reglează negativ secreția de insulină, deoarece expresia forțată a PgC1α în insule a redus secreția de insulină [20]. În același timp, s-a raportat că expresia PGC1α se corelează cu o secreție mai mare de insulină în insulele umane, șoareci tratați cu streptozotocină și șobolani Goto-Kakizaki (GK) [29]. Deoarece reducerea PGC1α de către ARNsi în insulele umane dispersate a redus secreția de insulină, menținerea nivelurilor bazale de PGC1α poate fi necesară pentru a susține secreția de insulină [29].

Hyou1 este o altă genă care este crescută în insulele HF în analiza noastră de microarrays. HYOU1 este o proteină ER chaperon a cărei expresie crește în diferite țesuturi sub hipoxie, dar este extrem de exprimată în ficat și celulele β pancreatice chiar și la normoxie [30], [31]. Expresia mai mare a Hyou1 este considerată a fi protectoare împotriva stresului ER și se dovedește a reduce rezistența la insulină atunci când este supraexprimată sistemic la șoareci [32], [33]. Interesant este că ameliorarea stresului ER indus de lipide în ficat prin activarea căii Sirt1/AMPK este asociată cu inducerea HYOU1 [34]. Există mai multe studii care demonstrează importanța potențială a HYOU1 în funcțiile insulelor. Un studiu proteomic a arătat anterior că HYOU1 este crescut în insulele T2D umane comparativ cu insulele non-diabetice [19]. În plus, reducerea Hyou1 a scăzut secreția de insulină stimulată de glucoză în celulele MIN6, susținând rolul său critic în secreția de insulină [35]. Astfel, expresia crescută a Hyou1 în insulele pancreatice poate servi ca mecanism de protecție în BL6J pe dieta HF.

În rezumat, am efectuat studii morfologice, secretorii, metabolice și de profilare a expresiei genelor pentru a caracteriza modificările insulelor BL6J cu mutație NNT pe dieta HF. Am observat caracteristici care demonstrează o combinație de compensare a insulelor și afectare funcțională în acest model utilizat pe scară largă de T2D. Informațiile obținute din studiul nostru vor ajuta la interpretarea studiilor care utilizează BL6J cu mutație NNT ca model al obezității induse de dietă și vor facilita traducerea acestor date în investigația T2D umană.

informatii justificative

Tabelul S1.

Lista de gene reglate în sus în insulele HF comparativ cu insulele NC în analiza microarray utilizând o limită de modificare a pliurilor de ≥1,5 și o rată de descoperire falsă de ≥0,13%.