Acest articol are o corecție. Te rog vezi:

Abstract

Introducere

Sistemul endocannabinoid (eCB) este un sistem de semnalizare fiziologică care cuprinde două tipuri de receptori de membrană, numiți receptori CB1 și CB2, liganzi endogeni (eCB) și mașinile pentru biosinteza și degradarea acestora (Pagotto și colab., 2006; Lutz, 2002 ).

modificări

Acest sistem neuromodulator este exprimat pe scară largă în SNC și modulează transmisia sinaptică și plasticitatea. Eliberate din situl postsinaptic, eCB-urile pot acționa retrograd asupra receptorilor presinaptici CB1 modulând eliberarea neurotransmițătorului atât cu mecanisme tonice (Neu și colab., 2007), cât și mecanisme fazice (Mackie, 2006). La intrările GABAergic ale regiunii hipocampice CA1, activarea receptorilor CB1 duce la diferite forme de plasticitate sinaptică, cum ar fi suprimarea indusă de depolarizare a inhibiției (DSI) sau depresia pe termen lung a sinapselor inhibitorii (I-LTD). 2008) . La sinapsele glutamatergice, s-a demonstrat că receptorii CB1 sunt prezenți și funcționali (Monory și colab., 2006), chiar dacă doar câteva studii (Ohno-Shosaku și colab., 2002; Straiker și Mackie, 2005; Hofmann și colab., 2008) a arătat o modulație a plasticității sinaptice în hipocamp, care ar putea fi cauzată de expresia foarte scăzută a receptorilor CB1 în această subpopulație neuronală și/sau dificultatea de a avea protocoale electrofiziologice de succes.

În timp ce regiunea hipocampală și rețelele neuronale conexe sunt cel mai frecvent asociate cu procesarea memoriei, mai multe studii au demonstrat un rol al hipocampului în controlul aportului alimentar. Afectarea hipocampală poate duce la hiperfagie (Forloni și colab., 1986), în timp ce rețeaua neuronală hipocampală contribuie la comportamentul alimentar prin procesarea semnalelor de sațietate, precum colecistochinina, grelina și motilina (Guan și colab., 2003; Davidson și Jarrard, 2004 Diano și colab., 2006). Mai mult, pacienții obezi care gustă o masă lichidă au prezentat o activitate scăzută în hipocampul posterior comparativ cu subiecții de control slab (DelParigi și colab., 2005), iar alte studii imagistice au demonstrat că dorința de hrană este legată de activarea hipocampului, reflectând un rol direct al acestei zone cerebrale cu amintiri asociate cu alimentele (Pelchat et al., 2004).

Agoniștii receptorilor CB1 stimulează hrănirea și îmbunătățesc în mod deosebit aspectele satisfăcătoare ale alimentației (Cota și colab., 2006), unde antagoniștii receptorilor CB1 s-au dovedit a reduce în mod constant greutatea corporală la pacienții obezi (Van Gaal și colab., 2005; Scheen, 2008) . Expresia neuronală a receptorilor CB1 este crucială atât în ​​aspectele motivaționale, cât și în cele metabolice ale acestor efecte (Bellocchio și colab., 2010; Quarta și colab., 2010). Sistemul eCB din hipocampus poate participa la stimularea apetitului și, astfel, la determinarea aportului total de energie și a severității obezității.

Aici, am testat ipoteza dacă sistemul eCB este sau nu modificat în hipocampul unui model animal bine stabilit de obezitate și condițiile asociate acestuia (cum ar fi rezistența la insulină, diabetul de tip 2, dislipidemia), obezitatea indusă de dietă (DIO) șoareci (Buettner și colab., 2007), la fel cum s-a constatat anterior că apar în organele periferice (în special în țesutul adipos și ficat) ale rozătoarelor obeze (Di Marzo, 2008). De asemenea, am întrebat dacă procesele sinaptice mediate prin eCB sunt sau nu modificate în hipocampul șoarecilor DIO comparativ cu șoarecii de control alimentați cu dietă standard.

Materiale și metode

Animale.
Măsurarea endocannabinoidelor.
Hibridizare in situ.

Experimentele de hibridizare radioactivă in situ (ISH) au fost efectuate așa cum s-a descris anterior (Marsicano și Lutz, 1999). Șoarecii din SD și HFD au fost anesteziați cu izofluran și decapitați. Creierele au fost izolate, înghețate imediat pe gheață uscată și depozitate la -80 ° C. Creierele au fost montate pe mediul de înghețare a țesuturilor (Jung) și secțiunile coronare cu grosimea de 18 μm au fost tăiate pe un criostat Microm HM560 (Microm). Secțiunile au fost montate pe lamele SuperFrost Plus înghețate (Menzel) și depozitate la -20 ° C până la utilizare. Riboprobele receptorului CB1 au fost preparate așa cum s-a descris anterior (Marsicano și Lutz, 1999). După liniarizare cu BamHI, riboproba antisens a fost sintetizată cu ARN polimerază T3 (Roche). Pentru generarea riboprobei de sens, XhoI a fost utilizat pentru liniarizare și ARN polimeraza T7 (Roche) pentru sinteza ARN. Incubația cu ribobuze senzoriale nu a arătat niciun semnal.

Legarea GTPyS [35 S] stimulată de agonist.
Analiza Western blot.

Hipocampii de la șoareci SD și HFD au fost izolați și omogenizați. Douăzeci de micrograme de proteină totală au fost rezolvate cu 15% SDS-PAGE și electroblotate pe membrane de nitroceluloză (HyBond-C Extra; GE Healthcare). Anticorpii principali utilizați au fost receptorul CB1 (1: 1000; Cayman), amida hidrolaza acidului gras (FAAH) [1: 500; greutate moleculară (MW), 70 kDa], monoacilglicerol lipază (MAGL) (1: 500; MW, 35/37 kDa) (Straiker și colab., 2009) și diaziglicerol lipază izoforme α și β (DAGL-α și DAGL- β) (MW, 100 și respectiv 70 kDa; 1: 500) (Berghuis și colab., 2007); Ca control al încărcării a fost utilizată a-tubulina (MW, 55 kDa) (Sigma-Aldrich; 1: 400.000). Anticorpii secundari au fost IgG anti-iepure conjugat cu peroxidază de hrean (Dianova). Analiza Western blot a fost efectuată utilizând un sistem de chemiluminescență (Luminol). Detectarea a fost făcută prin autoradiografie. Nivelurile relative de proteine ​​au fost calculate după normalizare până la controlul încărcării (α-tubulin).

Electrofiziologie.

A, Curba de creștere a șoarecilor de tip sălbatic (CB1 +/+) și CB1 knock-out (CB1 -/-) în timpul a 12 săptămâni de tratament SD și HFD. Datele sunt exprimate ca medie ± SEM. CB1 -/-; CB1 +/+, n = 10 șoareci per grup; GABA-CB1 -/-, n = 7 șoareci. * p +/+ SD vs CB1 +/+ HFD; # p +/+ SD vs CB1 -/- SD; + p +/+ SD vs CB1 -/- HFD; ¥ p +/+ HFD vs GABA-CB1 -/- HFD; analiza ANOVA bidirecțională, testul post-hoc al lui Bonferroni. B, Cantitatea totală de grăsime viscerală (în grame) la șoareci CB1 +/+, CB1 -/- și GABA-CB1 -/- sub SD și, respectiv, HFD, măsurată la sfârșitul tratamentului. *** p +/+ SD vs CB1 +/+ HFD; ** p +/+ HFD vs GABA-CB1 -/- HFD; analiza testului.

Efectele obezității induse de dietă asupra nivelurilor endocannabinoide din hipocampus

Nivelurile de 2-AG și anandamidă în diferite regiuni ale creierului. A, B, Creșterea 2-AG și a anandamidei în hipocampul șoarecilor hrăniți cu HFD comparativ cu șoarecii hrăniți cu SD (n = 4, grup SD; n = 8 șoareci, grup HFD; analiza testului t, * p -/- șoareci. În aceste țesuturi probe, nu a fost detectată imunoreactivitate a receptorului CB1 (datele nu sunt prezentate). Astfel, nivelurile crescute de proteine ​​ale receptorului CB1 au fost detectate în mod specific în regiunile hipocampice CA1 și CA3, dar nu și în gyrusul dentat al șoarecilor DIO, ceea ce prezice, împreună cu niveluri crescute de eCB-uri, o semnalizare îmbunătățită prin receptorii CB1.

A, Imunoreactivitatea receptorului CB1 la hipocampul animalelor hrănite SD și HFD (semnal verde: receptor CB1). B, Cuantificarea imunoreactivității receptorului CB1 în zona stratului radiat, așa cum este indicat în A. C, Cuantificarea receptorului CB1 în stratul de corpuri celulare piramidale așa cum este indicat în A. Semnalul a fost cuantificat în CA1, CA3 și girus dentat (DG). Bara de scalare, 250 μm. Datele sunt exprimate în densitate integrată ± SEM. n = 3 șoareci per grup. Analiza ANOVA bidirecțională, testul post hoc al lui Bonferroni: ** p 35 S] GTPγS legare prin HU-210

Deși nivelurile crescute de proteine ​​ale receptorilor eCB și CB1 pot sugera o capacitate sporită de semnalizare eCB, mecanismele de cuplare intracelulară vor determina, de asemenea, eficiența semnalării CB1. Prin urmare, am investigat dacă agonistul receptorului CB1 a stimulat activarea proteinei G a fost modificat în DIO. Am efectuat legarea [35 S] -GTPγS stimulată de HU-210 în omogenate întregi ale hipocampului la șoareci hrăniți cu SD și HFD (Fig. 4). Cu toate acestea, activarea proteinei G prin intermediul receptorilor CB1 la omogenatele hipocampice ale șoarecilor hrăniți cu HFD nu au prezentat diferențe semnificative în comparație cu șoarecii hrăniți cu SD.

Stimularea legării [35 S] GTPγS în omogenizații hipocampici ai șoarecilor alimentați cu HFD (cercuri umplute) și șoareci alimentați cu SD (cercuri deschise) prin diferite concentrații ale agonistului receptorului canabinoid HU-210. Testele au fost efectuate în prezența PIB (30 μm) și [35 S] GTPγS (0,05 n m) și au fost incubate timp de 60 min la 30 ° C așa cum este descris în Materiale și metode. Legarea nespecifică a fost determinată în prezența GTPγS neetichetat (30 μm). Legarea bazală a fost măsurată în absența receptorului agonist și definită ca 0% în fiecare experiment. Datele sunt exprimate ca stimulare procentuală peste legarea bazală [35 S] GTPγS și reprezintă media ± SEM, n = 2, toate efectuate în cvadruplicat. EC50 = 2,29 ± 0,04 n m (SD), 2,45 ± 0,06 n m (HFD); Emax = 68,83 ± 0,90 (SD), 68,74 ± 1,40 (HFD). Analiză de testare t pereche, cu două cozi: p = 0,9802.

Obezitatea indusă de dietă induce o cale crescută de biosinteză endocannabinoidă în hipocamp

Analiza Western blot a omogenatului de hipocampus al șoarecilor hrăniți cu SD și HFD. A, Nivelurile de proteină DAGL-a au fost semnificativ crescute la șoarecii hrăniți cu HFD. B, Nivelurile de proteine ​​DAGL-β au fost neschimbate. C, D, Nivelurile de proteine ​​ale MAGL și FAAH, două enzime majore de degradare a eCB, au fost neschimbate. N = 3; datele sunt normalizate pentru α-tubulină. * șoareci p -/- hrăniți cu SD (Marsicano și colab., 2002). Așa cum s-a descris anterior în literatură (Wilson și colab., 2001), o depolarizare de 3 s nu a evocat niciun DSI (p> 0,05; n = 4) (Fig. 6B). Întrucât 2-AG, mai degrabă decât AEA, este considerat a fi eCB responsabil pentru DSI (Pan și colab., 2009; Straiker și colab., 2009; Gao și colab., 2010; Tanimura și colab., 2010), vom urma a evaluat efectul blocadei degradării 2-AG asupra DSI utilizând inhibitorul MAGL, JZL184. Așa cum era de așteptat, JZL184 la 100 nm a crescut puternic magnitudinea DSI la șoarecii hrăniți cu SD (Fig. 6C) (SD, n = 16, vs SD plus JZL184, n = 10; p 0,05), sugerând o saturație a semnalizării endogene a receptorului CB1 în Șoareci HFD.

A, DSI în neuronii piramidali hipocampici CA1 ai șoarecilor HFD și cu vârsta potrivită SD-hrăniți. Panou inferior, amplitudine normalizată a eIPSC-urilor cu trepte de despolarizare de 3 s (șoareci alimentați cu HFD: n = 12, cercuri umplute; șoareci alimentați cu SD: n = 11, cercuri deschise). Panoul superior, urme reprezentative ale eIPSC-urilor înainte de (1) și după (2) inducerea DSI. B, Rezumatul mărimii DSI a șoarecilor de tip sălbatic hrăniți cu SD și HFD și a șoarecilor hrăniți cu CB1 -/- SD. Datele sunt medii ± SEM. ** p m pe DSI. Panou inferior, Rezumatul mărimii DSI la șoareci hrăniți cu SD și HFD înainte și după aplicarea JZL184. Datele sunt medii ± SEM. * p m) curenții GABAergici puternic reduși, fără nicio diferență semnificativă între două grupuri de diete.

HFS induce un I-LTD mai puternic la celulele piramidale CA1 ale șoarecilor hrăniți cu HFD comparativ cu șoarecii hrăniți cu SD. A, Rezumatul I-LTD indus la șoareci alimentați cu HFD (n = 12; cercuri umplute) comparativ cu șoareci alimentați cu SD (n = 5; cercuri deschise). B, Panoul superior, urme reprezentative ale eIPSC-urilor înainte (1) și după (2) I-LTD de inducție. Panoul de jos, Rezumatul amplitudinilor I-LTD obținut prin calcularea răspunsurilor medii 25-30 min după HFS cu ultimele 5 min de răspunsuri medii de bază și normalizate (șoarecii ** p -/- au arătat o rezistență la dezvoltarea DIO. Aici, raportăm pentru prima dată implicarea expresiei receptorului CB1 în neuronii GABAergici în controlul homeostaziei corpului. În perioada târzie a tratamentului cu HFD, în ciuda aportului caloric similar, șoarecii GABA-CB1 -/- au menținut o greutate corporală semnificativ mai mică decât în ​​HFD- șoareci CB1 +/+ hrăniți, deși greutatea lor era încă mai mare decât la șoarecii CB1 -/- hrăniți cu HFD. Astfel, șoarecii GABA-CB1 -/- sunt parțial rezistenți la DIO, evidențiat de adipozitatea lor redusă. În concluzie, în DIO, am găsit o corelație între modificările transmiterii GABAergic (adică DSI îmbunătățit, I-LTD) și importanța funcțională a receptorilor CB1 exprimate pe neuronii GABAergic în ceea ce privește rezistența la DIO.

O întrebare pertinentă pentru rolul sistemului eCB în dezvoltarea obezității este dacă activitatea crescută a sistemului eCB este sau nu cauza sau consecința obezității. Descoperirea că șoarecii GABA-CB1 -/- sub HFD sunt parțial rezistenți doar în faza ulterioară a apariției obezității ar putea argumenta pentru un scenariu în care receptorii CB1 pe neuronii GABAergici sunt necesari pentru o a doua fază a dezvoltării stării obeze (de ex., întreținere, „consolidare metabolică”), dar nu pentru inițierea unei stări obeze. Cu toate acestea, au fost necesare investigații suplimentare pentru a obține informații suplimentare despre acest proces. GABA-CB1 -/- șoarecii hrăniți cu HFD ar putea fi un sistem model interesant pentru investigarea acestei întrebări interesante.

Studiile anterioare au descris modificări hipotalamice ale nivelurilor eCB cauzate de obezitate (Di Marzo și colab., 2001). Cu toate acestea, posibilitatea ca DIO să afecteze zonele extrahipotalamice nu a fost încă investigată în detaliu. În mod remarcabil, am constatat că nivelurile hipocampice ale ambilor endocanabinoizi majori (2-AG și anandamidă) au fost semnificativ crescute la șoarecii DIO comparativ cu șoarecii slabi de control. Pentru a vedea dacă creșterea nivelurilor de eCB este un fenomen generalizat, au fost măsurate nivelurile de eCB în BLA, cerebel și cortexul prefrontal. Dintre aceste regiuni, modificări semnificative au fost observate numai în PFC, unde anandamida a scăzut. Astfel, hipocampul pare a fi deosebit de predispus la disregularea eCB.

O posibilă explicație pentru îmbunătățirea nivelurilor de eCB hipocampic ar putea fi un raport dezechilibrat între sinteza eCB și degradare. Nu s-au găsit diferențe în nivelurile de expresie ale FAAH și MAGL, două enzime degradante pentru anandamidă și respectiv 2-AG, unde a fost detectată o creștere semnificativă a DAGL-α, sugerând că DIO duce la creșterea producției de 2-AG, care este nu este contrabalansat de mașinile care degradează eCB. Descoperirile noastre pot reprezenta un pas important în înțelegerea rolului sau a sistemului eCB în dezvoltarea obezității și a patologiilor conexe.

De asemenea, am examinat o formă pe termen lung de plasticitate sinaptică mediată de receptorii CB1 la sinapsele GABAergic. Șoarecii DIO au prezentat un I-LTD mai puternic în comparație cu șoarecii hrăniți cu SD, confirmând ipoteza noastră inițială conform căreia sistemul eCB este hiperactiv la șoarecii DIO. Interesant este că 60% dintre șoarecii hrăniți cu SD nu au reușit să dezvolte I-LTD cu protocolul nostru de inducție. O posibilă explicație pentru o rată atât de mare de eșecuri ar putea fi faptul că șoarecii în vârstă de 6 până la 7 luni au fost folosiți pentru experimente din cauza celor 12 săptămâni de tratament dietetic. Astfel de șoareci bătrâni au prezentat o plasticitate sinaptică redusă, cu o reducere cu 40% a magnitudinii I-LTD (F. Massa, date nepublicate) și o rată crescută de eșec în comparație cu animalele mai tinere care sunt de obicei utilizate în experimente electrofiziologice in vitro. În schimb, la șoarecii DIO, am găsit o elicitare normală și magnitudinea I-LTD, comparabile cu șoarecii mai tineri. Un motiv plauzibil pentru acest rezultat neașteptat ar putea fi găsit în supraactivarea sistemului eCB la șoareci obezi, ceea ce duce la un tonus eCB crescut, fiind capabil să contrabalanseze procesele de îmbătrânire la sinapsele GABAergic. Observațiile noastre au arătat că dezvoltarea/menținerea stării obezității este strict legată de o neregulare a sistemului eCB în principalele sale componente.

În general, constatările noastre se adaugă rapoartelor anterioare și evidențiază un rol direct și proeminent al sistemului eCB în fiziopatologia legată de obezitate a circuitelor neuronale extrahipotalamice. Studiile viitoare vor trebui să identifice tipurile de celule specifice producătoare de eCB la șoareci DIO și dacă este vorba despre un mecanism neuronal restricționat sau dacă implică glia și celule imune. Mai mult decât atât, va fi interesant să abordăm modul în care aceste modificări în DSI și I-LTD pot fi legate de schimbări de comportament la șoareci DIO. Până în prezent, un DSI hipocampic îmbunătățit într-un context fiziopatologic a fost raportat într-un model de șobolan pentru convulsii febrile, în care creșteri ale expresiei receptorului CB1 în interneuronii GABAergici au avut loc concomitent cu un DSI îmbunătățit și prag de convulsii redus (Chen și colab., 2003, 2007 ). Rolul DSI și I-LTD în ceea ce privește controlul și modularea procesării memoriei și a comportamentelor emoționale este totuși neclar și necesită investigații suplimentare (Lutz, 2009).

Note de subsol

Această lucrare a fost susținută parțial de subvențiile Deutsche Forschungsgemeinschaft LU 775/3-1 și LU 775/4-1 (în contextul FOR926) (BL) și GE 695/3-1 (GG), grantul Uniunii Europene REPROBESITY FPVII- 223713 (BL), LOEWE Lipid Signaling Forschungszentrum Frankfurt (GG, HS), National Institutes of Health Grants DA11322 și DA21696 (KM) și un grant de la Fundația Europeană pentru Studiile Diabetului (GM). Îi mulțumim Andrea Conrad și Martin Purrio pentru ajutorul oferit în instalația pentru animale, Claudia Schwitter și Anne Rohrbacher pentru prepararea țesuturilor, Ruth Jelinek pentru experimentele Western blot, Dr. Krisztina Monory pentru citirea critică a acestui manuscris, Dr. Sodikdjon Kodirov pentru ajutorul experimental la instalarea de electrofiziologie și Dr. Giovanni Marsicano pentru furnizarea de șoareci CB1 -/-.

Autorii declară că nu există interese financiare concurente.