• Găsiți acest autor pe Google Scholar
  • Găsiți acest autor pe PubMed
  • Căutați acest autor pe acest site
  • Record ORCID pentru Stefano Luin
  • Pentru corespondență: laura.marchetti @ unipi.its.luin @ sns.itantonino.cattaneo @ sns.it

Editat de K. Christopher Garcia, Universitatea Stanford, Stanford, CA și aprobat pe 14 august 2019 (primit pentru examinare 17 februarie 2019)

difuzie

Vedeți conținut similar:

Semnificaţie

Neurotrofinele (NT) sunt factori de creștere homodimerici care prezintă roluri fundamentale în sistemul nervos. Activitatea lor provine din legarea și activarea a 3 tipuri diferite de receptori din membranele celulelor nervoase. Receptorul p75 NT (p75 NTR) a fost primul descoperit în 1986; cu toate acestea, pentru numeroasele fațete structurale și funcționale raportate până acum, mecanismele sale de activare au rămas evazive. Aici, demonstrăm că funcțiile sale pleiotropice sunt reglementate de diferite redistribuții ale receptorilor, care depind în mod crucial de NT disponibil și de compartimentul subcelular implicat, dar nu au legătură cu starea sa de oligomerizare. Studiile cu particule simple au dovedit că receptorii sunt monomeri cu un comportament de difuzie rapidă în membrană cu, cel mult, auto-interacțiuni tranzitorii pe scara de timp a milisecundelor.

Abstract

Receptorul neurotrofinei p75 (NT) (p75 NTR) joacă un rol crucial în echilibrarea deciziilor de supraviețuire versus deces în sistemul nervos. Cu toate acestea, în ciuda celor două decenii de studii structurale și biochimice, lipsește încă un model cuprinzător, acceptat pentru activarea p75 NTR de către liganzi NT. Aici, prezentăm un studiu cu o singură moleculă a membranei p75 NTR în celulele vii, demonstrând că marea majoritate a receptorilor sunt monomeri înainte și după activarea NT. Interesant este că stoichiometria și proprietățile de difuzie ale tipului NTR de tip sălbatic (wt) p75 sunt aproape identice cu cele ale unui mutant receptor lipsit de reziduuri care anterior se credea că induc oligomerizare. WT p75 NTR și mutat (mut) p75 NTR diferă prin partiționarea lor în regiunile cu membrană bogate în colesterol după stimularea factorului de creștere nervoasă (NGF): susținem că aceasta este originea capacității wt p75 NTR, dar nu a mut p75 NTR, pentru a media apoptoza indusă de NT (proNT) imatură. Ambele forme NTR p75 susțin retracția conului de creștere indusă de proNT: Arătăm că acumularea suprafeței receptorului este forța motrice pentru colapsul conului. În ansamblu, datele noastre dezvăluie activitatea multifacetică a monomerului N75 p75 și ne permit să oferim un cadru interpretativ coerent al datelor conflictuale existente în literatura de specialitate.

Aici, evaluăm direct și cantitativ starea oligomerizării p75 NTR în membrana plasmatică a celulelor vii prin intermediul microscopiei cu fluorescență cu o singură moleculă, cu o strategie minim invazivă (21, 22); aceasta se bazează pe inserarea unei etichete peptidice scurte în proteina N75 p75 și marcarea acesteia cu stoichiometrie 1: 1 (23, 24). Această metodă permite, de asemenea, imagistica receptorului cu coloranți organici mici, care, spre deosebire de punctele cuantice mai greoaie (Qdot), permite recuperarea stării oligomerice a receptorului de la intensitatea lor fluorescentă (21). Arătăm că membrana p75 NTR este în mare parte un monomer cu difuzie rapidă, indiferent de stimularea NT. Auto-interacțiunile sale sunt mult prea tranzitorii pentru a duce la di-trimerizare substanțială a receptorilor; important, ele nu depind de Cys256 sau de alte reziduuri sugerate anterior să joace un rol în oligomerizarea receptorilor. De asemenea, colectăm dovezi cu privire la motivul pentru care mutantul p75 NTR C256A nu provoacă apoptoză dependentă de NT (18), dar este funcțională pentru semnalizarea colapsului conului de creștere (20). Rezolvând această contradicție aparentă, revizuim aici funcția p75 NTR, în cadrul conceptual al unui receptor monomeric versatil.

Rezultate

Expresie, validare și fluoromarcare pe membrană a constructelor umane p75 NTR.

p75 NTR molecule unice difuzate ca monomeri în membrana celulară.

Dinamica membranei moleculelor p75 NTR din membrana celulară. (A) Expresia S6-p75 NTR reglementată de doxiciclină (doxy). Imaginile TIRF ale receptorilor p75 NTR marcați Abberior635P din celulele SK-N-BE (2) arată dependența numărului de receptori pe zonă (scară albastră) de concentrația de doxiciclină în mediu (valorile negre de mai jos). (Bara de scală, 5 μm.) (B) Imagine TIRF a S6-p75 NTR marcată cu Abberior635P; traiectoriile suprapuse sunt prezentate în albastru. (Bara de scală, 5 μm.) (C) Construcții etichetate S6. Greutatea p75 NTR este ca în Fig. 1A; mut p75 NTR poartă mutații C256A și G256I și lipsește reziduurile 221 până la 246 care cuprind domeniul O-tulpină în regiunea JM; și dim p75 NTR are resturile 213 până la 251 din porțiunea JM înlocuită cu domeniul fermoarului leucinei (LeuZIP) de la c-jun. CD, tocator; DD, domeniul morții; SP, peptidă semnal. (D) Distribuția D pentru greutatea p75 NTR (gri), mut p75 NTR (negru) și dim p75 NTR (albastru). (E) Numărul de evenimente M&S din filmele cu 500 de cadre, normalizate pe zonă de membrană, pentru greutatea p75 NTR (gri), mut p75 NTR (negru) și dim p75 NTR (albastru). Cutiile reprezintă SE, liniile reprezintă mediana, iar mustățile reprezintă SD. *** Construcțiile P NTR (gri), mut p75 NTR (negru) și p75 NTR (albastru) slab. Pentru aceste analize au fost luate în considerare celule cu receptor de 0,18 până la 0,36 pe interval de micrometri pătrați.

Datorită naturii tranzitorii a dimerilor p75 NTR, precum și a fotoblanșării în timpul urmăririi, analiza intensității medii a traiectoriilor în celulele vii nu a putut oferi un răspuns neechivoc cu privire la stoichiometrie (SI Anexa, Fig. S5). Prin urmare, am analizat profilul de fotoblanșare a intensității etapelor păturilor izolate p75 NTR/Abberior635P în celulele fixe (casete galbene în Fig. 3A). Pentru fiecare punct, am cuantificat 1) numărul de pași de albire foto (săgeți roșii în Fig. 3B) și 2) intensitatea medie înainte de albire (IPRE; linii verzi în Fig. 3B). Ambele constituie o măsură directă a numărului de molecule dintr-un punct pentru oligomerizarea membranei receptorului (37). Marea majoritate a petelor analizate cu p75 NTR și mut p75 NTR sunt monomeri; adică afișează o etapă de albire fotovoltaică (aproximativ 77% pentru ambele specii; Fig. 3C). În schimb, constructul S6-TrkA stimulat de NGF a prezentat o proporție semnificativ mai mare de dimeri și oligomeri (26) (SI Anexa, Fig. S6A). Foarte important, majoritatea petelor NTR p75 slabe au prezentat un profil de albire în 2 pași (55%; Fig. 3C), iar monomerii au fost reduși la 35%. Numai dim p75 NTR a afișat o cantitate considerabilă de pete cu 3 și 4 pași de albire foto. Distribuțiile IPRE obținute pentru variantele NTR de 3 p75 au confirmat analiza etapei de albire (Anexa SI, Fig. S6B).

p75 NTR este predominant un monomer în membrana celulară. (A) Imagine TIRF care prezintă pete de receptori pe suprafața celulelor fixe (pătratele galbene reprezintă pete analizate; celulele analizate au avut 0,2 până la 0,5 pete pe micrometru pătrat). (Bara de scară, 1 μm.) (B) Urmele tipice ale profilului de intensitate ale unui monomer (sus), dimer (mijloc) și trimer (jos) care arată parametrii luați în calcul. IPRE (linia verde) este intensitatea medie a particulelor înainte de prima etapă de înălbire, săgețile roșii indică pași individuali de albire, iar linia gri reprezintă intensitatea fundalului. a.u., unități arbitrare. (C) Etape de albire fotolitică pe urmă pentru wt p75 NTR, mut p75 NTR și dim p75 NTR .

Subliniem că s-au detectat niște dimeri aparenți ai mut p75 NTR (aproximativ 20% din petele analizate) similar cu pt N75 NTR: Acest lucru dovedește lipsa unei relații cu reziduurile TM indicate anterior ca conducere la dimerizarea receptorilor (17). În general, experimentele noastre fac distincție între difuzivitatea monomerilor și dimerilor și contestă existența dimerilor p75 NTR stabili în membrana celulelor vii.

wt p75 NTR și mut p75 NTR Afișează diferite partiționări de membrană ca răspuns la stimularea NGF.

Apoi am comparat difuzivitatea membranei wt p75 NTR și mut p75 NTR după stimularea NT, pentru a vedea dacă acest lucru ar putea afecta starea oligomerică a receptorului. De asemenea, ne-am propus să identificăm o posibilă bază moleculară, o alternativă la lipsa oligomerizării, ca sursă a semnalizării apoptotice afectate a mut p75 NTR după stimularea NT (17, 18).

Concluzionăm că p75 NTR se translocează în plute lipidice la legarea NGF, iar mut p75 NTR are o rezidență redusă în microdomeniile membranei bogate în colesterol la legarea NGF comparativ cu omologul în greutate. În special, în absența receptorilor Trk concurenți, atât NT cât și proNT induc efecte coerente asupra p75 NTR atât din punct de vedere al difuzivității membranei (Fig. 4A și SI Anexa, Fig. S7), cât și al activității biologice; de exemplu, proBDNF induce apoptoza prin p75 NTR (18), dar p75 NTR mediază și apoptoza în neuronii retinieni prin NGF (48) și în neuronii simpatici prin BDNF (49).

Colesterolul cu membrană reglează semnalizarea apoptotică p75 NTR.

Colesterolul din membrană reglează semnalizarea apoptotică proBDNF prin p75 NTR. Cronologie experimentală (A) și cuantificarea colesterolului (intensitatea colorării filipinei III) în neuroni corticali tratați cu mevastatină/MβCD (mea.) Sau colesterol solubil (col.), Relativ la neuronii netratați (B). *** P NTR KO neuroni corticali (untr [netransdus], coloane albe) sau în aceleași neuroni transduse cu wt p75 NTR (coloane gri) sau mut p75 NTR (coloane negre) și induse cu 0,05 μg/mL doxiciclină, cu sau fără proBDNF. Coloanele albe și gri sunt raportate din Fig. 1F. Același lucru este prezentat în condițiile de epuizare a colesterolului (E, mevastatină) și a încărcării colesterolului (F, colesterol) a neuronilor. Pentru C - F, ** P NTR sau mut p75 NTR, netratate sau tratate cu proBDNF. Neuronii naivi (sus), neuronii îmbolnăviți de colesterol (colesterol) (mijlocii) și neuronii săraci cu colesterol (mevastatină) (jos) sunt afișați. Sunt indicate MAP2 (verde) și caspaza-3 clivată (roșu). (Bare de scară, 20 μm.)

Din aceste rezultate, concluzionăm că incapacitatea mut p75 NTR de a induce apoptoza (18) (Fig. 5D) se datorează ocupării mai slabe a regiunilor membranare bogate în colesterol, în comparație cu greutatea p75 NTR, mai degrabă decât semnalării afectate proteine ​​în sine. În consecință, în condiții de saturare a membranei obținute inducând expresia p75 NTR cu 1 μg/mL doxiciclină (Fig. 2A), atât mut p75 NTR, cât și wt p75 NTR au fost capabili să inducă apoptoza (Anexa SI, Fig. S9). Aceste descoperiri, împreună cu cele obținute în celulele SK-N-BE (2) (Fig. 4), arată că legarea NT reglează partiționarea p75 NTR în și din plute lipidice, reglând astfel capacitatea sa de a induce apoptoza.

NTR p75 expus la suprafață mediază colapsul conului de creștere în prezența și absența proNGF.

Discuţie

Pentru a rezolva enigma de oligomerizare a p75 NTR într-un context de celule vii și pentru a obține o perspectivă asupra mecanismelor sale de activare de către NT, am aplicat o abordare de fluorescență cu o singură moleculă pe care am validat-o deja pentru a imagina și urmări receptorii NT și liganzii acestora (21 ⇓ ⇓ ⇓ –25). Acest lucru evită utilizarea metodelor indirecte, cum ar fi anticorpii sau liganzii marcați și elimină problema obstacolului steric Qdot (51) (Anexa SI, Fig. S3). În celulele neuroblastomului (filmul S1 și figurile 2D și 4A), precum și în neuronii primari (fig. 4B, apendicele SI, fig. S7 și filmul S2), NTR p75 prezintă o dinamică rapidă și este prezentă în cea mai mare parte sub formă monomerică. Stimulările NT sau proNT nu-i modifică semnificativ stoichiometria (figurile 3 și 4A); în schimb, datele noastre arată că moleculele p75 NTR formează homointeracțiuni tranzitorii doar dacă există (Fig. 2 E - G și 3), indicând faptul că interacțiunile dinamice stau la baza activării receptorului.

Datele noastre dinamice pun sub semnul întrebării posibilitatea unei dimerizări covalente TM p75 NTR, provocând un model anterior pentru mecanismul de acțiune p75 NTR, care postulează că legarea NT la dimerul covalent p75 NTR preformat presupune o schimbare conformațională propagată prin Cys256, ducând la separare a domeniilor morții (17). Acest model a fost deja contestat de considerații structurale asupra flexibilității domeniilor JM și chopper (19). Propunem o bază moleculară alternativă pentru activarea receptorilor, în care monomerii p75 NTR se concentrează preferențial în microdomenii membranare competente pentru semnalizare, precum plute lipidice, la stimularea NGF, cu reziduurile C256 și G265 care joacă un rol crucial în această compartimentare (Fig. 8A). Într-adevăr, importanța Cys256 a fost confirmată de eșecul apoptozei neuronale induse de proBDNF la șoarecii mut p75 NTR knock-in (18). Acest lucru este susținut de observația că wt (dar nu mut) p75 NTR afișează rezidență medie mai mare în regiunile bogate în GM-1 la legarea NGF (Fig. 4 E și F) și că difuzia wt p75 NTR legată de NGF și mut p75 NTR afișează răspunsuri diferite la tratamentele de modulare a colesterolului (Fig. 4D).

Dovezi robuste corelează semnalizarea NT, în special semnalizarea proapoptotică, cu rezidența receptorilor NT în plute lipidice, probabil pentru că mulți interacți și efectori ai căii sunt asociați în mod obișnuit cu aceste regiuni (42, 44, 55). Într-adevăr, palmitoilarea p75 NTR (Fig. 1C) poate media asocierea proteinei cu plute lipidice (1) și este necesară pentru activitatea proapoptotică p75 NTR (27). Prin urmare, p75 NTR poate fi capabil să activeze apoptoza numai în aceste zone, iar lipsa apoptozei indusă de proBDNF de către mut p75 NTR (Fig. 5D) poate fi explicată prin incapacitatea sa de a pătrunde în aceste regiuni după legarea NT (Fig. 8A) . Datele noastre de difuzivitate cu modulare a colesterolului indică, de asemenea, această interpretare (Fig. 4 C - F). Nu ne este clar de ce modificările reziduurilor TM pot afecta rezidența p75 NTR în plute lipidice. Modelele disponibile (38) și structurile RMN (56) ale domeniului p75 NTR TM sunt de acord să nu mapeze cele 2 reziduuri de pe aceeași parte a helixului TM. Speculăm că aceste reziduuri sunt implicate în crearea de interfețe specifice care leagă lipide specifice (eventual colesterolul însuși) sau componentele proteice ale plutelor lipidice; în sprijinul acestui fapt, epuizarea colesterolului a afectat apoptoza indusă de proBDNF (Fig. 5E).

Material si metode

Stoichiometrie prin fotoblanșare cu o singură moleculă.

Construcțiile WT p75 NTR, mut p75 NTR și dim p75 NTR au fost transduse în celule SK-N-BE (2), etichetate cu Abberior 635P și apoi fixate timp de 90 min la temperatura camerei cu 4% paraformaldehidă, 5% zaharoză și 0,1% glutaraldehidă în soluție salină tamponată cu fosfat (PBS); spălat de 5 ori cu PBS; și imaginat în PBS la microscopul TIRF. Au fost achiziționate trei filme cu o mie de cadre într-o regiune de interes de 32,68 × 32,68 μm centrată pe celulele selectate, cu 21 ms de timp de integrare. Seriile cronologice au fost apoi analizate așa cum s-a descris anterior (37).

Testul Caspase-3 despicat.

Neuronii corticali de la șoareci wt p75 NTR și p75 NTR KO însămânțați pe lamele de acoperire au fost lăsați netratați sau transduși cu wt/mut p75 NTR. În ziua 3 in vitro (DIV3), neuronii au fost tratați timp de 12 ore cu 20 ng/ml proBDNF uman. Probele au fost apoi fixate în soluție rece de acetonă/metanol 1: 1 timp de 15 minute la -20 ° C și prelucrate pentru imunofluorescență cu caspază-3 anti-clivată (1: 300, 9664; Tehnologie de semnalizare celulară) și anti-MAP-2 1: 2.500, M9942; Sigma - Aldrich) anticorpi. Probele au fost realizate pe un microscop confocal cu un obiectiv de 20 × aer (deschidere numerică = 0,5) și orificiu la 1,5 unități aerisite. Neuronii caspase-3 - pozitivi clivați au fost definiți ca celule MAP2-pozitive care prezintă o intensitate medie peste un prag de intensitate în canalul caspase-3 scindat.

Testul colapsului conului de creștere.

Neuronii hipocampici au fost transfectați cu constructe S6-p75 NTR-GFP; alternativ, au fost transduse cu greutate inductibilă p75 NTR sau mut p75 NTR și induse la concentrații de doxiciclină 0, 0,05 sau 1 μg/ml. Pe DIV3, p75 NTR a fost biotinilat la suprafața celulei înainte de incubare cu 20 ng/ml proNGF. Neuronii au fost apoi spălați o dată și incubați cu streptavidină 10 nM-Qdot655, spălați de 5 ori și fixați în formaldehidă 2% și zaharoză 5% în PBS înainte de imagistica confocală sau TIRF. Pentru a inhiba endocitoza p75 NTR, experimentul de mai sus a fost repetat în prezența 80 μM Dynasore (Sigma - Aldrich) sau 25 μM Pitstop2 (Abcam). Am măsurat 1) aria tuturor conurilor de creștere detectabile; 2) pentru constructele S6-p75 NTR –EGFP, raportul dintre canalele Qdot și EGFP ca măsură a membranei față de grupul total de receptori; și 3) pentru toate constructele p75 NTR, intensitățile în canalul Qdot ca măsură a abundenței membranei la diferitele niveluri de expresie.

Mai multe detalii despre material și metode apar în anexa SI. Cititorii vor putea accesa coduri și materiale contactând direct autorii relevanți.

Mulțumiri

Îi mulțumim lui Robert Youker pentru constructul mut p75 NTR; Luca Puzzi pentru ADN-ul complementar c-jun uman și Gianmichele Ratto pentru vectorii virali adeno-asociați pentru expresia YFP in vivo. Mulțumim lui Carmine Di Rienzo, Francesco Cardarelli, Marco Canossa, Beatrice Vignoli, Michela Serresi și Andrea Palamidessi pentru discuții utile. Acest studiu a fost susținut de finanțare din regiunea Toscanei, Proiectul NOSEISMIC, în cadrul Grant POR CRO FSE 2007-2013 (către S.L.); Ministerul Educației și Proiectelor de Cercetare PRIN 2009XPTWM2 (către S.L.) și FIRB RBAP11X42L (către F. Beltram); Fundația Proiectului Pisa RST 148/16; Proiectele Uniunii Europene Paincage și H2020 Brain Human (SGA1 și SGA2) (până la A.C.); și fonduri instituționale Scuola Normale Superiore (către S.L., L.M. și A.C.).

Note de subsol

↵ 1 L.M., F. Bonsignore și F.G. a contribuit în mod egal la această lucrare.

Pre 3 Adresa actuală: Fondazione Pisana per la Scienza, 56017 S. Giuliano Terme, Pisa, Italia.

↵ 4 Adresa actuală: Departamentul de Microbiologie Moleculară și Imunologie, Universitatea din Missouri, Columbia, MO 65212.

↵ 5 S.L. și A.C. a contribuit în mod egal la această lucrare.

Contribuțiile autorului: L.M., F. Bonsignore, F.G., F. Beltram, S.L. și A.C. cercetare proiectată; L.M., F. Bonsignore, F.G., R.A., A.J., D.P. și M.M. cercetări efectuate; M.C., G.S. și C.S.S. a contribuit cu noi reactivi/instrumente analitice; L.M., F. Bonsignore, F.G., R.A., F. Beltram, S.L. și A.C. date analizate; și L.M., F. Bonsignore, F.G., F. Beltram, S.L. și A.C. a scris ziarul.

Autorii nu declară niciun conflict de interese.