Comunicat de Patty Jo Watson, Washington University, St. Louis, MO (primit pentru recenzie 22 iunie 2000)

dietetice

Abstract

ADN-ul a fost extras din trei probe fecale, vechi de peste 2.000 de ani, din Hinds Cave, Texas. Amplificarea secvențelor ADNmt umane a arătat apartenența lor la nativii americani contemporani, în timp ce secvențele de la antilopa pronghorn, oile bighorn și iepurele cu coadă coton au permis identificarea acestor animale ca parte a dietei acestor indivizi. Mai mult, amplificarea secvențelor de ADN de cloroplast a identificat opt ​​plante diferite ca elemente dietetice. Acești oameni arhaici au consumat 2-4 specii de animale diferite și 4-8 specii de plante diferite într-o perioadă scurtă de timp. Rata de succes pentru recuperarea ADN-ului din paleofeces este în contrast puternic cu cea din rămășițele scheletice unde rata de succes este în general scăzută. Astfel, rămășițele paleofecale umane reprezintă o sursă de ADN antic care se completează semnificativ și poate fi, în unele cazuri, superioară celei din țesutul scheletic.

ADN-ul recuperat din excrementele lăsate până acum la animale dispărute permite identificarea și studiul genetic al acestora și dezvăluie aspecte ale dietei lor (1). În timpul săpăturilor arheologice se găsesc, de asemenea, cantități mari de materiale fecale antice de origine umană presupusă, în special în peșteri uscate și adăposturi de roci. Un astfel de sit este Peștera Hinds, situată la marginea estică a deșertului Chihuahuan din sud-vestul Texasului, unde au fost găsite peste 1.000 de depozite fecale umane supuse în timpul unei săpături din 1974 (2).

Pentru a investiga dacă un astfel de material poate fi folosit pentru a studia secvențele ADN de la oamenii antici și din alimentele pe care le-au ingerat, am analizat compoziția moleculară și conservarea ADN pentru trei probe paleofecale (numerotate I-III aici) (Fig. 1). Rezultatele arată că secvențele ADN de la indivizii defecați, precum și cele de la plante și animale consumate de aceștia pot fi recuperate. Analizele acestor secvențe permit determinarea afilierilor populației mtDNA ale oamenilor și oferă, de asemenea, informații despre dietele lor.

Paleofeces umane din Hinds Cave, Texas. [Scară, 1 cm în fotografie este egal cu 2,78 cm real (diapozitiv).]

Materiale și metode

Proceduri experimentale.

Pentru a evalua nivelul de conservare biomoleculară înainte de analiza ADN, am analizat probele prin piroliză cromatografie gazoasă/MS, așa cum sa efectuat pe probele de coprolit anterioare (1). Aproximativ 15 mg de probe paleofecale măcinate au fost pirolizate și analizate prin piroliză-cromatografie gazoasă/MS) așa cum este descris pentru probele osoase (3).

ADN-ul a fost extras o dată din toate probele așa cum este descris (1). În plus, a fost efectuată câte o extracție din probele I și II cu următoarele modificări. Două până la trei grame de materie paleofecală uscată au fost rehidratate timp de 5 zile în întuneric într-un desicator de sticlă conținând o sticlă deschisă de 500 ml de apă dublă distilată, care a fost lăsată să se evapore ajutată de o bandă de hârtie de filtru Whatman cu un capăt în apa și un capăt pe exteriorul sticlei. Umiditatea relativă din desicator a atins un platou de 92% în a doua zi. După rehidratare, probele au fost plasate în tuburi Falcon de 50 ml conținând 10 ml tampon de extracție clorură de litiu (0,1 M Tris⋅Cl, pH 7,2/10 mM EDTA, pH 8,0/0,5 M LiCl/1% litiu dodecil sulfat/50 mM DTT/200 μg/ml Proteinaza K), care a fost rotită peste noapte la 37 ° C. S-au adăugat cinci mililitri de bromură de cetiltrimetilamoniu 4%, 2% polivinilpirolidonă și s-au rotit din nou peste noapte la 37 ° C. Din acest amestec, 1 ml a fost extras așa cum este descris (1) în timp ce restul a fost înghețat la -20 ° C pentru extracție ulterioară. Extracția suplimentară de ADN a probei III pentru replicare independentă a fost efectuată la Oxford așa cum este descris (1).

Amplificările PCR au fost efectuate așa cum este descris (4) utilizând primerii enumerați mai jos pentru trei site-uri de restricție (HaeIII, HincII și AluI), repetarea de 9 bp, regiunea hipervariabilă I, genele 12S și 16S rRNA și gena clorplast rbcL: L00635 5'-TGAAAATGTTTAGACGGCCTCACATC-3 '; H00708, 5'-TAGAGGGTGAACTCACTGGAAC-3 '; L13259, 5'-AATCGTAGCCTTCTCCACTTCA-3 '; H13377, 5'-TATCTTGTTCATTGTTAACGTTGTGG-3 '; L05054, 5'-TAGGATGAATAATAGCAGCTCTACCG-3 '; H05184, 5'-GGGTGGATGGAATTAAGGGTGT-3 '; L09158, 5'-ATACTACGGTCAATGCTCTG-3 '; H09297, 5'-ATGCTAAGTTAGCTTTACAG-3 '; L16131, 5'-CACCATGAATATTGTACGGT-3 '; H16218, 5'-ATGTGTGATAGTTGAGGGTTG-3 '; L16209, 5'-CCCCATGCTTACAAGCAAGT-3 '; H16303, 5'-TGGCTTTATGTACTATGTAC-3 '; L16287, 5'-CACTAGGATACCAACAAACC-3 '; H16379, 5'-CAAGGGACCCCTATCTGAG-3 '; 12Sa ′, 5′-CTGGGATTAGATACCCCACTAT-3 ′; 12Deci, 5′-GTCGATTATAGGACAGGTTCCTCTA-3 ′; 16S6, 5'-TTTCGGTTGGGGCGACCTCGGAG-3 '; 16S7, 5'-TTGCGCTGTTATCCCTAGGGTAACT-3 '; rbcLZ1, 5′ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGCAAGT-3 ′; rbcL19b, 5′CTTCTTCAGGTGGAACTCCAG-3 ′ și rbcL19, 5′-AGATTCCGCAGCCACTGCAGCCCCTGCTTC-3 ′.

Amplificări ale porțiunilor din regiunea hipervariabilă au fost efectuate de două ori pentru toate probele pentru a detecta substituții din cauza încorporărilor greșite de nucleotide care pot fi prezente în toate clonele atunci când amplificările care încep de la câteva sau de la molecule cu șablon unic (5). Toate produsele de amplificare au fost clonate în vectori de clonare TA (Invitrogen) conform instrucțiunilor producătorului, așa cum este descris (5). PCR de colonie a fost efectuat așa cum este descris (6). Secvențierea a fost efectuată cu un kit de secvențiere a ciclului (Amersham Pharmacia) conform instrucțiunilor producătorului.

Identificarea plantelor.

Un total de 111 clone rbcL au fost secvențiate. Deoarece diferențele de nucleotide prezente într-o singură clonă sunt susceptibile de a fi rezultatul încorporării greșite a nucleotidelor în timpul PCR, secvențele consensuale ale fiecărui grup de secvențe înrudite au fost luate pentru a reprezenta secvența unei anumite plante prezente în specimenul paleofecal. Aceste secvențe au fost identificate taxonomic așa cum este descris (1) prin utilizarea programului blastn (20 ianuarie 2000). Au fost observate familii și comenzi care se potrivesc cu 0 și/sau 1 nepotrivire. În cazul în care o singură familie se potrivește cu secvența, se presupune că acea familie este corectă, în cazul în care două sau mai multe familii din aceeași ordine se potrivesc, ordinea a fost considerată ordinea corectă. Cinci clone care nu au putut fi asociate cu niciun cluster de secvențe și intrări de baze de date potrivite la mai mult de două diferențe au fost considerate neidentificabile. În cele din urmă, două clone identice din eșantionul II (vezi Fig. 3, indicat prin *) au prezentat o diferență la două familii din ordinul Zingiberales. Membrii acestui ordin nu sunt nici aridați, nici adaptați la climele continentale, prin urmare, cea mai simplă explicație pentru această constatare este o identificare greșită, probabil deoarece niciun reprezentant al familiei corecte nu este prezent în baza de date.

Identificarea animalelor.

Pentru a identifica secvențe de vertebrate neumane în ampliconii ADN-ului care codifică ARNr 12S și 16S, am clonat produsele PCR și am examinat clonele printr-o PCR de colonie folosind primerii M13 înainte și invers cu adăugarea unui al treilea exemplu specific uman. (12SA′H 5′-GCCCTAAACCTCAACAGTTAAATC-3 ′ și respectiv 16S6H 5′-ACCAGTCAAAGCGAACTACTATAC-3 ′, respectiv). Toate produsele PCR care prezintă un produs de amplificare de lungimea așteptată pentru o inserție relevantă, dar nereușind să prezinte produsul de amplificare uman mai scurt au fost secvențiate. Screeningul a 68 de clone 12D rADN din proba I a dus la trei clone neumane; întrucât nu s-au găsit clone neumane în 64 de clone 12D rADN din eșantionul II și nici între 33 și 28 de clone 16S rADN din eșantioane I și, respectiv, II. Secvențele au fost comparate cu secvențele GenBank utilizând blastn (20 ianuarie 2000). Familiile care se potrivesc la 0 și 1 nepotriviri au fost notate împreună cu următorul meci cel mai apropiat, iar identificările au fost făcute atunci când o singură (și o singură) familie s-a potrivit la 0 și 1 nepotrivire.

Rezultate

Context și întâlniri.

Hinds Cave este un adăpost de rocă situat pe râul Pecos din județul Val Verde, Texas (2), care conține dovezi ale 10.000 de ani de ocupație intermitentă a vânătorilor-culegători preistorici. Cele trei probe paleofecale utilizate în acest studiu provin de la lentila 13 a blocului de latrine netulburat B. Lentila 13 se află la 1,5-2 m sub suprafața peșterii actuale. Această zonă a constat în principal dintr-un număr mare de depozite paleofecale suprapuse. În timp ce instrumentele de debitare litică și piatră nu erau frecvente în zona B, datarea cu carbon a lentilei plasează depunerea sa în perioada C, arhaică. Cu toate acestea, bucăți din fiecare probă au fost măcinate la o putere fină și o alicotă a pulberii din fiecare probă a fost datată de carbon de către acceleratorul MS la 2.165 ± 60 (Ua-15512), 2.370 ± 60 (Ua-15511) și 2.280 ± 90 (Ua-15386) ani BP.

Piroliză-cromatografie gazoasă/MS.

Alte alicote ale celor trei probe au fost pirolizate și produșii de piroliză au fost analizați prin cromatografie gazoasă/MS. Toate cele trei probe au dezvăluit o abundență de derivați polizaharidici și compuși ligninici relativ nealterați, care indică o conservare excelentă a țesuturilor plantelor, în timp ce derivații guaiacol și siringol indică prezența atât a plantelor di-, cât și a celor monocotiledonate (7). Mai mult, produsele derivate din aminoacizi și peptide (diketopiperazine), precum și compuși alifatici (acizi grași, alchene și steroizi) sugerează prezența resturilor de carne. În cele din urmă, au fost observate pirole, cianobenzeni și indoli abundenți, care ar putea proveni din reacția Maillard (8), adică legarea încrucișată a zaharurilor reducătoare la aminele primare (9), au fost observate în toate probele. Deoarece rezoluția produselor Maillard a dovedit că ADN-ul din rămășițele antice este disponibil pentru amplificarea enzimatică (1), PTB (bromură de N-fenacil tiazoliu), o substanță chimică care rupe legăturile încrucișate Maillard (10), a fost adăugată la extracțiile ADN.

Analize mtDNA.

Secvențe de ADN ale clonelor derivate din proba I. (A) Clonele din cele trei fragmente de restricție (parantezele indică locul restricției) și repetarea 9-bp, (B) un segment al regiunii hipervariabile I (secvența de referință din ref. 14) și (C) trei clone dintr-un fragment al genei ARNr 12S corespunzătoare genurilor Antilocapra și Sylvilagus, ale căror secvențe apar ca secvență de referință în partea de sus. Bazele ambigue sunt indicate prin abrevieri standard, iar liniuțele indică ștergerile.

Date și date secvență ADNmt pentru trei probe fecale

Dieta plantelor.

Pentru a analiza dieta plantelor acestor indivizi, am amplificat un fragment de 157-bp (incluzând primerii) din gena cloroplastului rbcL (1) din toate probele și, în plus, un fragment de 183-bp (inclusiv primerii) din probele I și II. Produsele au fost clonate și clonele au fost secvențiate până când au fost găsite în mod repetat aceleași grupuri de secvențe de ADN conexe (Fig. 3). Secvențele consensuale ale fiecărui grup au fost comparate cu cele aproximativ 4.000 de secvențe rbcL prezente în GenBank. Acest lucru a permis identificarea taxonomică la comandă și, în unele cazuri, la nivelul familiei (1). Eșantionul I conținea secvențe de ADN de la Liliales (o ordine care include plante comune la nivel local, cum ar fi Agave și Yucca), Asteraceae (familia de floarea-soarelui, de asemenea comună la nivel local) și Ulmaceae (familia ulmului, în acest caz, probabil cel de smirnă) Eșantionul II conținea ADN de la Liliales, Asteraceae, Fagaceae (familia stejarului, prezentă în canioanele din apropiere și posibil ingerată sub formă de ghinde), Solanaceae (familia solanelor, probabil Physalis comestibilă prezentă local) și Ulmaceae. Proba III conținea ADN de la Asteraceae, Fabaceae (leguminoase), Fouquieriaceae (familia ocotillo, prezentă local), Rhamnaceae (familia cătină, probabil arbustul comun comun Condalia) și Ulmaceae (Tabelul 2).

Secvențele ADN ale clonelor din două fragmente ale genei cloroplastului rbcL s-au amplificat din cele trei probe paleofecale. Literele și numerele din stânga indică numărul clonei, numărul eșantionului [dat ca A (I), B (II), C (III)], numărul de extracție și numărul PCR. G indică probe care au fost măcinate sub azot lichid și extrase, iar R indică probe care au fost rehidratate și extrase. X indică clonele care se potrivesc secvențelor băncii de date cu două sau mai multe diferențe. j indică clone care reprezintă evenimente PCR săritoare. Clusterele de secvențe au fost identificate ca: A, Rhamnaceae; B, Ulmaceae; C, Fagaceae; D, Asteracea; E, Liliales; F, Fabaceae; G, Solonaceae; și H, Fouquieriaceae. * indică două clone similare ordinii Zingiberales.

Rămășițe vegetale și animale identificate din probele paleofecale

Cele trei probe paleofecale au fost, de asemenea, analizate microscopic. Acest lucru a confirmat prezența Lilliceae (lilies), Fabaceae și Ulmaceae. Celelalte șase plante identificate din secvențele ADN nu au fost găsite, dar Cactaceae (familia cactuselor, comună local), neidentificate printre clonele secvențiate, au fost observate microscopic.

Dieta animalelor.

Pentru a determina dacă o mică proporție a moleculelor amplificate din probele I și II ar putea proveni din resturi de alimente, am examinat clonele din produsele de amplificare a ADNr pentru secvențe de origine neumană. Nu s-au găsit astfel de clone în cazul eșantionului II, dar trei secvențe de ADNr 12S neumane au fost găsite pentru eșantionul I. Două dintre acestea sunt identice cu antilopa pronghorn (Antilocapra americana), în timp ce următoarea secvență cea mai apropiată a diferit la șapte poziții de cei doi membri ai familia Bovidae. A treia secvență este identică cu iepurele de coadă (Sylvilagus audobonii), în timp ce arată nouă diferențe față de următorul meci cel mai apropiat din familia Muridae. Se știe că atât antilopa de pronghorn, cât și iepurele de coadă-coton au fost prezente în zonă, iar în peșteră au fost găsite un dinte identificat provizoriu ca antilopă de pronghorn (20), precum și rămășițe de coadă de coadă (21). Prin urmare, secvențele au fost identificate ca provenind din antilopa pronghorn și, respectiv, iepure de coadă.

Spre deosebire de analiza moleculară, examinarea microscopică a identificat numai mamifere mici și pești din probe (Tabelul 2). Un total de trei dinți și un os de packrat (Neotoma sp.) Au fost găsite în cele trei probe, în timp ce proba I conținea și un singur os de veveriță, proba II cinci solzi și o coloană vertebrală de la un pește osos, iar proba III doi dinți și un femur al unui șobolan de bumbac (Sigmodon sp.).

Discuţie

Este de remarcat diversitatea atât a cărnii, cât și a plantelor ingerate de locuitorii arhaici din Peștera Hinds. Eșantionul I conținea dovezi ale a patru animale (antilopă de pronghorn, iepure de coadă coton, packrat și veveriță) și patru plante (hackberry, familia floarea-soarelui, yucca sau agave și opuntia), eșantionul II conținea două animale (șobolani și pești) și șase plante hackberry, stejar, familia floarea soarelui, yucca sau agave, familia umbrelor și familia leguminoaselor), iar eșantionul III conținea trei animale (oi bighorn, packrat și șobolan de bumbac) și opt plante diferite (familia Catinului, tufă, stejar, familia floarea soarelui, yucca sau agave, familia leguminoaselor, ocotillo și opuntia). Aceasta reprezintă o dietă remarcabil de bogată. Alte dovezi indică, de asemenea, că dieta acestor vânători-culegători preistorici a inclus o diversitate considerabilă de plante și animale (23). Astfel, comparativ cu indivizii dependenți de agricultură, dieta vânătorilor-culegători de peșteri Hinds pare să fi fost mai variată și mai sănătoasă din punct de vedere nutrițional (17).

Concluzii

Secvențele ADNmt umane afiliate cu grupurile actuale de nativi americani ar putea fi recuperate din toate cele trei probe fecale analizate, o rată de succes similară a fost atinsă în studiile asupra materiei fecale de la animale dispărute acum (24). Acest lucru este în contrast puternic cu majoritatea țesutului uman scheletic și mumificat, unde rata de succes a recuperării ADN-ului este scăzută (25). Deși rămășițele scheletice prezintă în mod evident avantaje, de exemplu, pentru studiul contextelor sociale dezvăluite de practicile de înmormântare, aceste descoperiri arată că paleofecele din peșterile uscate și locurile de adăpostire a rocilor reprezintă o sursă de ADN antic, care este relativ abundentă și din care ADN-ul este mai recuperabil în mod fiabil decât este cazul resturilor scheletice umane. În plus, ADN-ul paleofecal oferă informații valoroase despre carnea și componentele vegetale ale dietelor antice, care completează și extinde informațiile obținute prin analize morfologice și biochimice (26). În cele din urmă, paleofecele pot fi mai accesibile studiului științific decât alte rămășițe, deoarece nu reprezintă obiecte cu valoare spirituală (27).

Mulțumiri

Mulțumim lui D. Poinar pentru ajutor și sprijin constant; M. Hofreiter, P. Martin, S. Meyer, I. Nasidze, G. Poinar, D. Serre, M. Stoneking și L. Vigilant pentru discuții constructive; G. Possnert pentru datarea cu carbon; S. Bicknell pentru fotografii și Max Planck Society și Deutsche Forschungsgemeinschaft pentru sprijin financiar.

Note de subsol

Cui căruia i se adresează cererile de reimprimare. E-mail: Poinareva.mpg.de .

Depunerea datelor: Secvențele raportate în această lucrare au fost depuse în baza de date GenBank (nr. De acces AF354048 - AF354050).