Abstract

INTRODUCERE

Compoziția furajelor pentru animale în cele patru grupe de doze

induce

Proteine ​​oxidate și MDA. 2

Aproximativ 0,3 g de ficat zdrobit a fost omogenizat timp de 10 s cu un omogenizator Ultra-Turrax T25 (Janke Kunkel GMBH, Staufen, Germania) în 3 ml de zaharoză 0,25 m și centrifugat la 9000 × g, iar fracția citosolică a fost obținută prin precipitare de calciu (18). Fracțiile plasmatice și citosolice din ficat au fost testate pentru reziduurile oxidate de lizină (AAS) și pentru resturile oxidate de prolină sau arginină (γ-glutamil semialdehidă) în proteine, așa cum este descris de Daneshvar și colab. (19). Proteina a fost determinată pe un analizor Cobas Mira + folosind un kit comercial (numărul de catalog 0736783; Roche, Basel, Elveția).

MDA totală în plasmă a fost determinată prin HPLC așa cum este descris de Lauridsen și Mortensen (20) .

Enzime antioxidante.

Testele automate pentru enzimele antioxidante SOD, GPx, CAT și GR în RBCs lizate au fost efectuate pe un analizor Cobas Mira. SOD (numărul de catalog Randox SD 125) și hemoglobina (numărul de catalog Randox HG 980) au fost determinate folosind kituri disponibile comercial, în timp ce activitatea GR a fost determinată prin metoda Goldberg și Spooner (21). Activitatea GPx, folosind terț-butilhidroperoxid ca inițiator și activitatea CAT au fost determinate în conformitate cu o metodă descrisă de Wheeler și colab. (22). Activitățile enzimatice din RBC au fost calculate în raport cu cantitatea de hemoglobină.

Vitamina C din plasmă și ficat.

Plasma (200 μl) și omogenizarea ficatului (300 mg) au fost tratate imediat cu acid metafosforic așa cum s-a descris anterior și depozitate timp de maximum 3 luni la -80 ° C înainte de analiza HPLC pentru ascorbat și dehidroascorbat (23) .

Izolarea celulelor din ficat și căptușeala colonică.

Izolarea celulelor hepatice s-a efectuat în esență așa cum s-a descris anterior (24). Celulele mucoasei colonice au fost răzuite de pe bucățile de colon decongelate cu o lamă de microscop de sticlă și plasate în soluție Merchant-EDTA rece [0,14 m NaCl, 1,47 mm KH2HPO4, 2,7 mm KCl, 8,1 mm Na2HPO4, 10 mm NaH2PO4 și 10 mm NaEDTA (pH 7,4); Ref. 25] .

Analiza mutației.

Celulele colonului și ale ficatului au fost suspendate în 2 ml de Merchant-EDTA prin pipetare în sus și în jos de trei ori. Aproximativ 20 de milioane de celule au fost filtrate printr-un filtru de celule (Falcon; Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), iar ADN-ul a fost purificat prin trusa de izolare a ADN-ului RecoverEase (Stratagene, La Jolla, CA). ADN din aproximativ 60 mg de ficat congelat a fost preparat de către RecoverEase așa cum este descris de producător (Stratagene). Preparatul ADN (8 pl) a fost ambalat cu extract de ambalaj Transpack (Stratagene). Dacă amestecul de ambalare a fost vâscos după timpul standard de ambalare recomandat de 180 min, amestecul a fost incubat încă 60 min. Dacă amestecul a fost încă vâscos după acest timp, s-au adăugat reactivi suplimentari Transpack și amestecul a fost incubat timp de încă 60 de minute. Acest preparat de fagi a fost utilizat pentru a infecta Escherichia coli G1250 (hfl -). Fagii cu mutații la locusul cII au fost identificați prin formarea plăcii în condiții de creștere selectivă la 24 ° C, iar numărul total de fagi infecțioși a fost determinat prin formarea plăcii în condiții de creștere neselective la 37 ° C așa cum este descris (mutația λ Select-cII ™ Sistem de detectare pentru rozătoarele mari albastre; Stratagene).

Analiza SCGE.

Detectarea deteriorării ADN-ului în ficatul unic și celulele colonului a fost efectuată așa cum s-a descris anterior (24). Nivelul siturilor sensibile la EndoIII a fost obținut ca diferență în scorurile de diapozitive paralele incubate cu și fără enzime EndoIII la 37 ° C timp de 45 de minute [Endoima enzima a fost un dar bun de la Serge Boiteux (UMR217 Centre National de la Recherche Scientifique et Commissariat) a l'Energie Atomique, Fontenay aux Roses, Franța)]. Un total de 50 de imagini au fost marcate pentru fiecare probă, utilizând sistemul software Kinetics Imaging Limited (Liverpool, Marea Britanie) versiunea 4 pentru a determina cantitatea de ADN care a migrat de la capul cometei la coadă.

Detectarea 8-oxodG.

Nivelurile de 8-oxodG în raport cu deoxiguanozina au fost măsurate în celulele mucoasei colonului și ficatul prin HPLC cu detectare electrochimică după izolarea și digestia ADN-ului nuclear așa cum s-a descris în altă parte (26). Concentrațiile urinare de 8-oxodG au fost măsurate prin HPLC cu detectarea spectrometriei de masă tandem așa cum s-a descris în altă parte (27) .

32 P Analiza postetichetare.

ADN-ul a fost extras din ficatul zdrobit și din celulele mucoasei colonice prin procedura standard de extracție a fenolului/cloroformului, iar testul postetichetare 32 P a fost efectuat așa cum s-a descris anterior (28), folosind extracția butanolului ca procedură de îmbogățire. Un standard format din ADN timus de vițel modificat in vitro benzo (a) piren-diol-epoxid a fost folosit pentru a corecta variația de zi cu zi în test. Rezultatele sunt exprimate ca aducti/10 8 nucleotide, pe baza mediei a două teste independente.

Cuantificarea rERCC1 și rOGG1 Niveluri de ARNm în colon și ficat.

ARN-ul total a fost purificat din 10 mg de ficat sau din 5 × 106 celule de colon folosind un kit de purificare a ARN-ului total Qiagen conform recomandărilor producătorului. ARN-ul a fost tratat cu DNază după cum a recomandat Qiagen. Controlul ulterior al calității a arătat că toată contaminarea genomică a fost eliminată prin tratamentul cu DNază. Integritatea ARN-ului a fost verificată prin electroforeză pe gel așa cum s-a descris anterior (29). ARN (200 ng) a fost utilizat pentru sinteza ADNc într-un volum de reacție de 10 μl folosind kitul Taqman Gold cu transcriere inversă-PCR, așa cum este recomandat de PE Biosystems. Pentru cuantificarea nivelurilor de mARN, s-au folosit sonde Taqman. Pentru rERCC1, s-au utilizat următoarele oligonucleotide: (a) grund înainte (53F), 5'-cctgggaaggacgaggaaa-3 '; (b) grund invers (121R), 5′-tgggataacaaacttcttcctggt-3 ′; și (c) sonda Taqman (74T), 5′-FAM-cggccacagccctcaggacc-TAMRA-3 ′ (TAGCopenhagen). Pentru rOGG1, au fost utilizate următoarele oligonucleotide: (a) sonda Taqman, 5'-FAM-TCATGCCCTGGCTGGTCCAGAAG-TAMRA-3 '; (b) grund înainte, 5'-ACTTATCATGGCTTCCCAAACC-3 '; și (c) un primer invers, 5'-CAACTTCCTGAGGTGGGTCTCT-3 '. Această sondă nu este specifică șobolanului OGG1 și este probabil să detecteze atât ARNm nuclear, cât și mitocondrial OGG1 între specii.

Reacțiile PCR au fost efectuate în duplicat sau triplicat într-un sistem de detectare a secvenței ABI 7700 în reacții de 15 μl conținând 200 n m primeri, 300 n m sondă Taqman și 0,1 μl de ADNc în 1 × Mastermix (PE Biosystems). Pentru normalizare, ARNm 18S a fost cuantificat într-o reacție PCR separată utilizând un reactiv de test endogen de testare predevelopat pentru cuantificarea ARN 18S (PE Biosystems) în duplicat sau triplicat. Pentru fiecare animal, valoarea medie a cuantificărilor rERCC1 a fost împărțită la valoarea medie a cuantificărilor ARN 18S.

Semnalele de la rERCC1, rOGG1 și ARN 18S au fost liniare de diluare de 100 de ori (datele nu sunt prezentate). La fel, normalizarea semnalului rERCC1 la ARN 18S a dat același semnal pe o diluție de 100 de ori (datele nu sunt prezentate). Măsurătorile repetate ale aceleiași probe au dat un SD de 20% între loturi. SD pe triplicate a fost, în medie, de 15%.

Apoptoza.

Măsurarea proliferării celulare în ficat.

Numărul total de hepatocite și numărul de celule cu colorare nucleară clară a PCNA au fost numărate folosind un microscop cu lumină standard (Leica DMR, Wetzlar, Germania) conectat la o cameră digitală (Leica DC 100) care transmite imaginea pe un ecran de 17 inci . Hepatocitele cu o colorare slabă și granulară a nucleului sau cu reacție citoplasmatică nu au fost incluse; prin urmare, celulele pozitive reprezintă în principal celule în faza S a mitozei (30). Probele de ficat au fost orbite de observator. Pentru fiecare probă de ficat, hepatocitele au fost numărate în 15-20 de câmpuri sistematic alese aleatoriu. Pe scurt, fiecare câmp a fost ales deplasându-se prin eșantionul de țesut într-un model Meander la mărire × 100, având grijă ca câmpurile să nu se suprapună; mărirea a fost apoi schimbată la × 630 pentru numărarea celulelor. Pentru a evita supraestimarea, au fost numărate doar hepatocitele focalizate și care nu atingeau marginea de jos și stânga câmpului. Au fost numărate între 15 și 30 de celule/câmp și s-au numărat aproximativ 360 de celule/animal. Procentul de hepatocite colorate pozitiv pentru PCNA a fost determinat ca numărul de hepatocite pozitive/probă împărțit la numărul total de hepatocite/probă × 100.

Statistici.

Toți parametrii au fost testați pentru distribuție normală cu testul Kolmogorov-Smirnov (P> 0,01). Omogenitatea varianței între grupuri a fost evaluată prin judecarea graficelor reziduale standard (procedura General Linear Model, SAS Statistical Package, versiunea v8; SAS Institute Inc., Cary, NC). Unii parametri au trebuit să fie transformați logaritmic pentru a îndeplini oricare dintre criterii. Grupurile au fost comparate utilizând ANOVA unidirecțional. Dacă s-au observat diferențe semnificative (P (). Datorită aportului efectiv ușor mai mare în grupurile cu doze mici și medii, nu a existat nicio scădere a aportului altor componente furajere din aceste grupuri. Deoarece toate componentele furajelor, cu excepția zaharozei, au fost consumate în cantități proporționale de către animalele din fiecare grup, un EI și un NI au fost calculate prin stabilirea medianei grupului de control la 100 (vezi Tabelul 2 (). În grupul cu doze mari, a existat o scădere semnificativă a IN, indicând faptul că aportul tuturor micronutrienților, cazeinei, amidonului, uleiului de boabe de soia și celulozei a fost redus cu aproape 30% în comparație cu martorii (P Vizualizați acest tabel:

  • Vizualizați în linie
  • Vizualizați fereastra pop-up

Alimentarea cu furaje, creșterea în greutate corporală și greutățile corporale finale

Efecte asupra mutației, deteriorării ADN-ului și reparării.

O creștere dependentă de doză a fost observată în mutațiile cII din mucoasa colonică (P = 0,0017), în timp ce ficatul nu a fost afectat (P = 0,61; vezi Fig. 1 (). Titrurile individuale ale fagilor și frecvențele mutațiilor sunt enumerate în Tabelul 3 ⇓. Formarea aductului ADN, determinată prin postetichetare 32 P, a fost dependentă de doză și semnificativ redusă prin zaharoză alimentară crescută în colon, în timp ce ficatul nu a fost afectat (vezi Fig. 2 (). Nu a existat niciun efect al zaharozei asupra nivelului de 8-oxodG, rupturi de catenă sau situsuri sensibile la EndoIII în ADN în colon sau ficat. Capacitatea de reparare a ADN-ului colonului determinată de nivelurile de ARNm rERCC1 sau rOGG1 nu a fost afectată de zaharoză. Analiza de corelație Pearson a markerilor de colon a relevat asocieri inverse semnificative de mutații la aducti (r 2 = 0,56; P 2 = 0,55; P 2 = 0,13; P = 0,56). De asemenea, s-a observat o asociere pozitivă în expresia celor două enzime reparatoare (r 2 = 0,52; P = 0,01).

Nivelurile de aducție a ADN-ului în colon () și ficat (□) determinate prin postetichetare 32 P. Barele reprezintă mijloace, iar liniile indică 1 SD. Grupuri care sunt semnificativ diferite (P Vizualizați acest tabel:

  • Vizualizați în linie
  • Vizualizați fereastra pop-up

Frecvența mutației (MF) și numărul total de fagi ambalate pentru fiecare animal pentru colon și ficat

Nivelurile de ARNm rERCC1 hepatic, dar nu și rOGG1 au fost afectate semnificativ, așa cum a fost determinat de ANOVA, dar numai grupul de doză mai mică a diferit de martori (vezi Tabelul 4 (). Nu a existat nicio corelație între formarea aductului, frecvența mutației și expresia enzimei de reparare a ADN-ului în ficat.

Markeri de deteriorare oxidativă și apărare

Nu s-a observat niciun efect global asupra deteriorării oxidative a ADN-ului, determinat prin excreția urinară a 8-oxodG (P = 0,37).

Alți markeri ai stresului oxidativ.

În plus față de markerii asociați ADN-ului, au fost investigați și alți markeri de stres oxidativ în compartimentul ficatului și sângelui (vezi Tabelul 4 (). Markerii reprezintă leziuni ale proteinelor și lipidelor. Nivelurile de oxidare a proteinelor citosolice hepatice nu au fost afectate de tratamentul cu zaharoză. De asemenea, oxidarea proteinelor plasmatice și oxidarea lipidelor nu au fost afectate.

Markeri ai apărării oxidative.

Nivelul hepatic de ascorbat la șobolani a fost semnificativ afectat de tratamentul cu zaharoză (vezi Fig. 3 (). Ambele niveluri reduse (P = 0,04) și totale (P = 0,02) de vitamina C au fost semnificativ crescute în ficat, iar diferența lor, reprezentând acidul dehidroascorbic, a fost, de asemenea, crescută (P = 0,02). În compartimentul plasmatic, nivelurile de ascorbat oxidat, redus și total nu au fost afectate de zaharoză.

Efectul zaharozei dietetice asupra markerilor legați de reglarea ciclului celular

Expresia Cox2 a fost determinată în colon pentru a evalua dacă calea arahidonatului poate fi implicată în efectele mediată de zaharoză în colon. Nu a existat niciun efect al expunerii la zaharoză asupra expresiei Cox2 în prezentul studiu (vezi Tabelul 5 (), iar analiza corelației Pearson nu a evidențiat interacțiuni cu niciun alt marker din colon.

DISCUŢIE

Sa constatat anterior că zaharoza și fructoza, spre deosebire de glucoză sau amidon, cauzează creșterea greutății ficatului șobolanului și hiperplazie după o perioadă de hrănire de 90 de zile (48). După o perioadă de 3 săptămâni de hrănire, nu am observat nicio diferență semnificativă în greutatea ficatului, proliferarea celulară sau apoptoză între martori și cea mai mare doză de grup. Cu toate acestea, greutatea ficatului și apoptoza s-au corelat semnificativ.

În studiul de față, zaharoza a deplasat toate celelalte componente din furaje, inclusiv amidonul de cartof, care este parțial rezistent la digestie în intestinul subțire. În grupurile cu doze mici și medii, aportul real de alimente a fost ușor crescut, compensând conținutul scăzut de amidon de cartofi și substanțe nutritive din furaje și chiar și în aceste grupuri, efectul zaharozei a fost evident. În grupul cu doze mari, aportul tuturor nutrienților și micronutrienților a fost redus cu 28% din cauza deplasării de zaharoză. Cu toate acestea, consumul total de energie din cele patru grupuri a fost același. Prin urmare, este mai puțin probabil ca efectele observate asupra mutațiilor și aductelor ADN să fie cauzate de scăderea amidonului rezistent sau a altor factori alimentari de protecție, mai degrabă decât de aportul crescut de zaharoză în sine. Pentru a vedea dacă dieta bogată în zaharoză cauzează mutații prin un nou tip de leziuni sau mai degrabă prin creșterea ratei de fond a mutațiilor, analizăm în prezent spectrele mutaționale ale mutațiilor de fond și ale mutațiilor induse de zaharoză la locul cII din colon.

Concluzionăm că o dietă bogată în zaharoză provoacă mutații în epiteliul colonului de șobolan și concomitent determină o scădere a compușilor colonului I. Un efect similar în ficat nu a fost observat, dar un efect slab ar fi putut fi mascat de timpul relativ scurt de hrănire din acest studiu. Concluzionăm în continuare că, deși nivelurile de ascorbat au crescut în ficat cu o dietă bogată în zaharoză, un mecanism oxidativ din spatele acțiunilor dietei bogate în zaharoză este puțin probabil.

Note de subsol

Costurile de publicare a acestui articol au fost suportate parțial prin plata taxelor de pagină. Prin urmare, acest articol trebuie marcat publicitar în conformitate cu 18 U.S.C. Secțiunea 1734 doar pentru a indica acest fapt.

Institutul 1 Căruia i se adresează cererile de reeditare, la Institutul de Siguranță Alimentară și Nutriție, Divizia de Toxicologie Biochimică și Moleculară, Administrația Daneză Veterinară și Alimentară, Mørkhøj Bygade 19, DK-2860 Søborg, Danemarca.

↵ 2 Abrevierile utilizate sunt: ​​MDA, malondialdehidă; AAS, semialdehidă 2-amino adipică; CAT, catalază; FAM, 6-carboxifluoresceinamină succimidil ester; GR, reducerea glutationului; GPx, glutation peroxidază; PCNA, antigen nuclear celular proliferant; SOD, superoxid dismutază; SCGE, electroforeză cu gel unicelular; TAMRA, ester succimidil 6-carboxitetrametilrodamină; TUNEL, marcare deoxinucleotidil transferază terminală, deoxiuridină trifosfat biotinilată, marcată cu nick nick; HPLC, cromatografie lichidă de înaltă performanță; 8-oxodG, 8-oxodeoxiguanozină; EI, indicele energetic; NI, indicele nutrienților; EndoIII, endonuclează III.

  • Primit la 14 ianuarie 2002.
  • Acceptat pe 24 mai 2002.