Senthaamarai Rogawansamy

1 Laborator de igienă ocupațională și de mediu, Disciplina sănătății publice, Școala de sănătate a populației, Universitatea din Adelaide, Australia de Sud 5005, Australia; E-mailuri: [email protected] (S.R.); [email protected] (M.T.); [email protected] (D.P.)

Sharyn Gaskin

1 Laborator de igienă ocupațională și de mediu, Disciplina sănătății publice, Școala de sănătate a populației, Universitatea din Adelaide, Australia de Sud 5005, Australia; E-mailuri: [email protected] (S.R.); [email protected] (M.T.); [email protected] (D.P.)

Michael Taylor

1 Laborator de igienă ocupațională și de mediu, Disciplina sănătății publice, Școala de sănătate a populației, Universitatea din Adelaide, Australia de Sud 5005, Australia; E-mailuri: [email protected] (S.R.); [email protected] (M.T.); [email protected] (D.P.)

2 Sănătate și mediu, Școala mediului, Universitatea Flinders, Australia de Sud 5042, Australia

Dino Pisaniello

1 Laborator de igienă ocupațională și de mediu, Disciplina sănătății publice, Școala de sănătate a populației, Universitatea din Adelaide, Australia de Sud 5005, Australia; E-mailuri: [email protected] (S.R.); [email protected] (M.T.); [email protected] (D.P.)

Abstract

1. Introducere

Populațiile din țările dezvoltate își petrec mai mult de 90% din timpul lor în interior și instalarea și întreținerea sistemelor HVAC (încălzire, ventilație și aer condiționat) au devenit din ce în ce mai importante. Sporii fungici sunt componente comune atât ale aerului interior, cât și al celui exterior. Cu toate acestea, ciupercile au devenit una dintre principalele cauze ale reclamațiilor privind calitatea aerului din interior (IAQ) în mediile ocupaționale [1,2,3]. Ciupercile sunt acum frecvent implicate ca agent cauzal în „sindromul clădirii bolnave” [4], iar contaminarea fungică a mediului interior a fost legată de efecte adverse asupra sănătății, inclusiv dureri de cap, alergie, astm, efecte iritante, probleme respiratorii, micoze (boli fungice), și alte câteva probleme de sănătate nespecifice [5]. Peste 80 de genuri de ciuperci au fost asociate cu simptome de alergii ale căilor respiratorii cu Cladosporium, Alternaria, Aspergillus și Penicillium printre cele mai frecvente genuri alergenice [6]. Dincolo de alergenicitate, multe ciuperci produc compuși organici volatili microbieni (MVOC) și micotoxine despre care se crede că irită sistemul respirator. Cercetările din studii efectuate pe animale și datele din mediile profesionale au arătat că expunerea la micotoxine poate duce la iritarea membranei mucusului, erupții cutanate, amețeli, greață și imunosupresie [7].

În Australia, în prezent nu există linii directoare privind calitatea aerului interior pentru ciupercile din aer. Cu toate acestea, există o serie de linii directoare internaționale disponibile, atât actuale, cât și istorice (așa cum este subliniat în [3]), dar în mod obișnuit sunt adoptate liniile directoare ale Organizației Mondiale a Sănătății [11]. Întrucât relațiile dintre umezeală, expunerea microbiană și efectele asupra sănătății nu pot fi cuantificate cu precizie, „nu se pot recomanda valori ghidabile cantitative sau praguri pentru niveluri acceptabile de contaminare cu microorganisme” [11]. În schimb, se recomandă ca problemele legate de umezeală și mucegai să fie prevenite și remediate rapid atunci când apar pentru a reduce riscul expunerii periculoase la microbi și substanțe chimice. Alte considerații includ relația dintre nivelurile interioare și exterioare, reprezentate de probele colectate simultan. Principiul este că nivelurile inferioare de ciuperci interioare decât cele exterioare indică un mediu interior acceptabil și diversitatea genurilor de ciuperci interioare ar trebui să fie similară cu cea găsită în aer liber [3,5].

Pentru a minimiza potențialul de expunere, este esențial să remediem un spațiu interior cu contaminare fungică vizibilă. Procesul de remediere implică îndepărtarea materialului de construcție vizibil contaminat și utilizarea unui produs antifungic pentru tratarea suprafețelor, coroborat cu pași de modificare a mediului interior pentru a preveni creșterea fungică viitoare [12]. Se recomandă utilizarea unui aspirator HEPA în combinație cu ștergerea umedă a suprafețelor neporoase pentru a îndepărta sporii dispersați din clădiri [13].

Un agent antifungic, sau fungicid, este un compus chimic biocid sau un organism biologic folosit pentru a ucide sau inhiba ciupercile sau sporii fungici. Ghidul australian pentru mucegai [14] este adoptat în mod obișnuit de industrie și recomandă ștergerea umedă cu un detergent, soluție de oțet sau soluție de alcool pentru îndepărtarea ciupercilor de pe suprafețele contaminate. De asemenea, enumeră agenți antifungici precum înălbitor, alcool (100%), compuși de amoniu cuaternari și formaldehidă ca substanțe chimice care sunt utilizate în tratamentul ciupercilor pe suprafețe, dar nu recomandă în mod explicit utilizarea acestor agenți pentru prevenirea creșterii viitoare.

Scopul acestui studiu a fost de a evalua eficacitatea relativă a cinci agenți de curățare disponibili comercial cu utilizare publicată sau anecdotică pentru remedierea fungilor în interior. Cei cinci agenți au inclus doi dezinfectanți industriali obișnuiți multi-scop (Cavicide® și Virkon®), 70% etanol, oțet (4,0% –4,2% acid acetic) și un compus derivat din plante (ulei de arbore de ceai (Melaleuca alternifolia)).

2. Secțiunea experimentală

2.1. Selecția agentului antifungic

2.2. Prelevarea și identificarea ciupercilor de mediu

Probele de aer din mediul înconjurător au fost colectate pe plăci de agar cu extract de malț (MEA) folosind un impactor de cascadă viabil cu o singură etapă BioStage®, atașat la un eșantionator de aer SKC QuickTake ™ 30. Probele de aer au fost colectate timp de 2 minute fiecare la un debit de 28,3 L/min [21]. Plăcile de agar au fost incubate timp de 7 zile la 25 ° C. După 7 zile, coloniile fungice au fost ridicate cu bandă pe lamele de sticlă și colorate cu albastru de bumbac lactofenol timp de 5 minute înainte de observare prin microscopie cu contrast de fază (Nikon Eclipse Ci; Coherent Scientific). Două genuri reprezentând cele mai frecvent izolate ciuperci din probe de mediu au fost selectate pentru utilizare în studiu (un Aspergillus fumigatus din interior și Penicillium chrysogenum din exterior). Ciupercile selectate pentru utilizare în acest studiu reprezintă ciuperci extrem de frecvente în aer, capabile să crească pe o gamă largă de substraturi și deseori izolate din mediul interior nu numai în Australia, ci și în întreaga lume [22,23].

Pentru a obține culturi pure, trei dopuri de agar cu diametrul de 6 mm au fost tăiate de la marginea unei colonii individuale de A. fumigatus folosind capătul unei pipete Pasteur din sticlă și transferate aseptic pe o placă MEA proaspătă și așezate uniform. Acest lucru a fost repetat pentru P. chrysogenum. Plăcile au fost înfășurate în parafilm și incubate la 25 ° C timp de 7 zile și observate pentru apariția coloniilor fungice pure.

2.3. Eficacitate antifungică folosind testul de difuzie a discului

Testul de difuzie a discului [24] Ficker a fost utilizat pentru a evalua efectul inhibitor al agenților antifungici asupra creșterii A. fumigatus și P. chrysogenum. Suspensiile de spori au fost preparate prin inundarea plăcilor de cultură fungică cu 3 ml de apă distilată sterilă și a fost utilizată o buclă sterilă pentru a agita coloniile. O sută de microlitri din fiecare suspensie de spori a fost utilizată pentru a inocula plăcile MEA care au fost lăsate să se usuce la temperatura camerei timp de 15 min. Plăcile MEA inoculate au fost secționate în jumătăți și 20 µL din fiecare dintre agenții de testare au fost pipetați pe un disc de hârtie filtru Whatman ™ autoclavizat cu diametrul de 9 mm și plasat în mijlocul fiecărei secțiuni.

Fenol (soluție 88%) a fost utilizat ca un control pozitiv pentru inhibarea creșterii fungice și apa sterilă distilată a fost utilizată ca un control negativ. Plăcile au fost sigilate cu parafilm și incubate la 25 ° C timp de 7 zile înainte de observare pentru creșterea fungică și formarea zonelor de inhibare în jurul discurilor. Fiecare test a fost repetat de cel puțin 3 ori pentru fiecare agent (s-au efectuat replici suplimentare n = 4-6 unde s-a găsit un rezultat pozitiv). Un agent a fost clasificat ca având activitate antifungică atunci când diametrul zonei de inhibare a fost mai mare de 9,5 mm, cu 0,5 mm mai mare decât diametrul discului de hârtie [24]. Această valoare servește drept cadru de referință cu care se poate compara susceptibilitatea antifungică a ciupercilor. Cu cât zona concentrică de creștere inhibată este mai mare, cu atât eficacitatea agentului antifungic este mai mare.

Activitatea antifungică a TTO în faza de vapori a fost evaluată folosind o metodă modificată de [25]. O suspensie de 100 pl de spori din fiecare specie fungică a fost răspândită pe plăci MEA proaspete și lăsată să se usuce la aer timp de 15 minute la temperatura camerei. Douăzeci de microlitri de TTO au fost pipetați pe un disc de hârtie de 9 mm și așezați pe suprafața interioară a capacului din placa Petri, neavând niciun contact direct cu suprafața agarului inoculat. Plăcile au fost sigilate rapid în parafilm pentru a minimiza evacuarea componentelor volatile, apoi au fost incubate la 25 ° C și observate după 7 și 14 zile. Eficacitatea antifungică a fost determinată prin măsurarea diametrului mediu perpendicular al zonei de inhibare. Pentru a examina efectul inhibitor al creșterii TTO în timp, plăcile de testare a vaporilor și a soluției TTO pentru ambele genuri fungice au fost re-incubate încă șapte zile după tratamentul inițial, aducând perioada totală de incubație la 14 zile. După reincubare, plăcile de testare au fost re-măsurate pentru inhibarea creșterii.

2.4. Analiza datelor

Comparațiile zonelor de inhibare prin agenți antifungici și martori au fost efectuate utilizând ANOVA unidirecțional. Presupunerea normalității datelor a fost verificată și îndeplinită pentru analiza parametrică. Analiza post-hoc a fost efectuată acolo unde a fost necesar, folosind testul Tukey Multiple Comparisons. Semnificația pentru toate testele a fost stabilită la p ≤ 0,05. Analizele statistice au fost efectuate folosind software-ul SPSS v.16 și GraphPad Prism V.4.

3. Rezultate si discutii

Uleiul de arbore de ceai aplicat ca soluție de contact direct s-a dovedit a avea cel mai mare efect inhibitor asupra creșterii atât a A. fumigatus, cât și a P. chrysogenum după o perioadă de incubație de șapte zile comparativ cu ceilalți agenți antifungici testați (Figura 1). Creșterea A. fumigatus a fost complet inhibată de TTO cu un diametru mediu al zonei de inhibare (83 mm) semnificativ mai mare decât alți compuși de testare (p 2 = 0,9761) și comparabil cu rezultatele fenolului de control pozitiv. TTO a fost mai puțin toxic pentru P. chrysogenum (diametrul mediu al zonei de inhibare de 43,5 mm ± 4,93), dar mai eficient în inhibarea creșterii decât ceilalți compuși testați (p 2 = 0,9620). TTO, atunci când este aplicat sub formă de vapori, sa dovedit a fi mai puțin eficient decât aplicarea directă în inhibarea creșterii ciupercilor condidate (A. fumigatus diametru mediu al zonei de inhibare de 81 mm ± 4; P. chrysogenum diametru mediu al zonei de inhibare de 20,6 mm ± 12,85 testul vaporilor).

antifungici

Diametrul zonelor de inhibare a creșterii Aspergillus fumigatus și Penicillium chrysogenum după tratament folosind diverși agenți antifungici. Media ± SD (N = 40).

Virkon ® a fost eficient numai în reducerea creșterii fungice la o concentrație de 10%, demonstrând un diametru mediu al zonei de inhibare de 19,25 mm (± 7,08) pentru A. fumigatus și 18,67 mm (± 1,15) pentru P. chrysogenum (Figura 1). Soluțiile Virkon ® de cinci la sută, 3% și 1% nu au avut niciun efect asupra creșterii ambelor ciuperci.

Cavicide ® nediluat s-a dovedit a avea un efect inhibitor similar asupra creșterii ambelor ciuperci, cu un diametru mediu al zonei de inhibare de 16 mm (± 0) pentru ambele (Figura 1). În schimb, 75% din Cavicide nu a avut niciun efect inhibitor asupra creșterii oricărui ciupercă.

Oțetul (4,0% –4,2% acid acetic) a avut un efect inhibitor asupra creșterii P. chrysogenum cu un diametru mediu al zonei de inhibare de 15 mm (± 1,15), dar nu a prezentat un efect inhibitor asupra creșterii A. fumigatus Figura 1). Etanolul șaptezeci la sută nu a avut niciun efect vizibil asupra creșterii ambelor ciuperci (Figura 1).

Pentru unii agenți de testare, deși creșterea a rămas neafectată, s-a observat inhibarea sporulării. Cinci la sută, 3% și 1% Virkon ® a inhibat sporularea P. chrysogenum, dar nu a avut niciun efect vizibil asupra sporulației A. fumigatus. Șaptezeci și cinci la sută Cavicide ® a inhibat sporularea A. fumigatus, dar nu a P. chrysogenum. Oțetul a suprimat sporularea P. chrysogenum, dar nu a avut niciun efect asupra sporulării A. fumigatus.

Efectele potențiale de inhibare a creșterii pe termen mai lung ale TTO asupra A. fumigatus și P. chrysogenum sunt prezentate în Figura 2. TTO aplicat ca soluție a devenit mai puțin eficient în inhibarea creșterii P. chrysogenum după 14 zile de tratament (p = 0,004), dar nu pentru A. fumigatus. Vaporii TTO au arătat o inhibare a creșterii scăzută în funcție de timp împotriva ambelor ciuperci, deși s-a dovedit a fi semnificativă doar pentru A. fumigatus (p = 0,0002). Sporularea a fost observată în ziua 14 de tratament pe toate culturile expuse la TTO.

Diferența în zonele de inhibare a creșterii Aspergillus fumigatus și Penicillium chrysogenum la 7 și 14 zile după tratamentul inițial cu ulei de arbore de ceai. Media ± SD (N = 24).

Uleiul de arbore de ceai, ca soluție de contact direct, a fost cel mai eficient în inhibarea creșterii fungice a ambelor specii testate dintre toți agenții evaluați în studiul actual. Acest rezultat este în acord cu datele publicate anterior despre eficacitatea antimicrobiană a TTO in vitro dintr-un cadru clinic [17,18]. Se crede că mecanismul acțiunii antifungice a TTO se datorează alterării structurii membranei celulare, determinând aceasta să devină permeabilă, ceea ce duce la scurgerea materialului celular și perturbarea funcțiilor celulare [39]. Hammer și colab. [17] au constatat că TTO a avut atât un efect inhibitor, cât și un efect fungicid asupra ciupercilor filamentoase. Autorii au descoperit că atât conidii germinați, cât și conidiile ne-germinate ale izolatelor fungice au demonstrat susceptibilitate la TTO. În studiul actual, rezultatele arată că P. chrysogenum este mai puțin susceptibil la TTO decât A. fumigatus. Sensibilitatea redusă a diferitelor conidii la agenți antifungici se datorează, probabil, grosimii, compoziției și densității peretelui conidial.

Un tratament cu hipoclorit de sodiu de 2,4% (NaOCl) a fost testat pe Alternaria alternativ, Aspergillus niger, Cladosporium herbarum, Penicillium chrysogenum, Stachybotrys chartarum și Trichophyton mentagrophytes și s-a constatat că inactivează toți sporii culturilor stoc până la niveluri nedetectabile după 5 minute de contact pe timp non -suprafețe poroase și după 10 minute de contact pe suprafețe poroase [45]. Aceste rezultate sugerează că dezinfectanții pentru hipoclorit sunt eficienți în reducerea proliferării fungice și a nivelurilor de alergeni din mediul interior. Hipocloritul de sodiu a fost, de asemenea, recomandat pentru utilizare în concentrații foarte scăzute (0,04%) pentru inactivarea ciupercilor pe cereale, nuci și legume [46].

Această lucrare evidențiază, în linii mari, necesitatea consistenței în sfaturile date pentru medierea daunelor fungice și importanța verificării dovezilor anecdotice sau a „sfaturilor de cunoștințe comune” a agenților antifungici și a procedurilor de curățare. Important, orice agent antifungic adoptat ar trebui implementat împreună cu măsuri tehnice, cum ar fi îmbunătățirea ventilației și reducerea umidității în aerul interior pentru a preveni creșterea viitoare.

4. Concluzii

Contribuțiile autorului

Sharyn Gaskin și Michael Taylor au conceput și conceput studiul. Senthaamarai Rogawansamy a efectuat colectarea datelor, cu asistența lui Sharyn Gaskin (eșantionarea aerului pentru izolatele fungice) și Michael Taylor (identificarea speciilor fungice). Sharyn Gaskin a efectuat analiza datelor. Senthaamarai Rogawansamy și Sharyn Gaskin au elaborat manuscrisul, iar Michael Taylor și Dino Pisaniello au revizuit manuscrisul. Toți autorii au citit și au aprobat manuscrisul final.

Conflicte de interes

Autorii nu declară niciun conflict de interese.