• Găsiți acest autor pe Google Scholar
  • Găsiți acest autor pe PubMed
  • Căutați acest autor pe acest site
  • Pentru corespondență: hzkong @ ibcas.ac.cnrenyi @ snnu.edu.cn

Editat de Masatoshi Nei, Pennsylvania State University, University Park, PA și aprobat la 11 februarie 2013 (primit pentru revizuire 12 noiembrie 2012)

identitate

Abstract

Corelația dintre pierderea petalelor și expresia AP3-3 peste Ranunculaceae. Cercurile umplute și deschise pe arborele filogenetic indică prezența și respectiv absența petalelor. Probabilitatea de a avea petale în taxoni ancestrali este indicată pentru fiecare nod interior (Fig. S1 oferă detalii). Simbolurile + și - indică dacă paralogii AP3 pot sau nu pot fi izolați folosind tehnica convențională RT-PCR, respectiv.

Rezultate

AP3-3 Ortologii nu sunt în general exprimați în Apetalous Taxa.

AP3-3 Orthologs sunt exprimate în mod înalt și specific în petale.

Pentru a înțelege rolurile ortologilor AP3-3 în dezvoltarea florilor, am investigat detaliu tiparele lor de expresie. Analizele noastre cantitative în timp real RT-PCR (qRT-PCR) au indicat că în cinci dintre cei șase taxoni petali (Leptopyrum, Souliea, Isopyrum, Ranunculus și Nigella de tip sălbatic, dar nu și Clematis petal), AP3-3 ortologii sunt toți exprimați în mod specific în petale, iar nivelurile de expresie sunt întotdeauna extrem de ridicate, cel puțin în comparație cu AP3-1 și AP3-2 (Fig. 2 și 3). Analizele de hibridizare in situ au arătat în continuare că genele Nigella, Leptopyrum și Souliea AP3-3 sunt exprimate inițial în primordii petale și petale în curs de dezvoltare și apoi restrânse la părțile interioare ale petalelor aproape mature, de unde se vor forma țesuturile nectare (Fig. .2 și vezi figurile. S3 și S4). Prin urmare, la speciile petale (cu excepția Clematis), AP3-3 poate funcționa pentru a specifica identitatea petalelor în stadiile incipiente ale dezvoltării florilor și pentru a controla formarea nectarului în stadii târzii. Cu toate acestea, în Clematis petal, rolul AP3-3 este încă neclar, deoarece nivelul său de expresie este foarte scăzut, chiar și în petale (Fig. 3). Probabil, petalele din Clematis sunt controlate de un program de dezvoltare diferit, la care contribuția AP3-3 este neglijabilă.

Baza genetică a mutantului apetal al Nigellei. (A și B) Organele florale și florale ale plantelor de tip sălbatic (A) și mutante (B). (Barele de scară, 0,5 cm.) Organele florale de la stânga la dreapta sunt sepale, petale, stamine și carpeluri. Rețineți că petalele sunt absente în plantele mutante. (C) Expresia relativă a AP3-1 (bare albastre), AP3-2 (bare galbene) și AP3-3 (bare roșii) în țesuturile din plantele sălbatice (superioare) și mutante (inferioare) măsurate folosind qRT- PCR. Țesuturile testate sunt frunze (le), inflorescențe (inf), sepale (se), petale (pe), stame (st) și carpel (ca). (D - L) Model de expresie a AP3-3 în florile de tip sălbatic (D - H) și mutante (I - L), după cum a fost relevat de analizele de hibridizare in situ. (Barele la scară, 50 μm.) (M) Exon - structuri intronice ale alelelor funcționale (NidaAP3-3; Superioare) și nefuncționale (Nidaap3-3; Inferioare). Blocul roșu din al doilea intron al Nidaap3-3 indică elementul MITE tip Gypsy/Ty3. (N) Model de segregare a celor două alele. Alela nefuncțională, care poartă inserția MITE, cosegregează cu fenotipul apetal.

Expresia relativă și structurile exon - intron ale ortologilor AP3-3 din specii ranunculacee petale și apetale. (Stânga) Flori și organe florale ale speciei eșantionate. (Barele la scară, 0,5 cm.) (Centru) Expresia AP3-1 (bare albastre), AP3-2 (bare galbene) și AP3-3 (bare roșii), așa cum este dezvăluit de qRT-PCR. Țesuturile testate sunt frunze (le), inflorescențe (inf), sepale (se), petale (pe), stame (st) și carpel (ca). (Dreapta) Exon - structuri intronice ale ortologilor AP3-3. Regiunile aliniate între ortologi sunt afișate cu linii gri. Două diamante roșii în BecaAP3-3 și un triunghi roșu în EnraAP3-3 reprezintă ștergerile din regiunile de codificare și respectiv de reglare.

Mutantul Nigella apetal a fost cauzat de inserarea unui element transpozabil.

AP3-3 Ortolog în Thalictrum Nu mai există.

AP3-3 Ortholog în Beesia este reglementat în jos prin două ștergeri în regiunile de codificare.

AP3-3 Ortholog in Enemion are o ștergere în regiunea promotorului.

AP3-3 Ortologii din Clematis au caracteristicile pseudogene.

Pentru a înțelege de ce nivelurile de expresie ale genelor Clematis AP3-3 sunt atât de scăzute, am obținut secvențele lor genomice. Compararea acestor secvențe cu cele ale ortologilor lor la alte specii, cu toate acestea, nu a reușit să detecteze vreun defect evident în regiunile de codificare sau reglare (Fig. 3 și Fig. S6). Cu toate acestea, am observat că regiunile de codificare ale celor două gene Clematis sunt destul de divergente una de alta și de ortologii lor, sugerând divergența funcțională sau posibila pseudogenizare. Prin urmare, am efectuat studii evolutive moleculare. Am constatat că, în timp ce ortologii AP3-3 din toate celelalte specii petale au evoluat sub o selecție puternică de purificare, genele Clematis, precum și Aquilegia AqAP3-3b, au evoluat sub selecție relaxată sau aproape neutră (Fig. S6). Acest lucru sugerează că genele Clematis pot deveni pseudogene, deși structurile genetice rămân intacte. Cu toate acestea, ortologii AP3-3 din alte două genuri apetale (Beesia și Enemion) nu prezintă o semnătură clară de selecție relaxată, sugerând că acestea pot fi funcționale sau au devenit pseudogene foarte recent.

Discuţie

AP3-3 - Identitate bazată pe petale.

Este remarcabil faptul că pierderile paralele de petale în diferite linii ranunculacee au fost puternic corelate cu reducerea la tăcere sau reglarea descendentă a unei singure gene, AP3-3. Ceea ce ne intrigă mai mult este că cauza aparentă a schimbării expresiei AP3-3 variază de la specie la specie. În Thalictrum, gena s-a pierdut cu totul, în timp ce în Beesia, Enemion și mutantul Nigella apetal gena a fost perturbată prin deleții sau inserție în regiunile de codificare, promotor sau intronice. În Clematis, ortologii AP3-3 au devenit pseudogene, deși mecanismul de bază pentru o posibilă pseudogenizare sau expresie redusă este încă neclar. Acest lucru, împreună cu faptul că eliminarea genei AP3-3 în Aquilegia poate duce la transformarea petalei în sepale (24), sugerează cu tărie că AP3-3 este o genă de identitate a petalelor și că rolul specific al AP3- 3 în identitatea petalelor este în general conservată pe Ranunculaceae. Mai important, pentru că Aquilegia și Nigella sunt doi membri profund divergenți ai familiei, aceste rezultate oferă cel mai convingător argument că programul de identitate a petalelor bazat pe AP3-3 nu a evoluat de multe ori independent, ci a fost pierdut în numeroase cazuri.

De ce AP3-3?

Cauză sau efect?

Pierderea petalelor ar putea fi avantajoasă.

Materiale și metode

Izolarea și confirmarea genelor.

Pentru fiecare specie (detalii în tabelul S2), ARN-ul total a fost extras din muguri florali în diferite stadii de dezvoltare folosind reactivul PureLink Plant RNA (Invitrogen) și apoi transcris invers în ADNc cu kitul de sinteză ADN-ul catenei SuperScript III (Invitrogen) . Genele asemănătoare AP3 au fost amplificate de două runde de RT-PCR convenționale cu primerii degenerați înainte și un primer adaptor invers (tabelele S1 și S3). Fragmente amplificate de lungimi așteptate au fost apoi purificate și clonate în vectorul de clonare pEASY-T3 (TransGen). Cel puțin 20 de clone pozitive au fost secvențiate pentru fiecare genă, iar secvențele au fost confirmate prin căutări BLAST și analize filogenetice așa cum este descris (16) (Fig. S7). Pentru a obține ADN-ul genomic al ortologilor AP3-3, s-au proiectat primeri specifici genei și s-a realizat o metodă de mers pe genom bazată pe PCR (Takara). Fragmentele de lungime completă ale fiecărei gene au fost asamblate de ContigExpress și confirmate prin secvențierea pe bază de PCR.

qRT-PCR.

ARN-urile totale au fost izolate din frunze, inflorescențe (inclusiv muguri florali în diferite stadii de dezvoltare) și organe florale individuale în etapele aproape mature. ARNm-urile au fost purificate mai întâi din ARN-urile totale cu trusa ARNm Oligotex (Qiagen) și apoi transcrise invers în ADNc așa cum s-a descris mai sus. Eficiența de amplificare a combinațiilor de grund (Tabelele S1 și S3) pentru fiecare genă a fost determinată prin compararea curbelor standard, iar cele mai bune combinații au fost utilizate pentru alte qRT-PCR, care au fost efectuate folosind kitul de reactivi PrimerScript RT (Perfect Real Time)) în un Stratagene Mx3000P. Toate reacțiile au fost efectuate cu trei replici biologice (cu excepția petalelor Leptopyrum, care sunt foarte mici și dificil de colectat) și cu trei replici tehnice. Valorile relative ale expresiei genei au fost mai întâi normalizate la o genă bine-cunoscută de întreținere a casei, ACTIN, și apoi au fost renormalizate la expresia AP3-1 în stamine (38). Observațiile anterioare (7, 24, 39) și propriile noastre au constatat că expresia ortologilor AP3-1 în stamine sunt în general comparabile între specii.

Hibridizarea in situ.

Mugurii florali în diferite stadii de dezvoltare au fost fixați în 4% (greutate/vol) paraformaldehidă și încorporați în Paraplast (Sigma). Un fragment care acoperă capătul C-terminal al regiunii de codificare și 3 'UTR a fost folosit ca șablon pentru sinteza sondelor de ARN marcate cu digoxigenină de sens și antisens cu kitul de etichetare ARN DIG (Roche) (Tabelele S1 și S3). Tratamentele secțiunilor (8-10 µm) au fost efectuate conform descrierii (40), cu mai multe modificări în funcție de specie. Imaginile au fost capturate cu un microscop imagistic Zeiss Axio.

Mulțumiri

Mulțumim Genlu Bai și You Zhou pentru asistență în colectarea materialelor vegetale și Veronica Di Stilio, Xuejun Ge, Yanping Guo, Anmin Lu, Hong Ma, Jongmin Nam, Masatoshi Nei, Kaiyu Pan, Guangyuan Rao și Ji Yang pentru comentarii valoroase. Această lucrare a fost susținută de Programul Național de Cercetare de Bază al Grantului China 2009CB941500 și Fundația Națională pentru Științe Naturale din China Grants 31125005, 30870179 și 31170215.

Note de subsol

↵ 1 R.Z., C.G. și W.Z. a contribuit în mod egal la această lucrare.

Contribuțiile autorului: C.G., Y.R. și H.K. cercetare proiectată; R.Z., W.Z., P.W., L.L., X.D., Q.D., L.Z. și H.S. cercetări efectuate; R.Z., C.G., W.Z. și H.K. date analizate; și R.Z., H.S., S.A.H., E.M.K. și H.K. a scris ziarul.

Autorii nu declară niciun conflict de interese.