Pierderea în greutate pe termen lung la pacienții cu bypass gastric care poartă variante ale receptorilor cu melanocortină 4

ro.waykun.com - Pași pentru a slăbi mâine

Centrul de cercetare Weis de afiliere, Clinica Geisinger, Danville, Pennsylvania, Statele Unite ale Americii

Centrul de cercetare Weis de afiliere, Clinica Geisinger, Danville, Pennsylvania, Statele Unite ale Americii

Centrul de cercetare Weis pentru afiliere, Clinica Geisinger, Danville, Pennsylvania, Statele Unite ale Americii

Centrul de cercetare Weis de afiliere, Clinica Geisinger, Danville, Pennsylvania, Statele Unite ale Americii

Afiliere Geisinger Obesity Institute, Geisinger Clinic, Danville, Pennsylvania, Statele Unite ale Americii

Centrul de cercetare Weis de afiliere, Clinica Geisinger, Danville, Pennsylvania, Statele Unite ale Americii

Centrul de cercetare Weis pentru afiliere, Clinica Geisinger, Danville, Pennsylvania, Statele Unite ale Americii

Afilieri Weis Center for Research, Geisinger Clinic, Danville, Pennsylvania, Statele Unite ale Americii, Geisinger Obesity Institute, Geisinger Clinic, Danville, Pennsylvania, Statele Unite ale Americii

Bryn S. Moore,
Uyenlinh L. Mirshahi,
Evan A. Yost,
Ann N. Stepanchick,
Michael D. Bedrin,
Amanda M. Styer,
Kathryn K. Jackson,
Christopher D. Încă,
Gerda E. Breitwieser,
Glenn S. Gerhard

Cifre

Abstract

fundal

Receptorul melanocortinei 4 (MC4R) reglează în mod critic hrănirea și sațietatea. Variantele rare în MC4R se găsesc predominant la ambii indivizi. Deși unele variante rare în MC4R descoperite la pacienți prezintă defecte în localizare, legarea ligandului și semnalizarea către AMPc, multe nu au defecte recunoscute.

Subiecte/Metode

În cohorta noastră de 1433 subiecți obezi care au fost supuși intervenției de bypass gastric Roux-en-Y (RYGB), am găsit cincisprezece variante ale MC4R. Am comparat purtătorii de variante rare cu pacienții cu alele de referință MC4R pentru sex, vârstă, începând cu IMC și T2D pentru a determina efectul variantelor asupra pierderii în greutate post-RYGB. In vitro, am determinat expresia receptorilor mutanți prin ELISA și western blot și producția de AMPc prin microscopie.

Rezultate

În timp ce poartă o alelă MC4R rară este asociată cu obezitatea, purtătorii de variante rare au prezentat o scădere în greutate comparabilă după RYGB cu cei care nu au purtători. Cu toate acestea, subiecții care au trei dintre aceste variante, V95I, I137T sau L250Q, au pierdut mai puțin în greutate după operație. In vitro, mutația R305Q a provocat un defect în exprimarea suprafeței celulare, în timp ce numai mutațiile I137T și C326R au prezentat semnalizarea AMPc afectată. În ciuda acestor diferențe aparente, nu a existat nicio corelație între semnalizarea in vitro și fenotipul clinic pre- sau post-chirurgical.

Concluzii

Aceste date sugerează că diferențele subtile în semnalizarea receptorilor conferite de variantele rare ale MC4R combinate cu factori suplimentari predispun purtătorii la obezitate. În absența deficitului complet de MC4R, aceste diferențe pot fi depășite prin efectele puternice de reducere a greutății chirurgiei bariatrice. Într-o tulburare complexă, cum ar fi obezitatea, variantele genetice care cauzează defecte subtile care au efecte cumulative pot fi depășite după o intervenție clinică adecvată.

Citare: Moore BS, Mirshahi UL, Yost EA, Stepanchick AN, Bedrin MD, Styer AM și colab. (2014) Pierdere în greutate pe termen lung la pacienții cu bypass gastric care poartă variante ale receptorilor cu melanocortină 4. PLoS ONE 9 (4): e93629. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0093629

Editor: Miguel López, Universitatea din Santiago de Compostela Facultatea de Medicină - CIMUS, Spania

Primit: 18 decembrie 2013; Admis: 6 februarie 2014; Publicat: 4 aprilie 2014

Finanțarea: Această lucrare a fost susținută de Clinica Geisinger și Institutele Naționale de Sănătate DK092775 la TM și DK072488 la GSG. Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Obezitatea este o epidemie mondială care contribuie la comorbidități precum diabetul și bolile de inimă [1]. Obezitatea severă care nu răspunde la medicație și la dietă poate fi tratată eficient cu o intervenție chirurgicală bariatrică. Bypassul gastric Roux-en Y (RYGB), gastrectomia cu manșon vertical și bandarea gastrică sunt cele mai frecvente intervenții chirurgicale bariatrice [2]. Foarte important, diabetul de tip 2 (T2D) remite adesea după RYGB, înainte de a se produce o scădere semnificativă în greutate [3], [4]. RYGB îmbunătățește nivelul glucozei din sânge mai rapid și complet decât scăderea în greutate cu restricții calorice sau alte proceduri bariatrice obișnuite [2], [5].

Reglarea hrănirii și a sațietății, esențiale pentru menținerea unei greutăți sănătoase, are loc în hipotalamus. În starea alimentată, insulina și leptina stimulează neuronii care exprimă proopiomelanocortina (POMC) pentru a elibera hormonul de stimulare a α-melanocitului (α-MSH) și β-MSH [6]. α-MSH leagă și activează receptorul melanocortinei 4 (MC4R), rezultând o creștere a AMPc, inducând senzația de sațietate. Insulina și leptina inhibă, de asemenea, neuronii care exprimă neuropeptida Y (NPY) și proteina asociată cu agouti (AgRP). AgRP este un agonist părtinitor al MC4R care stimulează apetitul [7]. Echilibrul dintre semnalele de la neuronii POMC și AgRP reglează critic comportamentul de hrănire și homeostazia energetică.

Raportăm cincisprezece variante MC4R identificate într-o cohortă de 1433 pacienți obezi care au fost supuși unei intervenții chirurgicale RYGB. Dintre cele cincisprezece variante, două (V103I și I251L) sunt alele comune care apar la frecvențe egale atât în populațiile slabe, cât și în cele obeze [8]. Celelalte treisprezece variante MC4R sunt rare; doisprezece au fost raportate anterior și unul, G34A, este nou. Trei dintre variantele rare au fost asociate cu o slabă scădere în greutate post-intervenție chirurgicală RYGB (V95I, I137T și L250Q), una a prezentat o expresie redusă a suprafeței celulare (R305Q) și două au avut o semnalizare cAMP redusă (I137T și C326R). În ciuda diferențelor aparente în caracteristicile biochimice, nu s-a găsit nicio corelație între semnalizarea in vitro și fenotipurile metabolice pre- sau post-chirurgicale. Împreună, aceste date indică implicarea complexă a MC4R în obezitate, metabolism și pierderea în greutate.

Materiale și metode

Studiați populația, variabilele clinice și secvențierea MC4R

Construcții MC4R

Mutații individuale au fost făcute cu trusa de mutageneză direcționată de site-ul Quickchange (Stratagene, Santa Clara, CA, SUA) într-un MC4R marcat HA de 3x în pcDNA3. HAMC4R 3x a fost subclonat în pEF6V5: eGFP-CAAX-2A-mCherry (Plasmida Addgene 26901) pentru a crea constructul HAMC4R2aGFP. Un site de legare a bungarotoxinei (MWRYYESSLEPYPD) [22] a fost adăugat la capătul N al MC4R prin amplificare PCR și subclonat în pcDNA3.1. Toate construcțiile au fost confirmate prin secvențierea clonei pe toată lungimea.

Cultură de celule

Celulele HEK293 (ATCC, Manassas, VA, SUA) au fost cultivate în MEM cu 10% FBS la 37 ° C și 5% CO2. Pentru transfecții tranzitorii, celulele au fost transfectate cu plasmide descrise mai sus de Fugene (Roche, Indianapolis, IN, SUA) și utilizate două zile după transfecție.

Imaginea receptorului de suprafață celulară

Constructele MC4R marcate cu site-ul de legare a bungarotoxinei (BBS) (BBS-MC4R) au fost transfectate în celule HEK 293 pe fluoruri de fund din sticlă acoperite cu poli-L-lizină (WPI, Sarasota, FL, SUA). Celulele au fost clătite de două ori cu Imaging Low K conținând (în mmol/L): 25 HEPES, 114 NaCl, 2,2 KCl, 2 CaCl2, 2 MgCl2, 22 NaHCO3, 1,1 NaH2PO4, 2 glucoză, pH 7,4 și etichetate cu 10 µg/mL Bungarotoxina (BTX) s-a conjugat cu Texas Red timp de 10-15 min la 4 ° C și s-a clătit din nou în soluție de K scăzut. Celulele vii au fost realizate pe un microscop confocal Olympus Spinning Disc inversat cu software de achiziție de imagini IPLab (Beckton-Dickinson, San Jose, CA SUA) și procesate cu ImageJ.

ELISA

Aproximativ 10.000 de celule transfectate cu marcaj HA au fost adăugate la godeurile unei plăci cu 96 de godeuri acoperite cu poli-L-lizină. A doua zi, celulele au fost spălate cu PBS și fixate fie cu metanol (pentru exprimarea totală), fie cu 4% paraformaldehidă (pentru exprimarea suprafeței). Celulele au fost apoi blocate cu lapte 1% și incubate în anticorp anti-HA conjugat cu peroxidază. Placa a fost spălată cu TBS-T de trei ori și apoi incubată cu 100 uL 3,3 ', 5,5'-Tetrametilbenzidină substrat lichid (Sigma, St. Louis, MO, SUA) timp de 30 de minute. S-au adăugat 100 uL de 1 mol/L acid sulfuric la fiecare godeu pentru a opri reacția. Absorbanța a fost apoi citită la 450 nm pe un cititor de plăci Spectramax 250. Absorbanta din celulele netransfectate a fost mai întâi scăzută și apoi semnalul marcat pe suprafața celulei a fost reprezentat ca procent din semnalul total (calculat ca semnal nepermeabilizat împărțit la semnalul permeabilizat × 100) și apoi normalizat la expresia HA-MC4R de tip sălbatic pentru acel experiment. Diferențe semnificative față de tipul sălbatic au fost determinate folosind ANOVA într-un singur mod cu Dunnet post-hoc.

HAMC4R2aGFP Western

Celulele HEK293 au fost transfectate tranzitoriu cu HAMC4R2aGFP sau HAMC4R2aGFP mutant, unde HA-MC4R și GFP sunt separate prin secvența peptidică 2a de 18 aminoacizi de virusul bolii gura [23], [24]. HAMC4R2aGFP este transcris și tradus ca un produs genetic. După traducere, 2a se auto-clivează și separă HA-MC4R și GFP în două proteine [23], [24]. Celulele care exprimă HAMC4R2aGFP sau mutanți au fost lizate la două zile după transfecție în tampon de liză (25 mmol/L HEPES, 5 mmol/L MgCl2, 5 mmol/L EDTA și 1% Triton) cu protează (cOmplete mini) și inhibitori ai fosfatazei (PhosSTOP) (ambii de la Roche). Nivelurile de proteine au fost determinate printr-un test BCA (Pierce). Lizatele au fost încărcate pentru cantități egale de proteină GFP. Lizatele au fost încărcate pe un gel Bis/Tris de 12% și transferate la o membrană de nitroceluloză. După blocarea cu lapte și testarea cu anti-HA (Roche) sau anti-GFP (NeuroMAb, Davis, CA, SUA), membrana a fost dezvoltată folosind substratul SuperSignal West Pico Chemiluminescent folosind Fujifilm LAS-4000 (Pierce, Rockford, IL, SUA ). Intensitățile benzilor HA și GFP au fost cantitative, iar intensitatea HA a fost normalizată la intensitatea benzii GFP corespunzătoare și normalizată la raportul de tip sălbatic pentru ziua respectivă (n≥3).

cAMP Microscopy Assay

Celulele au fost transfectate cu constructe BBS-MC4R și proteine de schimb activate direct de cAMP (EPAC2) -camps sensor [25], un cadou de la Dr. Nikolaev și Lohse. Celulele au fost marcate cu BTX-Texas Red pentru a identifica celulele care exprimă receptorii. Au fost colectate imagini pentru CFP și Transfer de energie prin rezonanță de fluorescență (FRET) între CFP și YFP. Semnalul FRET a fost normalizat la semnalul CFP pentru fiecare celulă. Au fost stabilite nivelurile inițiale de cAMP și apoi celulele au fost expuse la 100 nmol/L dintr-un agonist sintetic MC4R melanotan II (MTII) și apoi la 100 µmol/L forskolin (pentru răspuns maxim la AMPc).

Rezultate

Am secvențiat gena MC4R a 1433 pacienți care au suferit RYGB primar. Un total de optzeci de pacienți au avut cincisprezece variante distincte de MC4R. Două dintre aceste variante, V103I și I251L, sunt frecvente și apar la> 1% atât din populațiile slabe, cât și din cele obeze [26]. Frecvențele purtătorilor V103I și I251L din cohorta RYGB și 451 subiecți slabi au fost similare [8]. Celelalte treisprezece variante S4F (11C> T), G34A (101G> C), H76R (227A> G), V95I (283G> A), T112M (335C> T), I137T (410T> C), F202L (606C> A), L207V (619C> G), L250Q (749T> A), V253I (757G> A), S295P (883T> C), R305Q (914G> A), C326R (976T> C) sunt considerate rare și au apărut la doar optsprezece pacienți. Doisprezece dintre aceste variante au fost raportate anterior [11], [13], [14], [18], [21], [27] - [35]. Dintre variantele raportate anterior, S4F, H76R, V95I, I137T, L250Q și C326R [13], [14], [18], [28] - [33] au fost găsite numai în cohorte obeze; întrucât T112M, F202L, L207V, V253I, S295P și R305Q [9], [18], [21], [27], [31], [33] - [35] au fost raportate atât la populația obeză, cât și la cea slabă. Varianta G34A nu a fost raportată anterior. În special, nu au fost găsite variante rare în MC4R în cohorta noastră slabă.

IMC-urile pre-chirurgicale ale pacienților cu variante rare au fost asortate cu pacienții non-purtători de același sex, statusul T2D, statusul medicamentului pentru insulină și vârsta similară (în termen de 5 ani) (simboluri negre). Vârsta, sexul și statutul T2D al transportatorului variantă sunt, de asemenea, enumerate ((). * Gama inițială a IMC pentru meciuri a fost extinsă la ± 2. ** Gama inițială a IMC pentru meciuri a fost extinsă la ± 3 sau diferența de vârstă extinsă la ± 8 ani.

IMC-urile pre-chirurgicale ale pacienților cu variante rare au fost asortate cu pacienții non-purtători de același sex, statusul T2D, statusul medicamentului pentru insulină și vârsta similară (în termen de 5 ani) (simboluri negre). Varianta purtătorului, sexul și starea T2D a transportatorului sunt, de asemenea, enumerate ((). * Domeniul inițial al IMC pentru pacientul asociat a fost extins la ± 2.

Pentru a înțelege mai bine potențialele mecanisme moleculare asociate mutațiilor MC4R, am măsurat expresia și semnalizarea canonică in vitro. Pentru fiecare dintre cele cincisprezece variante MC4R din cohorta RYGB, am analizat localizarea suprafeței celulei prin ELISA și imagistica receptorilor marcați pe suprafața celulei. Aproximativ 40% din totalul MC4R a fost localizat la suprafața celulei și toți mutanții au prezentat o expresie similară a suprafeței celulare. Doar mutația R305Q a afișat o scădere mică, dar semnificativă a expresiei suprafeței celulare în comparație cu receptorul de tip sălbatic (Figura 3A). Am examinat expresia suprafeței celulare a acestor variante prin imagistica unei secvențe de legare a bungarotoxinei (BBS) marcată cu MC4R. Etichetarea BBS-MC4R și a mutanților cu membrana impermeabilă bungarotoxină-Texas Red [22] a arătat că toți receptorii mutanți au fost efectiv exprimați pe suprafața celulei (Figura 3B). Receptorii marcați erau prezenți în citoplasma celulelor care exprimă mutanții sau receptorul de tip sălbatic, indicând o anumită internalizare a receptorilor.

A) ELISA a celulelor HEK293 care exprimă MC4R sau mutații de tip sălbatic. Expresia suprafeței celulare a fost normalizată la expresia totală pentru fiecare mutant și apoi la receptorul de tip sălbatic pentru lotul respectiv (* denotă p Figura 4. Testul AMPc al mutanților MC4R.

Domenii de subiect

Pentru mai multe informații despre domeniile PLOS, faceți clic aici.

Dorim feedback-ul dvs. Aceste domenii de subiect au sens pentru acest articol? Faceți clic pe țintă lângă zona subiect incorectă și anunțați-ne. Multumesc pentru ajutor!

Este subiectul „Obezitate” aplicabil acestui articol? da nu