Adresa corespondenței către: Jiwon Hong, dr., Chirurgie aplicată și Laborator de metabolizare, Școala de Științe Biologice, Universitatea din Auckland, 3A Symonds Street, Private Bag 92019, Auckland 1142, Noua Zeelandă

Școala de Științe Biologice, Facultatea de Științe, Universitatea din Auckland, Auckland, Noua Zeelandă.

Centrul de cercetare chirurgicală și translațională, Facultatea de Medicină și Științe ale sănătății, Universitatea din Auckland, Auckland, Noua Zeelandă.

Școala de Științe Biologice, Facultatea de Științe, Universitatea din Auckland, Auckland, Noua Zeelandă.

Departamentul de Medicină Moleculară și Patologie, Facultatea de Medicină și Științe ale Sănătății, Universitatea din Auckland, Auckland, Noua Zeelandă.

Departamentul de Medicină Moleculară și Patologie, Facultatea de Medicină și Științe ale Sănătății, Universitatea din Auckland, Auckland, Noua Zeelandă.

Centrul de cercetare chirurgicală și translațională, Facultatea de Medicină și Științe ale sănătății, Universitatea din Auckland, Auckland, Noua Zeelandă.

Centrul de cercetare chirurgicală și translațională, Facultatea de Medicină și Științe ale sănătății, Universitatea din Auckland, Auckland, Noua Zeelandă.

Centrul de cercetare chirurgicală și translațională, Facultatea de Medicină și Științe ale sănătății, Universitatea din Auckland, Auckland, Noua Zeelandă.

Școala de Științe Biologice, Facultatea de Științe, Universitatea din Auckland, Auckland, Noua Zeelandă.

Centrul de cercetare chirurgicală și translațională, Facultatea de Medicină și Științe ale sănătății, Universitatea din Auckland, Auckland, Noua Zeelandă.

Școala de Științe Biologice, Facultatea de Științe, Universitatea din Auckland, Auckland, Noua Zeelandă.

Școala de Științe Biologice, Facultatea de Științe, Universitatea din Auckland, Auckland, Noua Zeelandă.

Centrul de cercetare chirurgicală și translațională, Facultatea de Medicină și Științe ale sănătății, Universitatea din Auckland, Auckland, Noua Zeelandă.

Abstract

Fundal: Limfa mezenterică (ML) a fost implicată în dezvoltarea sindromului de disfuncție a mai multor organe în bolile critice. ARN-urile extracelulare joacă un rol în comunicarea celulă-celulă în timpul proceselor fiziologice și de boală, dar sunt rareori studiate în ML. Am urmărit examinarea profilurilor de ARN ale plasmei periferice, ML și vezicii extracelulare ale ML (ML-EV) și fracțiunilor lipoproteinei bogate în trigliceride (ML-TRL), obținute din modele de rozătoare ale bolii critice.

Metode și rezultate: Am colectat ML timp de 5 ore de la modele de rozătoare ale bolilor critice [pancreatită acută, legare și incizie cecală (CLI), ischemie-reperfuzie intestinală (IR)] și șobolani de control Sham. Fracțiile ML-EV și ML-TRL au fost, de asemenea, izolate. Secvențierea ARN a fost efectuată pe ARN extras din ML, ML-EV, ML-TRL și plasmă utilizând platforma Ion Torrent Personal Genome Machine. Secvențele de ARN au fost căutate folosind Instrumentul de căutare a alinierii locale de bază împotriva genomului șobolanului și a bazelor de date RefSeq, microARN (miARN), ARNm genomic, ARN funcțional și Genbank, și au fost analizate numărul de citiri. Fiecare tip de probă a avut un profil distinct de ARN. ML conținea mai mult ARN pe volum și o proporție mai mare de fragmente de ARNt decât plasma. ML-EV-urile au fost îmbogățite cu miARN, în timp ce ML-TRL-urile conțineau cantități absolute scăzute de ARN. Profilurile de dimensiune ARN pentru CLI și Gut IR au fost diferite de Sham. ML a purtat ARN-uri intestinale și într-un model CLI a fost îmbogățit semnificativ cu secvențe de ARN bacteriene.

Concluzii: Am găsit profilurile de ARN distincte, dar diverse ale ML și compartimentele sale, precum și profilurile lor diferite în bolile critice. ARN-urile mici derivate din intestin în ML pot avea un rol direct în boli critice și utilitate ca potențiali biomarkeri.

Introducere

Diverse specii de ARN de reglementare 1 sunt stabile în afara celulei 2 și joacă roluri în comunicarea celulă-celulă 3 și alte procese biologice sau patologice. 2,3 Astfel de ARN-uri extracelulare, 1 cu cele mai studiate fiind microARN (miARN), 2,3 au fost găsite într-o varietate de biofluide, 4,5 unde pot fi ambalate cu vezicule extracelulare (EV), 6 lipoproteine, 7 și alte complexe ribonucleoproteice. 3

Sistemul limfatic este o rețea organizată de țesut limfoid; transportă lichid tisular/celule limfatice și limfoide, 8 și diferite afecțiuni patologice, cum ar fi inflamația, cancerul și infecția, pot provoca modificări ale funcției limfatice. 9 Limfa mezenterică (ML) se scurge continuu din intestin și reintră în circulație la vena subclaviană chiar înainte de inimă și plămâni. ML urmează o cale anatomică directă între intestin și fluxul sanguin periferic fără a trece prin ficat. În sănătate, ML este esențial în homeostazia fluidelor și absorbția lipidelor din dietă. Lipoproteinele bogate în trigliceride (TRL) sunt lipoproteinele majore din ML care transportă lipidele intestinale în sânge. În boală, ML apare ca un factor important10 și a fost implicat în dezvoltarea sindromului disfuncției organelor multiple în boala critică. 10 Deși miARN-urile au fost detectate în pancreatita ML a modelului de rozătoare și pacienții care utilizează abordări microarray, alți 11 ARN extracelulari sau alte tipuri de boli critice sunt încă de studiat.

Aici, am examinat micile profiluri de ARN ale plasmei și ML colectate de la diferite modele de rozătoare ale bolilor critice [pancreatită acută, legare și incizie cecală (CLI), ischemie-reperfuzie intestinală (IR)] pentru prima dată utilizând secvențierea Ion Torrent.

Materiale și metode

Consultați Date suplimentare pentru detalii complete. Pe scurt, pancreatita acută, CLI și IR intestinale au fost induse la șobolanii masculi adulți Sprague-Dawley. Șobolanii de control Sham au suferit aceeași intervenție, dar fără inducerea bolii. Pentru modelele de drenaj, conducta ML superioară a fost canulată pentru a colecta ML continuu pe gheață timp de 5 ore de la șobolani. O probă de plasmă periferică a fost colectată de la toți șobolanii studiați la un moment dat la finalizarea colectării limfei de 5 ore. Pentru CLI și Gut IR, fracțiile îmbogățite cu EV și TRL au fost izolate din ML (ML-EV; ML-TRL) utilizând soluția de precipitare exosomică Macherey-Nagel și respectiv ultracentrifugarea diferențială. Secvențierea ARN-ului mic a fost efectuată pe ARN extras din probe de plasmă grupate (N = 3), MLN = 3), ML-EVN = 4) și ML-TRLN = 5) pe platforma Ion Torrent Personal Genome Machine. Secvențele de ARN au fost filtrate și căutate utilizând Instrumentul de căutare a alinierii locale de bază (BLAST) împotriva diferitelor baze de date, inclusiv genomul șobolanului și bazele de date RefSeq, miARN, ARNm genomic, ARN funcțional și Genbank. Secvențele de ARN au fost clasificate, iar numărul de citiri au fost analizate.

Rezultate si discutii

Au existat diferențe distincte în profilurile ARN între ML și plasmă. Recent, diferențele în compoziția mică de ARN între 12 biofluide umane au fost caracterizate de Godoy și colab., 5 dar ML nu a fost investigat. ML conținea mai mult ARN pe volum decât plasma, atât cu intrarea totală, cât și cu numărul de citiri potrivite cu BLAST fiind> de 20 de ori mai mare (Fig. 1A; Tabel suplimentar S1). Deși> 90% din citirile utilizabile atât în ​​ML cât și în plasmă au fost identificate ca fiind de origine „șobolan”, subtipurile lor de ARN au apărut în proporții diferite (Fig. 1B). Cea mai notabilă diferență a fost în proporția de ARNt:> 90% au apărut în ML față de ~ 45% în plasmă pentru șobolanii Sham, majoritatea fiind jumătăți de ARNt (~ 32 nt; jumătate din ARNt de lungime completă). Dintre diferitele jumătăți de ARNt, cea mai abundentă jumătate de ARNt detectată în acest studiu a fost una derivată din capătul 5 ′ al Gly-GCC (ARNt cu anticodon GCC recunoaște codonul GCC, care codifică glicina): media 48% din ARNt total de șobolan în ML și 69% în plasma șobolanilor Sham (Fig. 1C). Suprareprezentarea fragmentelor de ARNt ar putea fi un artefact al metodelor convenționale de secvențiere a ARN-ului, 12-14, dar alte studii 15,16 au arătat că diferite condiții de stres pot induce scindarea ARNt, iar aceste fragmente de ARNt servesc ca ARN-uri mici care interferează, care reglementează activitatea. factorului de traducere.

extracelular

FIG. 1. Profiluri ARN extracelulare de plasmă, ML, ML-TRL și ML-EV în modelele de rozătoare ale bolilor critice. Au fost comparate modelele de rozătoare ale AP, CLI și Gut IR și controalele lor Sham. Pentru AP și CLI, au fost comparate, de asemenea, profilurile de ARN plasmatic, modelele ML ND și D. (A) Numărul total de citiri potrivite; (B) diferite subtipuri de ARN identificate ca „șobolan” citesc; (C) tipurile de ARNt din „șobolan” citesc; (D) atribuirea regatului pentru „non-șobolan” citește în fiecare eșantion. AP, pancreatită acută; CLI, Cecal Ligation and Incision; IR, Ischemia-Reperfusion; ND, nedrenaj; D, drenaj; ML, limfă mezenterică; TRL, lipoproteine ​​bogate în trigliceride; EV, vezicula extracelulară.

Spre deosebire de ARNt, plasma conținea o proporție mai mare de miARN, fragmente de ARNr și ARN Y decât ML (Fig. 1B). Dintre primii 10 miARN maturi identificați (tabelul suplimentar S2), cei mai predominanți în plasmă și ML au fost miR-451-5p și respectiv miR-145-5p; întrucât miR-16-5p a fost abundent în toate probele de plasmă și ML. miR-143-3p și miR-3473 au fost foarte abundente în ML, dar foarte scăzute în plasmă. miR-143/miR-145 sunt miARN co-transcrise care au expresie îmbogățită în mezenchimul intestinal și se demonstrează că au un rol în repararea plăgii intestinale, 17 și miR-3473 au avut o expresie crescută în celulele epiteliale intestinale mari inflamate la un șoarece model de colită, 18 confirmând astfel că ML poartă miARN de origine intestinală.

Comparația dintre ML, ML-TRL și ML-EV de la controalele Sham a detectat diferențe în profilurile ARN între diferite compartimente ML. jumătăți de ARNt, care au ocupat> 90% din totalul citirilor de șobolani în ML nefracționat, au fost prezente ca doar 1% din citirile ML-EV (Fig. 1B). În schimb, ML-EV a fost extrem de îmbogățit cu miARN (76% din totalul citirilor șobolanilor), din care 30% au fost fragmente scurte (medie 17 nt) din miARN maturi adnotate (medie 22 nt) (Fig. 1B). ML-EV conținea, de asemenea, o proporție mai mare de citiri potrivite cu ARNr și genom decât ML nefracționat (Fig. 1B). În comparație cu ML-EV, Sham ML-TRL conținea mai puține miARN (2,4% din totalul citirilor de șobolan) și fragmentele acestora (2%), dar mai multe jumătăți de tARN (51%) (Fig. 1B). Cu toate acestea, eșantioanele ML-TRL generale conțineau cantități absolute scăzute de ARN, sugerând că TRL-urile nu sunt un purtător principal de ARN în ML.

ML și fracțiunile sale îmbogățite cu TRL și EV au prezentat, de asemenea, diferențe în conținutul lor de miARN (Tabelul suplimentar S2). miR-222 19 și miR-150 19.20 identificate anterior în EV au fost îmbogățite atât în ​​ML-TRL, cât și în ML-EV în comparație cu ML nefracționat, în timp ce miR-145-5p a fost constant abundent în toate probele derivate din ML. miR-3473, găsit a fi îmbogățit în ML nefracționat, a fost clasat fie # 1, fie # 2 în probele ML-TRL, dar scăzut în ML-EV. miR-125a-5p care are un rol în soarta 21 a celulelor epiteliale intestinale a fost îmbogățit distinct în ML-EV. De interes, cel mai abundent fragment de miARN atât în ​​ML-TRL cât și în ML-EV a fost asociat antisens cu miR-222-3p și facem ipoteza că acesta poate reprezenta un nou miARN și/sau poate avea un rol de legare și inhibare a funcției miR -222-3p.

În cele din urmă, am comparat profilurile de ARN ale modelelor de boală critică. Nu a existat nicio diferență substanțială în profilurile de ARN atât ale plasmei, cât și ale ML între pancreatita acută și Sham-ul respectiv (Fig. 1B), dar am putut detecta abundența crescută a miR-217-5p (112 vs. 0 lecturi pe milion), miR -375-3p (12 vs. 0), miR-122-5p (99 vs. 29) și miR-148a (126 vs. 43) în ML de pancreatită acută decât Sham-ul său, confirmând descoperirile anterioare ale miARN de Blenkiron et. al. În schimb, am detectat mai multe modificări ale profilurilor ARN pentru CLI și Gut IR comparativ cu Sham. În CLI, a existat o creștere substanțială a citirilor de ~ 32 nt în plasmă, indiferent de starea de drenaj ML (Fig. 2A), iar acest lucru a fost corelat bine cu creșterea jumătăților ARNt (Fig. 1B). În special, jumătățile de ARNt Gly-GCC s-au dovedit a fi mai abundente în plasma CLI decât plasma Sham (614.868 față de 267.526 citiri pe milion). Jumătățile de ARNt Gly-GCC s-au dovedit anterior să crească în ischemie și au inhibat funcția celulelor endoteliale, a fost raportată biogeneza specifică de tip 22 și ARNt și/sau eliberarea de jumătăți de 5 ’ARNt 23, dar câmpul biologiei fragmentului ARNt rămâne o nouă zonă interesantă de cercetare și justifică studii suplimentare.

FIG. 2. Comparația profilului de dimensiune al ARN citește între Sham, CLI și Gut IR (A) în plasma modelelor ND și D; (B) în ML, ML-TRL și ML-EV.

Profilurile de dimensiune ale lungimii citite ale ML nu au fost substanțial diferite între Sham, CLI și Gut IR (Fig. 2B), iar majoritatea ARN-ului au fost în mod constant potrivite cu jumătățile de tARN (Fig. 1B). Cu toate acestea, profilurile de dimensiune ale ARN-ului ML-TRL și ML-EV au diferit între Sham, CLI și Gut IR (Fig. 2B). Rezultatele potrivite cu BLAST au arătat modificări ale profilului ARN mai distincte în CLI decât Gut IR, comparativ cu Sham (Fig. 1B, C). În toate eșantioanele derivate din ML (ML, ML-TRL și ML-EV), citirile scurte potrivite cu% rRNA au fost în mod constant cele mai mari în CLI, mai mici în Gut IR și cele mai mici în Sham (Fig. 1B). Studiile anterioare 24,25 au considerat citirile scurte care corespund ARNr ca produse degradate și le-au exclus de la analize ulterioare. Acest lucru este în contrast cu alte studii care au sugerat rolurile lor posibile ca qiRNA induse de leziuni ale ADN-ului, 26 de ARN-uri mici de ghidare, 27 sau diARN-uri; 28, precum și a propus interacțiunea lor cu factorii de traducere, 29 mRNA și analogii ARNt sau antibiotice. În plus, constatarea noastră poate susține un rol potențial al ARN-urilor mici derivate din ARNr în procesele de boală critică, așa cum se observă în diabet. 31 ARNm mici merită acum investigații suplimentare pentru aceste roluri patologice.

Cealaltă observație interesantă a fost detectarea secvențelor bacteriene în CLI (Fig. 1D; Tabelul suplimentar S3). În general, 59% din totalul secvențelor „non-șobolani” din CLI ML s-au potrivit bacteriilor, 6% în ML-EV și 9% în plasma modelului de drenaj non-ML, care s-a redus la 5% în plasma ML model de drenaj. În schimb, niveluri minime de secvențe bacteriene (0% -1,3%) au fost detectate în toate probele din alte modele de boală. Căutările BLAST au arătat că 61% din secvențele bacteriene găsite în CLI ML se potrivesc cu Enterobacteriaceae familie; o componentă normală a microbiotei intestinale la șobolani, dar care reprezintă doar 9% din abundența tipică. 32 Dominația Enterobacteriaceae în CLI ML sugerează transferul preferențial al ARN-urilor acestei taxe din fecalele intraperitoneale (dispersate în abdomen ca parte a inducției CLI) în canalele limfatice viscerale ale peritoneului. Prevenirea transferului de ARN bacterian de la ML la circulația sistemică poate reprezenta o metodă de reducere a severității bolii.

Concluzie

Acesta este primul studiu care a raportat profilurile distincte, dar diverse de ARN ale ML și compartimentele sale (TRL și EV) și profilurile lor diferite în cazul bolilor critice. Rezultatele noastre arată transportul de ARN-uri intestinale mici în toate ML, îmbogățirea miARN-urilor în ML-EV și prezența ARN-ului bacterian în CLI ML. Acești ARN-uri derivate intestinale pot avea un rol direct în stările de boală, adăugând o nouă perspectivă la ML ca axă potențială de semnalizare intestinală și sursă de biomarker, în fiziopatologia bolii critice.

Mulțumiri

Autorii vor să mulțumească prof. Cristin Print pentru sfaturile sale cu privire la analiza bioinformatică, și Liam Williams și Tim Lawrence în Centrul Genomic, Universitatea din Auckland (împreună cu New Zealand Genomics Ltd.) pentru serviciile lor de secvențiere. Finanțare: Această lucrare a fost susținută de Fondul de cercetare pentru cercetarea facultății și Fondul de cercetare bazat pe performanță de la Universitatea din Auckland, Grantul proiectului Auckland Medical Research Foundation, Grantul Maurice și Phyllis Paykel Trust, și Consiliul de cercetare în domeniul sănătății din Noua Zeelandă Grant de proiect. J.H. a fost finanțat de Hugo Charitable Trust.

Disponibilitatea datelor

Fișierele de date brute sunt disponibile din Arhiva de citire a secvenței NCBI (SRP114999).

Contribuțiile autorilor

J.H. și C.B. a participat la proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, interpretarea datelor și pregătirea articolelor. P.T. a participat la colectarea și analiza datelor, interpretarea datelor și pregătirea articolelor. R.P., S.N., S.M.T. și A.P. a participat la chirurgia șobolanilor, colectarea probelor și pregătirea articolelor. A.R.P., A.J.H. și J.A.W. a participat la proiectarea studiilor, pregătirea articolelor și supravegherea editorială.

Declarația de divulgare a autorului

Nu există interese financiare concurente.

Material suplimentar

Referințe

  • 1. Freedman JE, Gerstein M, Mick E, Rozowsky J, Levy D, Kitchen R, Das S, Shah R, Danielson K, Beaulieu L, Navarro FC, Wang Y, Galeev TR, Holman A, Kwong RY, Murthy V, Tanriverdi SE, Koupenova-Zamor M, Mikhalev E, Tanriverdi K. Diverse ARN extracelulare umane sunt detectate pe scară largă în plasma umană . Nat Commun 2016; 7: 11106. Crossref, Medline, Google Scholar
  • 2. Mitchell PS, Parkin RK, Kroh EM, Fritz BR, Wyman SK, Pogosova-Agadjanyan EL, Peterson A, Noteboom J, O'Briant KC, Allen A, Lin DW, Urban N, Drescher CW, Knudsen BS, Stirewalt DL, Gentleman R, Vessella RL, Nelson PS, Martin DB, Tewari M. MicroARN-urile circulante ca markeri stabili pe bază de sânge pentru depistarea cancerului . Proc Natl Acad Sci U S A 2008; 105: 10513-10518. Crossref, Medline, Google Scholar
  • 3. Boon RA, Vickers KC. Transportul intercelular al microARN-urilor . Arterioscler Thromb Vasc Biol 2013; 33: 186–192. Crossref, Medline, Google Scholar
  • 4. Weber JA, Baxter DH, Zhang S, Huang DY, Huang KH, Lee MJ, Galas DJ, Wang K. Spectrul microARN în 12 fluide corporale . Clin Chem 2010; 56: 1733–1741. Crossref, Medline, Google Scholar
  • 5. Godoy PM, Bhakta NR, Barczak AJ, Cakmak H, Fisher S, MacKenzie TC, Patel T, Price RW, Smith JF, Woodruff PG, Erle DJ. Diferențe mari în compoziția mică de ARN între biofluidele umane . Rep. Celulei 2018; 25: 1346–1358. Crossref, Medline, Google Scholar
  • 6. Kim KM, Abdelmohsen K, Mustapic M, Kapogiannis D, Gorospe M. ARN în veziculele extracelulare . Wiley Interdiscip Rev ARN 2017; 8. DOI: