Investigarea rolurilor, metodologie, scriere - versiunea originală

aminoacizi

Afiliere Știința plantelor moleculare/Biochimia plantelor, Universitatea din Wuppertal, Wuppertal, Germania

Afiliație Institutul de Stat Apicultural, Universitatea din Hohenheim, Stuttgart, Germania

Roluri Conceptualizare, achiziție de finanțare

Afiliație Institutul Apicultural de Stat, Universitatea din Hohenheim, Stuttgart, Germania

Roluri Conceptualizare, achiziție de fonduri, supraveghere, scriere - proiect original

Afiliere Știința plantelor moleculare/Biochimia plantelor, Universitatea din Wuppertal, Wuppertal, Germania

  • Basel Shaaban,
  • Victoria Seeburger,
  • Annette Schroeder,
  • Gertrud Lohaus

Cifre

Abstract

Citare: Shaaban B, Seeburger V, Schroeder A, Lohaus G (2020) Profilarea zahărului, a aminoacizilor și a ionilor anorganici a mierii de la diferite specii de hemipteri care se hrănesc cu Abies alba și Picea abies. PLoS ONE 15 (1): e0228171. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0228171

Editor: Daniel Doucet, Resurse naturale Canada, CANADA

Primit: 17 iulie 2019; Admis: 8 ianuarie 2020; Publicat: 24 ianuarie 2020

Disponibilitatea datelor: Toate datele relevante se află în manuscris și în fișierele sale de informații suport.

Finanțarea: Proiectul este susținut de fonduri ale Ministerului Federal al Alimentației și Agriculturii (BMEL) pe baza deciziei Parlamentului Republicii Federale Germania prin intermediul Oficiului Federal pentru Agricultură și Alimentație (BLE) în cadrul programului de sprijinire a inovației către G.L. si ca. Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului. Nu s-au primit finanțări externe suplimentare pentru acest studiu.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Multe insecte din ordinul Hemipterelor, inclusiv majoritatea afidelor și coccidelor, se hrănesc cu seva floema plantelor lor gazdă respective [1]. Sema floema este în general dominată de zaharoză, cu concentrații cuprinse între 0,7 și 1,5 M [2,3,4]. Unele specii de plante translocează, de asemenea, zaharoză oligozaharide din familia rafinozei, cum ar fi membrii Oleaceae, sau alcooli de zahăr, cum ar fi membrii Rosaceae [5,6].

Seta floema conține, de asemenea, aminoacizi cu o concentrație de 50 până la 200 mM. La mai multe specii de plante, în special GLU, GLN, ASP și ASN sunt aminoacizi dominanți [3,4,7,8]. Pentru mai multe insecte, nouă aminoacizi sunt esențiali (HIS, ILE, LEU, LYS, MET, PHE, THR, TRP, VAL) [1]. Deși toți aminoacizii s-au găsit în seva floemului [3,9], nu este o dietă ideală pentru insecte datorită presiunii sale osmotice ridicate, raportului scăzut de aminoacizi în comparație cu zaharurile și raportul dintre esențial și non -aminoacid esențial, care este mai scăzut în seva floemică decât în ​​proteina insectelor [1]. Prin urmare, hrănitorii cu floem ingerează zaharuri floem în cantități care depășesc necesarul de carbon pentru a-și îndeplini nevoia metabolică, iar concentrațiile ridicate de zaharuri în compoziție modificată sunt consumate ca miere [10,11].

Honeydew este compus în principal din zaharuri, dar conține și ioni anorganici, aminoacizi, proteine ​​și alți compuși [12,13,14,15]. Compoziția mierii variază între diferite specii de insecte; poate fi, de asemenea, influențat de diferite specii de plante gazdă, de modificări sezoniere sau de condiții de mediu diferite [9,16,17]. În plus, compoziția mierii poate fi influențată de variația interacțiunii ant-afide [18]. Mai mult, există o variație considerabilă a compoziției în cadrul probelor dintr-o anumită specie de afide [18].

Diferite monozaharide (glucoză, fructoză), dizaharide (de exemplu zaharoză, trehaloză, maltoză) și trizaharide (de exemplu melezitoză, erloză, rafinoză) au fost găsite în mierea de miere [15,17,19,20], dar nu și în floema seve a mai multor specii de arbori, unde a fost prezentă doar zaharoza [2,21]. La salcie, de exemplu, zaharoza a fost singurul zahăr găsit în seva floemului, în timp ce mierea unui afid de salcie (Tuberolachnus salignus) conținea diferite mono-, di- și trizaharide [21]. Mai mult, s-au observat variații mari ale compoziției zahărului în mierea de miere a trei specii de afide care se hrănesc cu aceeași specie de arbori (Populus tremula) [18].

Pentru reglarea osmotică a insectelor care alimentează floemele, este important ca acestea să formeze oligozaharide din zaharoza ingerată cu seva floemului [10,22,23]. O relație pozitivă între concentrația zaharozei dietetice și conținutul de oligozaharide din mierea de miere a fost arătată pentru diferite specii de afide [10,22,23]. Oligozaharidele sunt probabil sintetizate de mai multe enzime din intestinul afidelor [10,24,25].

Bacteriile asociate pot fi, de asemenea, implicate în metabolismul nutrienților la insecte [1]. Una dintre cele mai bine studiate simbioze de acest tip sunt simbiozele lui Buchner și afide, unde microorganismele sunt implicate în furnizarea de aminoacizi esențiali pentru afide [26,27,28,29]. În cazul oligozaharidelor, afidele mai degrabă decât microbiota asociată mediază sinteza acestor zaharuri [10].

Scopul acestui studiu a fost determinarea proporțiilor melezitozei și a altor zaharuri, precum și a aminoacizilor și a ionilor suplimentari din mierea de miere a diferitelor specii de hemipteri pentru a examina dacă compozițiile de mierea de miere diferă între speciile de hemipter și/sau între speciile de conifere. Prin urmare, am colectat picături de miere direct de la două specii de Coccidae (Physokermes piceae și Physokermes hemicryphus) și de la două specii de Lachninae (Cinara pilicornis și Cinara piceae) situate pe molid (Picea abies (L.) H. Kast.) Și, de asemenea, de la două Lachninae specii (Cinara pectinatae și Cinara confinis) situate pe brad (Abies alba Mill.). Speciile de hemipter analizate sunt producători importanți de mieră pe conifere din Germania și alte țări din Europa Centrală [30]. Am determinat zaharurile, aminoacizii și ionii anorganici din mierea și am examinat formarea oligozaharidelor în diferite specii Cinara. Rezultatele au fost comparate cu proporțiile corespunzătoare ale diferiților compuși din exudatele floemelor din speciile de arbori.

Material si metode

Specii de plante, specii de hemipter și colecția de mieră

Colecție de exsudate de floem

Exsudatul de floare de scoarță de la A. alba și P. abies a fost colectat paralel cu eșantionarea mierii din mai până în iulie 2016 și, de asemenea, 2017 la jumătatea zilei (între orele 11:00 și 15:00). Pentru fiecare specie de arbore, au fost preparate șase probe de exsudat de floem. Conform metodei Hijaz și Killiny [36], bucăți de scoarță de aproximativ 2 cm lungime au fost plasate într-un tub de plastic de 0,5 ml cu o gaură mică în partea de jos. Acest tub a fost plasat într-un tub de plastic de 2 ml. Probele au fost apoi centrifugate la 5000 rpm timp de 20 minute la 4 ° C. Acest exsudat constă în principal din seva floemică, dar pot exista și cantități mici de xilem și alte seve celulare de pe suprafața plăgii în timpul procesului de tăiere. Probele au fost depozitate la -80 ° C până la analiză.

Declarație de etică

Conform liniilor directoare ale instituțiilor autorilor, precum și reglementărilor naționale aplicabile, nu a fost necesară sau obținută nicio aprobare de etică pentru prezentul studiu. Acest studiu a fost realizat în standuri de molid (P. abies) sau brad (A. alba) din Baden-Wuerttemberg (Germania). Nu au fost necesare permisiuni specifice pentru aceste locații. Am colectat mieră de la afide și insecte solzi, precum și materiale de P. abies și A. alba. Nici insectele, nici plantele nu sunt protejate de legea germană și nici o specie pe cale de dispariție sau protejată nu a fost implicată în acest studiu.

Analize HPLC ale zaharurilor, aminoacizilor și ionilor anorganici

Zaharurile, aminoacizii și ionii anorganici au fost analizați prin diferite sisteme HPLC. Exsudatele de miere și floem au fost măsurate direct. Standardele de zahăr (0-500 μM), standardele de aminoacizi (0-20 μM) și standardele pentru ionii anorganici (0-1000 μM) au fost măsurate în paralel. A fost creată o curbă de calibrare pentru fiecare zahăr, aminoacid sau ion anorganic. Zonele de vârf din cromatogramele măsurate au fost evaluate cu un program de integrare (Chromeleon 7.2, Dionex Corp, Sunnyvale, CA, Statele Unite). Concentrațiile de zaharuri, aminoacizi sau ioni anorganici au fost determinate cu ajutorul curbelor de calibrare pentru fiecare dintre diferitele substanțe. Pentru a face comparabile rezultatele diferitelor specii de hemipter sau de origine biologică (miere sau exsudat de floem), s-a calculat proporția fiecărui zahăr, aminoacid sau ioni din zahărul total, precum și concentrația de aminoacizi sau ioni.

Analize zahăr.

Zaharurile din exsudatele de mierea și coaja au fost analizate conform Lohaus și Schwerdtfeger [8]. Prin urmare, au fost utilizate o coloană de schimb de anioni și o detectare amperometrică a pulsului. Standardele (glucoză, fructoză, zaharoză, trehaloză, melibioză, maltoză, izomaltoză, maltoză, izomaltuloză, melezitoză, erloză, rafinoză, 1-kestoză, izomaltotrioză, maltotrioză, nidroză, stachioză) au fost măsurate în paralel. Identificarea fiecărui zahăr s-a bazat pe compararea timpului de reținere a diferitelor vârfuri cu cel al standardelor. Mai mult, rezultatele obținute au fost verificate în mod regulat cu metoda standard de adăugare. Coeluția zaharurilor din probe cu standarde cunoscute ne-a confirmat ipoteza. Oligozaharidele cu lanț lung (gradul de polimerizare (DP) ≥ 5) au fost analizate cu același sistem, cu diferența că coloana schimbătoare de anioni a fost eluată izocratic cu NaOH 200 mM în loc de NaOH 80 mM [37]. Pentru indisponibilitatea standardelor superioare de oligozaharide, oligozaharidele cu lanț lung au fost cuantificate în raport cu standardul verbascoză (DP5) și prezentate ca echivalenți verbascozici.

Analize de aminoacizi.

Analiza aminoacizilor liberi a fost efectuată în conformitate cu Göttlinger și colab. [38]. Aminoacizii cu o grupare amino primară au fost prelucrați prin derivatizarea precolumnului cu o-ftaldialdehidă, aminoacizii cu o grupare amino secundară (de exemplu prolină) cu fluorenilmetiloxicarbonil. Derivații au fost detectați prin fluorescență.

Analize ale ionilor anorganici.

Anionii și cationii au fost analizați separat conform lui Göttlinger și colab. [38]. Ionii au fost detectați prin conductivitatea lor electronică.

Activitatea enzimatică în omogenia întregului corp a afidelor

Activitățile enzimatice au fost analizate la C. pectinatae care se hrănesc cu A. alba și C. pilicornis care se hrănesc cu P. abies. Aproximativ cinci indivizi C. pectinatae și aproximativ zece indivizi C. pilicornis au fost colectați de la planta gazdă folosind o pensulă. După colectare, au fost omogenizați într-un tub de plastic răcit cu ajutorul unui pistil. S-au adăugat 300 μL soluție de zaharoză (10%, pH 7) la 20 mg omogenat de afide și s-au incubat la 30 ° C. După 0, 30, 60 și 120 de minute, s-au luat alicote (50 μL) și s-au adăugat 50 μL NaOH (200 mM) pentru a inactiva orice enzime sau activitate microbiană. Soluția a fost apoi centrifugată (13.000 xg, 30 sec) și supernatantele au fost luate pentru analiza zahărului prin HPLC (așa cum s-a descris mai sus). Experimentul a fost efectuat de cel puțin trei ori pentru fiecare specie de afide.

Analize statistice

Datele privind zahărul, aminoacizii sau proporțiile ionilor din mierea de miere sunt prezentate ca mijloace (± SD). Mijloacele fiecăruia dintre zaharuri, aminoacizi sau ioni din mierea celor șase specii de hemipter au fost comparate separat pentru a verifica diferențele semnificative. Asimetria și curtoza au fost calculate pentru a surprinde distribuția setului de date; s-a presupus distribuția normală dacă valorile de asimetrie au fost mai mici de 2 și valorile kurtozei au fost mai mici de 7 [39]. Mai mult, testele lui Levene au fost aplicate pentru a testa omogenitatea variațiilor pentru datele fiecărui metabolit sau ion. Când datele s-au conformat ipotezei de normalitate, dar au eșuat în ceea ce privește omogenitatea variațiilor, analiza varianței a fost efectuată utilizând testul Welch urmat de testul post-hoc (testul Games-Howell). Dacă s-au confirmat atât ipotezele de normalitate, cât și de omogenitate, s-a efectuat un ANOVA unidirecțional. Ulterior, s-au efectuat teste post-hoc (HSD-ul lui Tukey) (valoarea p ≤ 0,05).

Pentru activitățile enzimatice la speciile Cinara s-a efectuat un test nonparametric (Mann Whitney U) pentru a testa diferențe semnificative în valorile medii.

Pentru a efectua o scalare multidimensională nemetrică (NMDS) pentru proporțiile de zahăr, aminoacizi și ioni din probele de miere pentru toate speciile de hemipterane, datele au fost reconstruite în matrici de similaritate folosind distanța euclidiană [40]. Acestea au fost analizate cu ajutorul trombocitelor NMDS. Potrivirea ordonării în comparație cu clasamentul eșantionului original a fost evaluată utilizând funcția de stres. Ordonarea reprezintă datele atunci când valoarea solicitării este mai mică de 0,2 [41]. Analiza a fost efectuată folosind pachetul ‘Vegan’ cu rutina metaMDS a programului „R” [42].

Analiza permutațională multivariată a varianței (PERMANOVA, [43]) a fost efectuată pentru a identifica importanța relativă a variabilelor specii de hemipter și specii de arbori asupra compoziției mierii. Mai mult, Analiza permutațională a dispersiilor multivariate (PERMDISP, [44]) a fost efectuată pentru a testa omogenitatea dispersiilor multivariate și pentru a distinge între efectele de localizare și dispersie în cazul valorilor PERMANOVA semnificative. Ambele analize se bazează pe măsurători de distanță euclidiene, au fost efectuate folosind pachetul ‘Vegan’ cu rutina betadisper pentru PERMDISP și rutina adonis pentru PERMANOVA a programului „R”. Pentru PERMANOVA s-au aplicat 999 permutări.

Toate analizele statistice au fost efectuate folosind R (versiunea 3.5.1, www.r-project.org) și SPSS (versiunea 24.0, IBM, Cooperare).

Rezultate

Zaharuri, aminoacizi și ioni anorganici din mierea de miere

Miere, produsă de C. pectinatae și C. confinis pe A. alba și de C. piceae, C. pilicornis, P. piceae și P. hemicryphus localizate pe P. abies au fost analizate pentru zaharuri, aminoacizi și ioni anorganici. Monozaharidele glucoză și fructoză, precum și zaharoza dizaharidă, au fost găsite în toate probele (Tabelul 1). În general, proporția de fructoză a fost mai mare decât proporția de glucoză. Trizaharidele, melezitoza și erloza au reprezentat, de asemenea, componente majore ale mierii. Cu toate acestea, au existat diferențe semnificative între speciile de hemipter (Fig. 1). Mierea de albine, produsă de C. piceae localizată pe molid, a relevat cea mai mare proporție de melezitoză (medie ± SD; 48 ± 13%), urmată de C. pilicornis (medie ± SD; 36 ± 8%), în timp ce mierea de albine produsă de P. piceae și P. hemicryphus localizate pe molid și de speciile Lachninae C. pectinatae și C. confinis pe brad au prezentat proporții mult mai mici de melezitoză. O imagine inversă apare atunci când se analizează proporția de erloză: proporții mari de erloză s-au găsit în miere de C. pectinatae și C. confinis, mediu în P. piceae și P. hemicryphus și scăzut în C. pilicornis și C. piceae (Fig. 1).