Vincent Center for Reproductive Biology, Vincent OB/GYN Service, Massachusetts General Hospital/Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, SUA

Vincent Center for Reproductive Biology, Vincent OB/GYN Service, Massachusetts General Hospital/Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, SUA

Vincent Center for Reproductive Biology, Vincent OB/GYN Service, Massachusetts General Hospital/Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, SUA

Vincent Center for Reproductive Biology, Vincent OB/GYN Service, Massachusetts General Hospital/Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, SUA

Vincent Center for Reproductive Biology, Vincent OB/GYN Service, Massachusetts General Hospital/Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, SUA

Vincent Center for Reproductive Biology, Vincent OB/GYN Service, Massachusetts General Hospital/Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, SUA

Reutilizarea acestui articol este permisă în conformitate cu Actul Creative Commons, Atribuire 2 · 5, care nu permite exploatarea comercială.

rezumat

Introducere

Comparativ cu alte sisteme de organe, axa reproductivă feminină îmbătrânește extrem de devreme în viață, culminând cu încetarea funcției ovariene normale, care la oameni anunță apariția menopauzei la aproximativ 50 de ani (Richardson et al., 1987; Faddy et al., 1992). Un declin progresiv și în cele din urmă epuizarea rezervei foliculare care conține ovocite ovariene este principalul factor determinant al vârstei de debut a menopauzei (Richardson et al., 1987; Faddy et al., 1992; Tilly, 2001; Charleston et al., 2007; Hansen et al., 2008), o perioadă din viață asociată cu o pierdere a fertilității și apariția unui spectru divers de probleme de sănătate rezultate din absența funcției ovariene ciclice (Buckler, 2005). Mai mult, concomitent cu un număr redus de foliculi, calitatea restului de ovocite la femele scade în general odată cu înaintarea în vârstă, ducând la rate de succes extrem de slabe ale încercărilor de fertilitate naturală și asistată (Navot et al., 1991; van Kooij et al., 1996). Acest din urmă rezultat este o problemă din ce în ce mai problematică, din moment ce tot mai multe femei, în special în societățile occidentale, amână fertilitatea la vârste mai în vârstă (Ventura, 1989; Ventura et al., 2004; Hamilton et al., 2007).

Chiar dacă mai multe studii istorice au raportat un efect benefic al RC asupra performanței reproductive la rozătoare, există un grad mare de variație în modul în care au fost proiectate aceste experimente (de exemplu, vârsta la care a fost inițiată CR și durata CR, precum și severitatea CR în raport cu aportul caloric total în controalele alimentate cu AL) și în ce rezultate au fost evaluați diferiți anchetatori de-a lungul anilor. De o importanță deosebită, o mare parte din lucrările anterioare care au evaluat efectele RC asupra fertilității pe termen lung la femele au fost derivate din studii de RC inițiate la înțărcare, ceea ce complică interpretarea rezultatelor datorită unei întârzieri a creșterii postînțărcare până la vârsta adultă și întârziere în debutul maturizării sexuale (Merry & Holehan, 1979; Holehan & Merry, 1985; Gonzales et al., 2004). Aici, am investigat la șoareci femele efectele CR moderat inițiat la vârsta adultă asupra performanței reproductive cu vârsta și supraviețuirea descendenților.

Rezultate

Eficacitatea protocolului CR cu debut la adulți

Deoarece studiile anterioare efectuate la șoareci au arătat că un rezultat al RC este o rezervă crescută a foliculului ovarian mai târziu în viață (Nelson et al., 1985), am testat mai întâi eficacitatea protocolului CR cu debut la adulți prin evaluarea modificărilor numărului de ovocite. Analiza morfometrică a numărului de foliculi sănătoși (neatretici) în ovarele secționate în serie a șoarecilor în vârstă de 8 luni a indicat faptul că aproape de două ori mai mulți foliculi primordiali în repaus erau prezenți în ovarele femelelor CR (516 ± 32 per ovar; medie ± SEM, n = 5 șoareci) în comparație cu ovarele de vârstă - potrivite în mod continuu cu hrană AL (273 ± 69 per ovar; medie ± SEM, n = 6 șoareci) (Fig. 1). Acest efect al CR cu debut la adulți pare a fi independent de modificările ratelor de activare a creșterii foliculului primordial sau de maturarea precoce a foliculului, după cum este indicat de prezența unui număr comparabil de foliculi mici în creștere și de nicio modificare a raportului dintre repaus (primordial) și imatur total foliculi între grupurile experimentale (Fig. 1). Cu toate acestea, numărul de foliculi imreti atretici a fost redus la ovarele femeilor cu debut CR adulte (468 ± 158 per ovar; medie ± SEM, n = 5 șoareci) în comparație cu controalele alimentate cu AL în mod continuu (960 ± 112 per ovar; medie ± SEM, n = 6 șoareci).

rozătoare

Impactul restricției calorice cu debut la adulți (CR) asupra rezervei foliculului ovarian. Numărul de foliculi imaturi non-atretici și atretici per ovar continuu ad libitum (AL) șoareci femele CR sau femele la vârsta de 8 luni, după inițierea CR 4 luni mai devreme. Aceste date reprezintă media ± SEM a rezultatelor combinate din analiza a 5 șoareci (CR) sau 6 (alimentați cu AL), cu diferențe semnificative în valorile medii indicate.

Eficacitatea protocolului CR cu debut la adulți a fost, de asemenea, evaluată prin monitorizarea săptămânală a greutății corporale, care a arătat că, în timpul restricției CR, femeile cântăreau cu aproximativ 25% mai puțin decât controalele alimentate continuu cu vârsta - potrivite cu vârsta (Fig. 2). În special, diferența de greutate corporală observată la femeile CR a fost rapid inversată după reluarea hranei AL la vârsta de 15,5 luni (Fig. 2).

Efectul restricției calorice la debutul adulților (CR) asupra greutății corporale. Măsurători săptămânale ale greutății (medie ± SEM) continuă ad libitum (AL) alimentat și CR/CR - apoi - AL - șoareci femele hrănite între 10 și 23 de luni. Rețineți revenirea greutății corporale la șoarecii CR la nivelurile de control alimentate continuu cu AL în decurs de 2 săptămâni după reluarea alimentării cu AL la vârsta de 15,5 luni (CR - apoi - alimentate cu AL), evidențiată prin umbrire gri.

Momentul eșecului reproductiv natural la femelele alimentate continuu cu AL

Declin natural al fertilității continuu ad libitum (AL) a alimentat femelele de control cu ​​vârsta. (A - D) Fertilitatea femelelor alimentate continuu cu AL între 10 și 12,5 (A), 12,5 și 14 (B), 14 și 15,5 (C) și 15,5 și 17 (D) luni (M) (fiecare șoarece ) este reprezentat de un număr pe X-Axă). Se indică numărul total de descendenți livrați și care au supraviețuit pentru fiecare femeie care a rămas însărcinată. Crucile desemnează șoareci care au trebuit să fie eutanasiați din cauza complicațiilor severe de sănătate sau care au murit din cauze naturale în timpul perioadei de studiu.

CR cu debut la adulți prelungește funcția axei reproductive la femelele în vârstă

Reinițierea hrănirii cu AL a femelelor CR la vârsta de 15,5 luni, care corespunde unei perioade în care s-a pierdut fertilitatea naturală în martorii alimentați continuu cu AL (Fig. 3), a dus la o revenire rapidă a potențialului fertil în studiile de împerechere ulterioare. . Mai exact, între 15,5 și 17 luni, 50% dintre femeile hrănite cu CR - apoi - AL au realizat o sarcină cu nașterea descendenților (Fig. 4A), iar multe femele hrănite cu CR - apoi - AL au păstrat funcția reproductivă în mai multe vârste avansate (Fig. 4A - E). Mărimea așternuturilor, precum și ratele de supraviețuire a descendenților au fost, de asemenea, remarcabil de mari pentru mamele hrănite cu CR - apoi - AL la vârste înaintate. De exemplu, o femelă cu vârsta cuprinsă între 20 și 21,5 luni - apoi - AL - a hrănit 7 descendenți, dintre care 6 au supraviețuit și s-au dezvoltat fără nicio complicație aparentă (femela # 5, Fig. 4D). Două dintre femelele hrănite cu CR - pe atunci - au rămas fertile în ultimii 23 de ani; cu toate acestea, cei 5 descendenți total livrați de aceste femele nu au supraviețuit mai mult de câteva ore după naștere (datele nu sunt prezentate).

Performanța reproductivă a femeilor în vârstă cu restricție calorică (CR) după reinițierea ad libitum (AL) hrănire la vârsta de 15,5 luni. (A - E) Rezultatele fertilității sunt prezentate pentru fiecare control alimentat continuu cu AL (AL) sau CR - apoi - alimentat cu femelă AL între 15,5 și 17 (A), 17 și 18,5 (B), 18,5 și 20 (C), 20 și 21,5 (D) și 21,5 și 23 (E) luni (M) (fiecare mouse este reprezentat de un număr pe X‐Axis) se desfășoară în studii de împerechere paralele cu aceiași masculi rotiți aleatoriu printre cuști. Se indică numărul total de descendenți livrați și care au supraviețuit pentru fiecare femeie care a rămas însărcinată. Crucile desemnează șoareci care au trebuit să fie eutanasiați din cauza complicațiilor severe de sănătate sau care au murit din cauze naturale în timpul perioadei de studiu.

Fertilitatea, fecunditatea și supraviețuirea descendenților sunt toate îmbunătățite de CR cu debut la adulți

Datele prezentate în figurile 3 și 4 descriu rezultatele pentru fiecare șoarece, astfel încât performanța reproductivă a femelelor individuale pe parcursul perioadei de încercare de împerechere ar putea fi vizualizată. Cu toate acestea, după compilarea datelor individuale ale șoarecilor, efectele RC cu debut la adulți asupra performanței de reproducere a femeilor cu vârsta au fost și mai evidente. De exemplu, între 15,5 și 17 luni, 50% din femeile hrănite cu CR - apoi - AL au rămas fertile, în timp ce doar 12,5% dintre femeile martor alimentate continuu cu AL au realizat o sarcină în aceeași perioadă de timp (Fig. 5A). Mai mult, 50% din vârstele cuprinse între 17 și 18,5 luni, 40% dintre 18,5 și 21,5 luni și 30% dintre 21,5 și 23 luni CR - femeile hrănite cu AL au continuat să realizeze sarcini odată cu nașterea descendenților. La aceste vârste, toate femelele alimentate continuu cu AL erau complet infertile (Fig. 5A).

Restricția calorică la debutul adulților (CR) îmbunătățește fertilitatea, fecunditatea și ratele de supraviețuire a descendenților la femeile în vârstă. (A - D) Rezumatul potențialului fertil (A, exprimat ca procentul de femele din fiecare grup testat care au realizat o sarcină), descendenții totali livrați (B), fecunditatea (C, pui per litier; medie ± SEM) și ratele de supraviețuire a descendenților (D) în studiile de împerechere a femelelor de control alimentate în mod continuu cu AL (linii negre în A - C) și în femelele CR sau CR - apoi - alimentate cu AL (liniile roșii în A - C) la vârstele indicate. Femelelor CR cu debut la adulți li s-a permis să reia hrănirea AL la vârsta de 15,5 luni pentru restul perioadei de studiu, după cum se evidențiază prin umbrirea gri în panourile A - C. Rețineți rezultatele îmbunătățite în fiecare punct final analizat (A - D) pentru femeile CR la fiecare categorie de vârstă, odată ce alimentarea cu AL a fost reluată.

În plus, o parte dintre descendenții femele născuți între 15,5 și 21,5 luni - CR - apoi - femele hrănite cu AL au fost menținute până la vârsta de până la 12 săptămâni (n = 18), și toți au prezentat o creștere normală la maturitate, fără anomalii aparente, după cum a fost evaluat prin examinarea anatomică brută după eutanasie (datele nu sunt prezentate). Maturarea normală până la maturitate a fost indicată în continuare de potențialul fertil al descendenților feminini (n = 3) născuți între 20 și 21,5 luni - CR - apoi - AL - șoareci femele hrănite. După o singură încercare de împerechere la vârsta de 10 săptămâni, aceste femele au dat naștere la dimensiuni normale (un total de 19 descendenți din cele 3 femele) fără a se observa mortalitatea puilor (datele nu sunt prezentate).

Discuţie

Tendințele socio-economice din ultimele decenii au dus la faptul că mai multe femei din țările dezvoltate au ales să amâne fertilitatea la anii reproductivi ulteriori. În SUA, de exemplu, începând cu anii 1970, rata primelor nașteri pentru femeile cu vârste cuprinse între 30 și 34 de ani a crescut cu 375%. Rata primelor nașteri pentru femeile mai mari de 35 de ani este chiar mai mare, crescând în ultimele patru decenii și jumătate cu 500% sau mai mult pentru femeile cu vârste cuprinse între 35-39 și 40-44 ani (Ventura, 1989; Ventura et al., 2004; Hamilton et al., 2007). Poate chiar mai izbitor este faptul că Centrul Național pentru Statistici de Sănătate (NCHS) nu are înregistrări ale nașterilor vii pentru femeile cu vârsta cuprinsă între 45 și 49 de ani în anii 1970 (Ventura, 1989), în timp ce aproximativ 7000 de nașteri vii au fost documentate de către NCHS pentru mame în acest interval de vârstă în 2006 (Hamilton et al., 2007). În ciuda acestei tendințe în continuă creștere de a avea un prim copil mai târziu în viață, când fertilitatea pentru majoritatea femeilor este suboptimă și sarcinile de succes pot fi dificil de realizat chiar și cu ajutorul tehnologiilor moderne de reproducere asistată, în prezent nu există strategii pentru a întârzia declinul legat de vârstă în fertilitatea pe care majoritatea femeilor o experimentează la sfârșitul anilor 30 și începutul anilor 40.

În modelele de rozătoare, capacitatea consumului redus de alimente de a amâna infertilitatea legată de vârstă la femei a fost documentată de aproape un secol (Osborne et al., 1917; Minge et al., 1947; Visscher et al., 1952; Berg, 1960). Deși rezultatele colective ale acestor studii sunt promițătoare, este important să subliniem că în aceste studii anterioare protocolul CR a fost adesea sever și a fost inițiat la înțărcare. Astfel, întrucât creșterea și dezvoltarea normală postnatală au fost compromise, prelungirea duratei de viață fertile a femeilor rezultată din CR a fost atribuită unei reduceri a creșterii globale și a unui debut întârziat al maturizării sexuale normale (Ball et al., 1947). Cu toate acestea, această explicație nu a fost testată riguros. Având în vedere acest lucru, aici am testat la șoareci dacă eșecul legat de vârstă al axei reproductive feminine ar putea fi amânat de un protocol CR cu debut moderat la adulți, care sa dovedit recent că menține în mod eficient bunăstarea generală și crește durata de viață a rozătoarelor îmbătrânite (Turturro et al., 1999; Masoro, 2005). Din aceste experimente, s-au făcut mai multe observații importante.

Proceduri experimentale

Animale

Șoareci femele C57BL/6 Virgin au fost obținute de la Institutul Național de Îmbătrânire (NIA, Bethesda, MD, SUA). Șoareci masculi adulți de tip sălbatic C57BL/6 au fost obținuți de la Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, SUA). Toate zootehnia și procedurile experimentale au fost revizuite și aprobate de comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor din Spitalul General din Massachusetts.

Regimul de hrănire

Pentru aceste experimente, am folosit un protocol CR cu debut pentru adulți dezvoltat de NIA pentru studiul lor privind biomarkerii de îmbătrânire (Turturro et al., 1999), în care CR este inițiat la vârsta de 14 săptămâni cu restricție de 10%, a crescut la 25% restricție la 15 săptămâni și la 40% restricție la 16 săptămâni, unde se menține până la reluarea (dacă se dorește) a hranei AL la un moment dat mai târziu în viață (a se vedea http://www.nia.nih.gov/ResearchInformation/ScientificResources/AgedRodentColoniesHandbook/CaloricRestrictedColony.htm). Fiecare femelă a fost adăpostită individual într-o cușcă convențională (neventilată). Femelele CR au fost hrănite o dată pe zi între orele 06:00 și 09:00 cu 2,7 g (4,33 Kcal g -1) de dietă fortificată NIH - 31/NIA care oferă aceleași niveluri de micronutrienți ca și alimentele cu formulă deschisă standard NIH31 utilizat pentru hrana AL. Protocolul CR a fost continuat până când femelele au atins vârsta de 15,5 luni, moment în care femelelor CR anterioare li sa permis accesul AL la alimentele standard cu formulă deschisă NIH31. Apa a fost furnizată de AL pentru toate animalele în timpul perioadei de studiu. Șoarecii au fost cântăriți săptămânal pentru a asigura eficacitatea adecvată a regimului de hrănire.

Testarea fertilității

Studiile de împerechere au fost inițiate la vârsta de 10 luni pentru toți șoarecii. Pentru încercările de împerechere în timpul CR, un șoarece mascul de fertilitate dovedită a fost adăpostit peste noapte într-o cușcă cu o femelă și îndepărtat în dimineața următoare, astfel încât femela să poată fi hrănită cu rația alimentară. Femelele AL și CR au fost manipulate identic. La întoarcerea femelelor CR la hrana AL la vârsta de 15,5 luni, șoarecii masculi au fost lăsați cu femelele până când s-au observat semne evidente ale sarcinii și apoi au fost îndepărtați până la următoarea încercare de împerechere. Bărbații au fost rotiți aleatoriu printre cuști în timpul studiilor de împerechere. Numărul total de descendenți livrați pe pușcă și numărul de descendenți livrați care au fost viabile și au supraviețuit au fost înregistrate separat pentru fiecare sarcină. Puii care nu au supraviețuit au fost găsiți morți la naștere sau au murit la scurt timp după naștere. Toți descendenții viabili au fost lăsați să rămână cu barajul până la înțărcare (ziua 21 postpartum), moment în care descendenții au fost scoși din cuști pentru a permite o încercare de împerechere ulterioară cu barajul. Pentru toți descendenții care au supraviețuit, nu au fost observate complicații anatomice sau de sănătate evidente (datele nu sunt prezentate).

Numărul foliculului ovarian

Foliculii care conțin ovocite au fost punctați prin evaluare histomorfometrică așa cum s-a descris inițial (Jones & Krohn, 1961), cu ușoare modificări detaliate anterior (Tilly, 2003; Skaznik - Wikiel et al., 2007). Fiecare ovar a primit un cod numeric, astfel încât toate numărările să fie efectuate fără cunoștința identității probei. Diapozitivele au fost apoi decodificate și s-a calculat numărul total de foliculi imaturi sănătoși și atretici per ovar. Acuratețea și reproductibilitatea numărărilor au fost confirmate independent prin faptul că un observator diferit reevaluează numerele de foliculi în diapozitive selectate aleatoriu, fără cunoștințe despre identitatea eșantionului.

Prezentarea și analiza datelor

Graficele ilustrează rezultatele fiecărui șoarece individual sau datele combinate obținute din experimente replicate independent (medie ± SEM). După caz, datele combinate au fost analizate printr-o analiză unidirecțională a varianței, urmată de două cozi t‐Test pentru comparații statistice între valorile medii.

Mulțumiri

Această lucrare a fost susținută de un premiu MERIT de la Institutul Național pentru Îmbătrânire (R37 - AG012279), Fondul filantropic Rubin Shulsky, Fondul filantropic Henry și Vivian Rosenberg, Fundația Sea Breeze, Fundația JM și Fondurile de cercetare Vincent Memorial.