Md. Mahbubur Rahman

un centru de cercetare, KNOTUS Co. Ltd, Guri-Si, Gyeonggi-Do, Republica Coreea;

Myung-Jin Kim

un centru de cercetare, KNOTUS Co. Ltd, Guri-Si, Gyeonggi-Do, Republica Coreea;

b Colegiul de Medicină Veterinară și Institutul de Științe Veterinare, Universitatea Națională Kangwon, Chuncheon, Gangwon, Republica Coreea;

Jin-Hyoung Kim

un centru de cercetare, KNOTUS Co. Ltd, Guri-Si, Gyeonggi-Do, Republica Coreea;

Sok-Ho Kim

c Departamentul de Cercetare Biofood, Knotus Life Science Inc, Jeongeup, Republica Coreea;

Hyeon-Kyu Go

un centru de cercetare, KNOTUS Co. Ltd, Guri-Si, Gyeonggi-Do, Republica Coreea;

Mee-Hyang Kweon

d Centrul de cercetare, Phyto Corporation, Seul, Republica Coreea

Do-Hyung Kim

un centru de cercetare, KNOTUS Co. Ltd, Guri-Si, Gyeonggi-Do, Republica Coreea;

Abstract

Context:Sa demonstrat că Salicornia europaea (Amaranthaceae) (SE) reduce obezitatea, dar rămâne o problemă ca supliment alimentar datorită conținutului său ridicat de sare (25-35% NaCl).

Obiective: Acest studiu a investigat efectele anti-obezitate și mecanismul de acțiune al pulberii de SE desalinizate (DSP).

Materiale și metode: Șobolanii Sprague - Dawley (n = 50) au fost împărțiți într-un grup de control normal (NC), o dietă bogată în grăsimi (HFD) indusă de grupul de control al obezității (HFD) și grupuri HFD administrate concomitent DSP (250 și 500 mg/kg) sau extract de Garcinia cambogia (Clusiaceae) (GE, 200 mg/kg, control standard) pe cale orală în fiecare zi timp de 12 săptămâni.

Rezultate: Greutatea corporală a fost semnificativ redusă prin administrarea concomitentă de DSP (596,51 ± 19,84 kg, 4,60% și 562,08 ± 9,74 kg, respectiv 10,10%) și GE (576,00 ± 11,29 kg, 7,88%) față de grupul HFD (625,25 ± 14,02 kg) și a fost însoțită de scăderea masei grase abdominale și a nivelurilor serice de lipide, fără efecte asupra consumului de hrană. Pentru a găsi mecanismul care stă la baza efectelor anti-obezitate, acidul trans-ferulic (TFA) a fost identificat ca ingredient principal și a fost investigat dacă a atenuat adipogeneza în celulele 3T3L-1. TFA derivat din DSP a suprimat diferențierea adipocitelor și acumularea de lipide intracelulare. De asemenea, TFA a reglat în jos expresia genică legată de adipogeneză a proteinei 1 care leagă elementul de reglare a sterolului, receptorul γ activat cu proliferatorul peroxizomului, proteina α care leagă CCAAT/amplificator și acidul gras sintetaza.

Concluzii: Aceste descoperiri sugerează că DSP poate fi luat în considerare pentru a fi utilizat ca supliment alimentar intenționat de a controla obezitatea prin proprietățile sale anti-obezitate și antiadipogene.

Introducere

Obezitatea este asociată cu o serie de tulburări de sănătate, inclusiv dislipidemie, diabet, boli cardiovasculare, boli ale vezicii biliare, boli cerebro-vasculare, apnee obstructivă în somn, nereguli menstruale și anumite tipuri de cancer (Haslam și James 2005). Rezultă dintr-un dezechilibru între aportul și cheltuielile de energie, care poate duce la o creștere patologică a adipocitelor (Yuan și Piao 2011). Ratele de obezitate cresc rapid și ating niveluri alarmante în întreaga lume datorită obiceiurilor din stilurile de viață moderne, cum ar fi inactivitatea fizică, a sta pe scaune pentru a lucra, a se uita la televizor și a aportului caloric ridicat (Haslam și James 2005; Malik și colab. 2013; Abid și colab. 2016).

Adipogeneza și diferențierea adipocitelor sunt importante pentru obezitate și implică o secvență complexă de modificări în expresia genelor și stocarea lipidelor (Yuan și Piao 2011). Controlul adipogenizei sau obezității este esențial pentru prevenirea complicațiilor și îmbunătățirea stării de sănătate a pacienților obezi. În prezent, medicamentele disponibile pentru tratamentul obezității promit beneficii pe termen scurt, dar obezitatea revine la întreruperea tratamentului. Mai mult, aceste medicamente au o serie de efecte secundare. Astfel, eforturile recente pentru tratamentul complementar al obezității s-au concentrat pe alimentele funcționale și compușii lor bioactivi (Hasani-Ranjbar și colab. 2013; Ko și colab. 2015; Pichiah și Cha 2015; Abid și colab. 2016; Guo și colab. 2016 ).

Garcinia cambogia (Clusiaceae) este o plantă de plante hipolipidemică bine cunoscută și populară (Marquez și colab. 2012; Vasques și colab. 2014). Este ușor disponibil pe piețe ca supliment alimentar și conține acid hidroxicitric (HCA) ca ingredient activ. Acest studiu investighează efectele atenuante ale DSP asupra creșterii în greutate corporală și a adipozității viscerale (grăsimea abdominală totală, grăsimea abdominală viscerală și grăsimea abdominală subcutanată) într-un model de șobolan obez în comparație cu Garcinia cambogia. Pentru a determina mecanismul de bază implicat în efectul anti-obezitate, acidul trans-ferulic (TFA) a fost identificat prin analiza HPLC ca fiind componenta cea mai abundentă în DSP și s-a investigat, de asemenea, în luarea în considerare a faptului că TFA derivat din DSP ar putea atenua adipogenizarea și adipogenul -factori legați la 3T3L-1adipocite de șoarece.

Materiale și metode

Pregătirea puterii salicornice desalinizate (DSP) și analiza constituenților DSP prin HPLC

Frunze proaspete, ramuri și tulpini de SE (20,0 kg) au fost colectate de pe țărmul vestic al Coreei de Sud la sfârșitul lunii august 2015. Probele au fost verificate de Prof. Soon-Ae Yoo de la Departamentul de Biologie și Științe Medicale, Universitatea Pai Chai (Daejon, Coreea). Un specimen de voucher a fost depus într-un congelator situat în centrul de cercetare și dezvoltare al Phyto Corporation (Universitatea Națională din Seul, Coreea de Sud). Probele au fost curățate cu apă de la robinet și liofilizate cu ajutorul unui liofilizator (EYELA FDV-2200, Tokyo, Japonia). SE liofilizată a fost măcinată folosind un blender (EBR98045, Stockholm, Suedia), iar SE pulverizată (3,6 kg) a fost desalinizată prin extracția apei și centrifugată (Kim și colab. 2016).

Peleta obținută din centrifugare a fost liofilizată și măcinată într-o pulbere fină cu dimensiuni mai mici de 150 de ochiuri folosind o moară ultra-centrifugă (ZM200, Hann, Germania). DSP rezultat (2,4 kg) cuprindea 74,3% fibre dietetice, 9,1% proteine, 4,3% grăsimi și 0,71% sodiu (Tabelul 1). O analiză nutrițională a DSP a fost efectuată și certificată de către Korea Health Supplement Association (Bundang-gu, Gyeonggi-do, Republica Coreea). Pe scurt, conținutul total de carbohidrați a fost calculat ca suma anhidrosugarilor, care a fost determinată folosind metoda acidului fenol-sulfuric (Dubois și colab. 1956). Conținutul total de proteine ​​a fost determinat folosind metoda digestiei proteinelor/metoda micro-Kieldahl (Willis și colab. 1996), în timp ce conținutul de sodiu și conținutul total de fibre dietetice au fost analizate prin metode cuplate inductiv (ICP) și, respectiv, metode enzimatic-gravimetrice. Conținutul caloric și alte componente minore au fost determinate în conformitate cu metodele Asociației Chimiștilor Analitici Oficiali (AOAC) (Prosky și colab. 1985).

tabelul 1.

Compoziția chimică a pulberii desalinizate de Salicornia europaea (DSP).

Rezultatul analitic
Calorii224,89 Kcal/100g
Fibre dietetice74,27%
Proteine ​​brute9,13%
Grăsime brută4,36%
Frasin6,23%
Sodiu0,71%
ZaharidăND
Acizi grași saturați0,45%
Acid gras trans> 0,01%
ColesterolND

Prin compararea timpului de retenție HPLC și λ-maxima absorbției UV a compușilor fenolici autentici (Sigma Co), compusul major 1 a fost identificat ca acid trans-ferulic (TFA) (Figura 1 (A, B)). DSP-EW solubil în metanol (800 mg/ml) a fost purificat printr-o HPLC preparativă multiplă (LC-Forte, YMC, Kyoto, Japonia) echipată cu o coloană de preparare Triart C18 (20 × 250 mm, 5 μm, YMC, Kyoto, Japonia) și un eluant de gradient de MeOH și apă pentru a da TFA pur (DSP-EW-3, Compus 1, 128 mg) de RT: 19,5-21,2 min, și alți compuși de vârf minori au fost, de asemenea, identificați ca acid cafeic, p- acid cumaric și izorhamnetin-3-β-d-glucozidă (Figura 1 (C)). Pentru identificare suplimentară, greutatea moleculară a DSP-EW-3 purificat (Compusul 1) a fost determinată utilizând ESI-MS. DSP-EW-3 dizolvat în metanol a fost ionizat prin ionizare prin pulverizare (150 ± 2000 m/z) și spectrele ESI-MS au fost obținute pe un spectrometru de masă LC-ESI (Thermo Finnigan LTQ, software de calibru X, versiunea 2.1.0; Thermo Finnigan, San Jose, CA, SUA) cu moduri pozitive și negative.

exercită

Profiluri HPLC analitice și preparative ale pulberii de Salicornia europaea L. desalinizată (DSP). (A) Profil HPLC analitic al DSP-EW; (B) profilul analitic HPLC al acidului trans-ferulic autentic; (C) Profil HPLC preparativ multiplu al DSP-EW; (1) acid cafeic; (2) acid p-cumaric; (3) acid trans-ferulic; (4) izorhamnetin-3-β-D-glucozidă.

Rezultatele ESI-MS, m/z 195,2 [M + H] și m/z 193,4 [M-H], au arătat că greutatea moleculară a compusului 1, DSP-EW-3 a fost același cu cel al acidului trans-ferulic (MW, 194, C10H10O4) (Figura 2). Extract ușor disponibil Garcinia cambogia (GE) (Pure GARCINIA Cambogia ®, Fusion Diet Systems Inc., Sandy, UT) conținând 60% acid hidroxicitric (HCA) a fost utilizat ca control pozitiv (200 mg/kg). Au fost selectate doze mai mari de DSP simplu (250, 500 mg/kg) comparativ cu GE.

Spectrele ESI-MS ale DSP-EW-3 (compusul 1) (sus, pozitiv; jos, negativ).

Animale și design experimental

Șobolani masculi Sprague-Dawley albi (Orient Bio, Gapyeong, Gyeonggi-do, Coreea) au fost folosiți pentru acest studiu. Șobolanii au fost adăpostiți într-un mediu controlat cu o temperatură de 23 ± 2 ° C și o umiditate de 50 ± 5% cu un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore. Hrana și apa erau disponibile ad libitum înainte de a începe experimentul. După o săptămână de hrănire adaptivă, greutatea corporală medie a fost de 222 ± 2 g. Obezitatea a fost indusă folosind o dietă bogată în grăsimi de 60% (HFD) timp de 12 săptămâni, în timp ce un grup de control normal (NC) a primit o dietă regulată. Șobolanii (n = 50) au fost împărțiți în mod egal în cinci grupuri: un control normal (NC) tratat cu ser fiziologic într-un volum asociat, un grup HFD (model obez de șobolan hrănit cu HFD, un grup HFD + DSP-250 administrat DSP-250 mg/kg pe cale orală zilnic cu HFD), un grup HFD + DSP-500 (administrat concomitent DSP-500 mg/kg pe zi pe cale orală) și un grup HFD + GE-200 (GE administrat concomitent, 200 mg/kg pe zi pe cale orală DSP și GE au fost amestecate cu apă distilată și administrate (10 ml/kg greutate corporală) proaspăt prin gavaj oral. Toate protocoalele experimentale au fost aprobate de comitetul de îngrijire și utilizare a animalelor din KNOTUS Co. Ltd. Korea (Număr certificat: IACUC 16 -KE-097).

Măsurarea grăsimii abdominale la animalele vii

Parametrii non-invazivi de adipozitate viscerală abdominală, cum ar fi grăsimea abdominală totală (TAF), grăsimea abdominală viscerală (VAF) și volumul de grăsime abdominală subcutanată (SAF) au fost măsurați la animale vii folosind tomografie micro-computerizată tridimensională (micro-CT). Măsurătorile micro-CT au fost efectuate pe un Scanco Viva CT 80 (Scanco Medical AG, Bassersdorf, Elveția) la 12 săptămâni, conform instrucțiunilor producătorului. Pentru scanare, șobolanii au fost anesteziați utilizând inhalare de izofluran 1% și poziționați pe spate cu fața în sus și cu capul în față. Ambele membre posterioare au fost extinse și fixate pe un suport pentru specimen, cu un unghi de 90 ° între femur și coloana vertebrală, cu ambele picioare complet extinse.

Pentru a cuantifica grăsimea viscerală și subcutanată, zona dintre capătul proximal al vertebrei lombare L1 și capătul distal al L6 a fost scanată la o dimensiune voxel izotropă de 18 μm (energie 70 kVp, intensitate 114 μA, 31,9 mm FOV/diametru, 200 ms timpul de integrare). Selectarea energiei de scanare și a dimensiunii voxelului (increment de scanare) s-a bazat pe optimizarea timpului de scanare și a detaliilor țesuturilor și minimizarea expunerii la radiații în conformitate cu indicațiile companiei. Fiecare parametru a fost analizat din reconstrucții 3D ale scanărilor micro-CT generate de software-ul de imagine furnizat (Scanco Medical, Bassersdorf, Elveția).

Măsurarea parametrilor biochimici serici

Aproximativ 1 ml de sânge a fost colectat din vena jugulară a animalelor folosind tuburi vacutainer care conțin un activator al cheagurilor la 8 săptămâni și 12 săptămâni după inducerea obezității. Coagularea a fost lăsată să se producă la temperatura camerei timp de aproximativ 15 până la 20 de minute, iar apoi serul a fost separat prin centrifugare la 3000 rpm timp de 10 minute și depozitat la -20 ° C până la analiză. Nivelurile trigliceridelor serice (TG), colesterolului total (TC), lipoproteinelor cu densitate mare (HDL) și lipoproteinelor cu densitate mică (LDL) au fost măsurate cu un instrument Hitachi 7180 (Hitachi, Tokyo, Japonia). Nivelul seric al colesterolului lipoproteic cu densitate foarte mică (VLDL) a fost calculat utilizând formula: VLDL = TG/5 (Friedewald și colab. 1972; Rahman și colab. 2017). Indicele aterogen (AI) este un instrument util pentru evaluarea tulburărilor cardiovasculare legate de lipidele serice și a fost măsurat utilizând raportul TC/HDL (Grover și colab. 1999; Rahman și colab. 2017).

Cultura celulară și diferențierea adipocitelor

Pre-adipocitele de șoarece 3T3-L1 au fost cultivate la 37 ° C și 95% umiditate cu o atmosferă de 5% CO2 în mediul de vultur modificat Dulbecco (DMEM) ca mediu de cultură împreună cu 10% ser fetal bovin (FBS), 2 ml de l -glutamina, 50 U/mL de penicilină și 50 μg/mL de streptomicină, care a fost incubată timp de 3 zile pentru confluență. În acest moment (ziua 0), mediu de diferențiere (DM) (DMEM conținând 10% FBS, 2 mL de l -glutamină, 50 U/mL de penicilină, 50 μg/mL de streptomicină, 0,5 mM IBMX, 1 µM dexametazonă și 1,7 µM insulină) a fost adăugată timp de 6 zile și a fost schimbată la intervale de 3 zile. În a șasea zi, mediul de diferențiere a fost înlocuit cu mediu de inducție (DMEM conținând 10% FBS, 2 ml de 1-glutamină, 50 U/ml penicilină, 50 μg/ml de streptomicină, 1,7 μM insulină). Mediul NC a fost tratat numai cu mediu de cultură și mediu de diferențiere și inducție (DMI). Restul grupurilor au fost tratați cu concentrații diferite de TFA împreună cu mediu de diferențiere și inducție (DMI +10, 50, 100, 500 μM TFA) între zilele 0 și 9. Efectul citotoxicității TFA asupra celulelor 3T3-L1 a fost evaluat de către Testul MTT. Concentrațiile de TFA au fost 0-500 μM și nu s-a observat toxicitate celulară în acest interval.

Testul trigliceridelor și colorarea cu roșu uleios

Pentru a investiga efectele anti-adipogene ale DSP, pre-adipocitele 3T3-L1 au fost tratate cu TFA purificat de DSP timp de 9 zile (zilele 0-9). Efectul TFA asupra inducerii markerilor de diferențiere terminală a fost evaluat la sfârșitul diferențierii (ziua 9). Pentru a determina conținutul lipidic celular, celulele au fost colectate și lizate în tampon de liză (zaharoză 25 mM, Tris-HCI 20 mM, EDTA 1 mM și EGTA 1 mM). Conținutul trigliceridelor celulare a fost măsurat folosind un kit comercial de cuantificare a trigliceridelor (Abcam, MA) conform instrucțiunilor producătorului.

Acumularea de lipide în citoplasmă a fost analizată folosind un kit de colorare Oil Red O conform protocolului sugerat de producător (Lifeline Cell Technology, Carlsbad, CA). Picăturile lipidice colorate din celule au fost vizualizate și fotografiate cu un microscop Observer A1 (Carl Zeiss, Jena, Germania) la o mărire de 100 ×. Valorile absorbantei soluției de roșu uleios O eluate au fost măsurate în acumularea picăturilor de lipide reflexe adipocite în citoplasmă, la fel și conținutul lipidic neutru. După realizarea unei fotografii, colorantul de cultură colorat reținut în celule a fost eluat cu izopropanol și cuantificat la o rată de absorbție de 540 nm folosind un spectrofotometru cu cititor de plăci (BioTek Instruments, VT).

Izolarea ARN și RT-PCR în timp real

Efectul DSP asupra expresiei celulare legate de adipogeneză a factorilor de transcripție SREBP1, PPAR-γ, C/EBPα și FAS a fost investigat în lizatele celulare 3T3L-1 folosind RT-PCR. ARN-ul celular total a fost izolat din adipocite 3T3-L1 folosind un kit BLUE ușor (iNtRON, INC., Daejeon, Coreea) și utilizat în RT-PCR în timp real utilizând un sistem de detectare PCR în timp real CFX96 ™ (Laboratoarele Bio-Rad, Hercules, CA). Transcrierea inversă a ARN-ului total a fost efectuată cu kituri de transcripție inversă cADN de mare capacitate (Applied Biosystems, CA), iar amestecul de reacție conținea 2 μL de ADNc șablon, 10 μL de 2 × SYBR Primix Ex Taq și 200 nM primer într-un volum final de 20 μL.

Reacțiile au fost denaturate la 95 ° C timp de 30 s și apoi supuse la 45 de cicluri de 95 ° C timp de 5 s și 60 ° C timp de 20 s. Când ciclul de reacție a fost finalizat, temperatura a fost crescută de la 65 ° C la 95 ° C la o viteză de 0,2 ° C/15 s. Fluorescența a fost măsurată la fiecare 5 s pentru a construi o curbă de topire. O probă de control care nu conținea ADN șablon a fost efectuată cu fiecare test și toate determinările au fost efectuate cel puțin în duplicat pentru a asigura reproductibilitatea. Autenticitatea produsului amplificat a fost determinată prin analiza curbei de topire. Toate datele au fost analizate utilizând software-ul de analiză Bio-Rad CFX Manager Versiunea 2.1 (Bio-Rad Laboratories). ADNc țintă a fost amplificat folosind primerul senzorial și primerii antisens așa cum se arată în Tabelul 2 .

masa 2.

Exemple de secvențe utilizate pentru evaluarea RT-PCR în timp real a expresiei genelor.