ABSTRACT

INTRODUCERE

La mamifere, leptina reglează aportul de alimente și echilibrul energetic, în principal prin activarea receptorului de leptină sub formă lungă (LepRb) și căile de semnalizare în aval în hipotalamus, iar deficitul de leptină provoacă obezitate și diabet, precum și funcții de reproducere afectate (14, 15, 31) . S-a arătat că SH2-tirozin fosfataza Shp2 se leagă direct de LepRb activat prin andocarea pe p-Tyr985 în domeniul intracelular (23, 37). Ablația genetică a Shp2 în sistemul nervos central a dus la obezitate brută asociată cu rezistența la leptină și scăderea p-Erk, sugerând un rol pozitiv al Shp2 în amplificarea semnalului de leptină în hipotalamus (2, 22, 37).

corpului

Estradiolul-17β (E2), un hormon reproductiv, joacă, de asemenea, un rol vital în metabolismul energetic și controlul greutății corporale (13). Ștergerea aromatazei care catalizează formarea estrogenului sau perturbarea receptorului de estrogen α (ERα) duce la obezitate mai severă dependentă de vârstă la femei decât la bărbați, indicând faptul că deficitul de estrogen este responsabil pentru progresia obezității dimorfice sexual (19, 21 ). La femeile aflate în postmenopauză sau la rozătoarele ovariectomizate, deficiența de estrogen este asociată cu o probabilitate crescută de obezitate și diabet de tip 2 (7, 32). Înlocuirea estrogenului la animalele ovariectomizate suprimă dezvoltarea obeză prin scăderea aportului de alimente și creșterea cheltuielilor de energie (17). Tratamentul hormonal la femeile aflate în postmenopauză previne progresia obezității și îmbunătățește sensibilitatea la insulină și toleranța la glucoză (33). În schimb, ștergerea sau reducerea la tăcere a ERα în hipotalamus duce la obezitate și defecte metabolice la rozătoare (19, 25). Estrogenul are un efect asemănător leptinei în activarea semnalelor intracelulare în celulele melanocortinei hipotalamice (16). Cu toate acestea, rămâne de stabilit modul în care semnalizarea estrogenului este legată de calea leptinei.

Rolul pozitiv al Shp2 în medierea semnalului de leptină în creier a prezis că îmbunătățirea farmaceutică a activității Shp2 la nivel local în creier ar depăși rezistența la leptină și va atenua obezitatea. Pentru a testa această ipoteză, am generat o linie de șoarece transgenic cu expresie în neuronii din creier anterior a unui mutant activ activ (câștig de funcție) Shp2 D61A, care s-a dovedit că prezintă o activitate fosfatazică crescută dramatic, fără a afecta activitatea sa de legare a SH2 (26) . Caracterizarea șoarecilor transgenici a relevat un rol neașteptat critic al Shp2 în cuplarea semnalizării leptinei și estrogenului. Aceste date completează un gol în cunoștințele noastre despre funcția de suprapunere a acestor doi hormoni în metabolism și ajută la demonstrarea de ce femeile aflate în postmenopauză tind să dezvolte obezitate.

MATERIALE ȘI METODE

Generarea șoarecilor transgenici Shp2 D61A. Mutantul Shp2 D61A a fost creat prin mutageneză direcționată de site folosind ADNc-ul Shp2 de șoarece ca șablon. Fragmentul Shp2 D61A mutant cu o secvență de tag hemaglutinină (HA) la capătul C a fost subclonat în vectorul pcDNA3.1. Promotorul citomegalovirusului (CMV) din plasmida pcDNA3.1 a fost înlocuit cu promotorul CaMKIIα (12) pentru a conduce expresia mutantului Shp2 D61A -HA. Construcția proiectată a fost injectată în ovocitele fertilizate de șoareci C57BL/6 pentru a genera o linie de șoarece transgenic în instalația pentru animale de la Sanford/Burnham Medical Research Institute (SBMRI). Toate procedurile pentru animale au fost aprobate de Universitatea din California, San Diego și de comitetele instituționale de îngrijire și utilizare a animalelor SBMRI.

Injecție AAV. Sistemul de expresie a virusului adeno-asociat (AAV) (Stratagene) a fost utilizat pentru a produce proteina fluorescentă verde AAV (GFP) și virusul AAV-Shp2 D61A -GFP. Virușii AAV au fost injectați în hipotalamusul mediobasal al șoarecilor așa cum s-a descris anterior (38). Pe scurt, injecția bilaterală în hipotalamusul mediobazal a fost direcționată utilizând o stereotaxă ultraprecisă cu o rezoluție de 10 μm (Kopf Instruments) la coordonatele de 1,5 mm posterioare bregmei, 5,8 mm sub bregma și 0,3 mm laterale față de linia mediană. Virușii suspendați în lichidul cefalorahidian au fost injectați timp de 10 minute printr-o canulă de ghidare cu calibru 26 și un injector cu calibru 33 (Plastics One) conectat la o seringă Hamilton și la o pompă de perfuzie (WPI Instruments).

Hrănirea HFD și ovariectomia. Șoarecii de tip sălbatic (wt) și transgenici la vârsta de 8 până la 10 săptămâni au fost hrăniți fie cu o dietă bogată în grăsimi cu 58% kcal (HFD; catalog nr. D12331; Research Diets), fie cu o dietă cu 6% kcal chow (catalog nr. 8664; Harlan Teklad) timp de 20 de săptămâni (24). Greutatea corporală a șoarecilor a fost monitorizată săptămânal. Pentru a măsura aportul de alimente, șoarecii au fost separați în cuști individuale, iar modificările cantităților de alimente au fost înregistrate zilnic. Ovariectomia a fost efectuată la șoareci femele în greutate și transgenici la vârsta de 10 până la 12 săptămâni. La 1 săptămână după operație, șoarecii au fost hrăniți fie cu HFD, fie cu o dietă regulată, timp de 8 săptămâni, iar greutățile corpului lor au fost monitorizate bisăptămânal.

Analize metabolice. Nivelurile serice de insulină și leptină au fost măsurate folosind truse comerciale (nr. Catalog 90030 și nr. Catalog INSKR020; Crystal Chem). Estradiolul (Cayman), testosteronul (Cayman) și corticosteronul (Enzo Life Science) au fost măsurate prin imunoanaliză enzimatică. Un test de toleranță la insulină (ITT) și un test de toleranță la glucoză (GTT) au fost efectuate pe șoareci Shp2 D61A și wt la vârsta de 24 până la 26 de săptămâni, după hrănirea cu HFD timp de 16 până la 18 săptămâni. Pentru ITT, insulina (Humulin R; Eli Lilly) a fost injectată intraperitoneal (1 U/kg [greutate corporală]), iar nivelurile de glucoză din sânge au fost măsurate cu un glucometru (Lifescan One-Touch Basic) la 0, 15, 30, 60 și 120 min. Pentru GTT, animalele au fost postite timp de 12 până la 16 ore și injectate cu glucoză (1,5 g/kg [greutate corporală]), iar apoi nivelurile de glucoză din sânge au fost măsurate la 0, 15, 30, 60 și 120 de minute.

Pentru sensibilitatea la leptină, șoarecii hrăniți cu HFD sau dieta chow timp de 16 săptămâni au fost injectați intraperitoneal cu leptină (1,5 μg/kg [greutate corporală]; Programul Național de Hormoni și Peptide) de două ori pe zi timp de 3 zile (7:30 și 18:30) doză, 1,5 μg/kg [greutate corporală]) (24). Șoarecii au fost separați în cuști individuale și plasați pe dieta chow. Greutatea corporală și aportul de alimente au fost monitorizate zilnic timp de 7 zile. Consumul de O2 și producția de CO2 au fost măsurate utilizând sistemul Oxymax (Columbus Instruments).

Studii de semnalizare celulară. Șoarecii la vârsta de 30 de săptămâni hrăniți cu HFD timp de 20 de săptămâni au fost la post timp de 12 până la 16 ore. Leptina (1,5 μg/kg [greutate corporală]), estradiol-17β (nr. Catalog 3301 [Calbiochem], 50 μM/kg [greutate corporală]) și soluție salină au fost administrate intraperitoneal cu 1 oră înainte de sacrificiu. Creierul a fost izolat cu atenție și omogenizat cu tampon de liză tisulară, iar apoi lizatul a fost centrifugat la 14.000 rpm timp de 30 de minute de două ori. Lizatele care conțin 50 μg de proteine ​​au fost imunoblotate pentru pY-Stat3 (catalog nr. 9131; Cell Signaling), Stat3 (catalog nr. 9132; Cell Signaling), pAkt-s473 (catalog nr. 9271; Cell Signaling), pAkt-t308 catalog 9275; Semnalizare celulară), Akt (nr. catalog 9272; Semnalizare celulară), pY-Src și Src (Semnalizare celulară), pErk1/2 (nr. catalog 9101; Semnalizare celulară), adiponectină (Millipore) și HA ( Actualizați). Creierul șoarecelui a fost izolat după perfuzie cu 4% paraformaldehidă (PFA) pentru secționarea înghețată. Antimorpii Shp2 (syp de casă sau sc-280; Santa Cruz Biotechnology), anticorpul ERα (sc-542; Santa Cruz Biotechnology) și anticorpul pY-Stat3 au fost folosiți pentru imunocolorare. Ficatul a fost colectat pentru secționarea înghețată și apoi colorat cu roșu O-ulei sau cu hematoxilină și eozină (H&E) (4). Țesutul adipos a fost fixat prin soluție Z-Fix timp de 24 de ore pentru a efectua colorarea H&E. Probele de creier au fost colectate pentru secționarea înghețată și colorate de anticorpi.

Analize statistice. Datele sunt exprimate ca medii ± erorile standard ale mediei (SEM). Semnificația statistică a fost determinată folosind un test Student t cu două cozi nepereche și analiza varianței.

REZULTATE

Expresia Shp2 D61A reduce consumul de alimente și consumul de energie îmbunătățit. Pentru a examina bilanțul energetic, am monitorizat aportul de alimente și am constatat o scădere semnificativă a consumului de alimente de la șoarecii femele Shp2 D61A, comparativ cu martorii, când au fost hrăniți cu HFD (Fig. 3A). După ce au fost plasați pe un HFD timp de 4 săptămâni, șoarecii femele Shp2 D61A au prezentat o producție crescută de căldură comparativ cu șoarecii în greutate într-un HFD (Fig. 3B), iar șoarecii femele Shp2 D61A au prezentat un consum de O2 și eliberare de CO2 semnificativ mai mare decât martorii (Fig. 3C până la F). Aceste date sugerează că expresia Shp2 D61A la șoareci de sex feminin a atenuat obezitatea indusă de HFD datorită cheltuielilor de energie sporite și a aportului scăzut de alimente.

Exprimarea Shp2 D61A crește sensibilitatea la leptină. După ce șoarecii au fost hrăniți cu HFD sau cu o dietă chow timp de 20 de săptămâni, au fost măsurate nivelurile serice de leptină. (A) Nivelurile serice de leptină au fost comparate între șoareci masculi în greutate și Shp2 D61A pe o dietă HFD sau chow. (B) Cantitățile serice de leptină au fost comparate între șoareci femele în greutate și Shp2 D61A pe o dietă HFD sau chow. (C) Leptina a fost injectată intraperitoneal de două ori pe zi timp de 3 zile. Greutatea corporală a șoarecilor femele a fost măsurată zilnic timp de 7 zile. Datele sunt exprimate ca mijloace ± SD. *, Grupurile P D61A din ambele sexe, sugerând că adiponectina nu joacă un rol în rezistența la obezitatea indusă de HFD în acest model. Pentru a investiga dacă hormonii sexuali sunt implicați în dezvoltarea obezității, am examinat nivelurile serice de estrogen și testosteron. Nu s-a observat nicio diferență semnificativă între șoareci wt și Shp2 D61A (Fig. 5F și G). Cu toate acestea, nivelul corticosteronului a fost semnificativ redus în grupul Shp2 D61A din ambele sexe, comparativ cu controlul în greutate (Fig. 5H), sugerând că corticosteronul nu este un factor major în dezvoltarea dimorfică a obezității sexuale.

Shp2 cuplează semnalizarea leptinei și estrogenilor în hipotalamus. (A) Semnalele Shp2, ERα și pY-STAT3 au fost detectate prin imunocolorare cu anticorpi specifici în zona hipotalamusului după injecția cu leptină. Bara de scalare, 50 μm. (B și C) Creierul (B) și uterul (C) au fost utilizate țesuturi pentru a efectua testul de coimmunoprecipitare cu anticorpi specifici pentru Shp2 și ERα. (D) Lisatul celular MCF-7 a fost preparat pentru coimmunoprecipitare cu anticorpi specifici la ERα sau Shp2 și a fost supus imunoblotării așa cum se arată. Colorare imunofluorescentă pentru Shp2 și ERα în celulele MCF-7. (E) Sistem de traducere in vitro care utilizează estradiol-17β (E2) legare îmbunătățită a Shp2 și ERα in vitro. (F) Asocierea indusă de E2 a Shp2 cu ERα în celulele MCF-7.

Shp2 îmbunătățește acțiunea leptinei și estrogenului. Am determinat dacă leptina și estrogenul funcționează împreună pentru a activa căile de semnalizare intracelulară. Stimularea prin leptină sau estrogen a indus fosforilarea rapidă a Erk, Src, Stat3 și Akt (Fig. 7A) și tratamentul combinat cu leptină și estrogen a îmbunătățit dramatic semnalul de fosforilare a Erk, indicând un efect sinergic în semnalizarea celulară (Fig. 7A) . Nu s-a detectat nicio modificare dramatică a nivelurilor de fosforilare a Src după stimularea leptinei sau a estrogenului (Fig. 7A). Am injectat leptină și/sau estrogen în șoareci wt și Shp2 D61A plasați pe HFD timp de 20 de săptămâni. Fosforilarea Erk, Akt și Stat3 a fost semnificativ crescută după 1 oră de administrare de leptină sau estrogen, comparativ cu șoarecii cărora li s-a administrat o injecție salină (Fig. 7B). Comparativ cu martorii, șoarecii transgenici de ambele sexe au prezentat un nivel bazal mai ridicat de p-Erk, p-Akt și p-Stat3. În mod consecvent, șoarecii transgenici au prezentat o sensibilitate mai mare la leptină și estrogen decât animalele în greutate și au posedat niveluri circulante mai mici de leptină (Fig. 5A). Mai mult decât atât, nivelurile globale de fosforilare ale Erk, Akt și Stat3 au fost mai mari la femele decât la șoareci masculi, sugerând că leptina și estrogenul funcționează împreună în reglarea căilor Erk, Akt și Stat3 in vivo (1, 5, 17, 18, 36, 37).

Shp2 îmbunătățește semnalele de leptină și estrogen. (A) Leptina și E2 au indus fosforilarea Erk1/2, Src, Stat3 și Akt în celulele PC12 LepRb. Panoul din dreapta arată cuantificarea p-Erk (n = 3). (B) Leptina și E2 au stimulat fosforilarea Erk1/2, Akt și Stat3 în creierul șoarecilor Shp2 D61A. Panoul din dreapta arată cuantificarea p-Erk (n = 4 până la 5). (C) Knockdown-ul Shp2 sau ERα a inhibat inducerea p-Erk1/2 de către leptină sau estrogen. Celulele incubate în mediu cu 1 până la 2% ser au fost tratate cu unul sau ambii hormoni. Panoul din dreapta arată cuantificarea p-Erk (n = 3). (D) Celulele înfometate în mediu fără ser au fost tratate cu leptină și/sau estrogen pentru inducerea semnalelor p-Erk1/2.

Am investigat în continuare discuția încrucișată despre semnalizarea leptinei și estrogenului în celulele MCF-7 care exprimă atât LepRb, cât și ERα. Knockdown-ul expresiei Shp2 sau ERα prin interferența ARN a scăzut semnificativ nivelurile bazale ale p-Erk (Fig. 7C). Knockdown-ul Shp2 a întârziat inducerea p-Erk de la 15 la 30 de minute prin stimularea estrogenului (Fig. 7C). Stimularea combinată a estrogenului cu leptina a restabilit parțial timpul de reacție al p-Erk la 15 min. Interesant este că deranjarea ERα a provocat, de asemenea, o inducție întârziată a semnalului p-Erk de către leptină, similar cu deranjarea Shp2; tratamentul combinat al leptinei și estrogenului nu a salvat întârzierea în inducerea p-Erk. În schimb, expresia Shp2 D61A în celulele MCF-7 a dus la activarea susținută a Erk de către leptină și estrogen (Fig. 7D), indicând o reglare coordonată de Shp2 a căilor de semnalizare a leptinei și estrogenului.

Cu toate acestea, este interesant faptul că efectul antiobese al mutantului Shp2 D61A este mult mai proeminent la femele decât la șoareci masculi. În concordanță cu fenotipul sexual-dimorf, am constatat că Shp2 este asociat fizic cu receptorul de estrogen ERα și că asocierea este îmbunătățită prin stimularea estrogenului. Astfel, Shp2, o moleculă de semnalizare citoplasmatică, acționează pentru a media cuplarea directă a evenimentelor de semnalizare declanșate de un hormon metabolic leptină și un hormon sexual estrogen în hipotalamus (Fig. 9). Exprimarea mutantului Shp2 D61A la șoareci masculi a indus un efect ușor asupra semnalizării insulinei și a homeostaziei glucozei, sugerând că axa HPA este implicată în controlul metabolismului glucozei.

Model pentru semnalizarea concertată a leptinei și estrogenilor în reglarea hipotalamică a echilibrului energetic. (A) Femeile și tinerele tinere au niveluri normale de leptină și estrogen care acționează împreună în hipotalamus pentru a regla metabolismul energetic. (B) Chiar și cu niveluri normale de leptină, femeile aflate în postmenopauză prezintă un risc crescut de dezvoltare a obezității și a rezistenței la leptină, din cauza deficitului de estrogen. (C) Tinerele obeze cu producție normală de estrogen pot dezvolta obezitate datorită rezistenței la leptină. (D) Femeile obeze aflate în postmenopauză prezintă defecte în semnalizarea leptinei și estrogenului datorită rezistenței la leptină și a deficitului de estrogen.

Pe baza datelor experimentale prezentate aici și a funcțiilor de suprapunere cunoscute anterior între leptină și estrogen, propunem un model care să ilustreze mecanismul pentru dezvoltarea obezității la femeile aflate în postmenopauză din cauza deficitului de estrogen și a rezistenței la leptină (Fig. 9). Datele epidemiologice au sugerat, de asemenea, un risc mai mare pentru dezvoltarea cancerului de sân la femeile obeze din cauza nivelului ridicat de estrogen (6, 30). Creșterea nivelului seric al leptinei a fost detectată frecvent la pacienții cu cancer de sân (35), iar tumorigeneză mamară indusă de oncogenă a fost suprimată la șoareci cu deficit de leptină sau receptor de leptină (10). În special, supraexpresia Shp2 a fost detectată în celulele cancerului de sân (40). Elucidarea acțiunii Shp2 în legarea semnalizării leptinei și estrogenului în tumorigeneză mamară poate oferi o țintă terapeutică nouă pentru îmbunătățirea prognosticului pacienților cu cancer mamar la nivel mondial.

MULȚUMIRI

Mulțumim colegilor noștri pentru discuții utile.