Abstract

Introducere

Starea de veghe este esențială pentru vigilență și funcția cognitivă optimă, dar este afectată în numeroase condiții metabolice. Somnolența excesivă în timpul zilei și/sau vigilența afectată apar cu prevalență crescută în obezitate, diabet, depresie, tulburări neurodegenerative și îmbătrânire (Chasens și colab., 2009; Gozal și Kheirandish-Gozal, 2009; Hawley și colab., 2010). Mecanismele prin care tulburările metabolice pot afecta veghe sunt slab înțelese.

regulation

Starea de veghe este modulată de mai multe grupuri de neuroni activi de veghe (WAN), incluzând neuronii colinergici din creierul bazal, creierul mediu și pons, neuronii orexinergici și histaminergici din hipotalamus și neuronii serotoninergici, dopaminergici și noradrenergici din midbrain și poni ( Fuller și colab., 2006). WAN-urile sunt sensibile la diferite perturbații metabolice, răspunzând fie prin schimbări de activitate, fie prin măsuri de rănire. Provocările metabolice, de exemplu, dishomeostaza glucozei sau oxigenului, influențează activitatea WAN (Figlewicz și colab., 1996; Petrisić și colab., 1997). Modificările proeminente legate de vârstă în WAN includ pierderea dendritelor, axonopatia, reducerea enzimelor de sinteză a neurotransmițătorilor și, în populații selectate, acumularea de lipofuscină și pierderea celulelor (Mann, 1983; Ishida și colab., 2001; Zecca și colab., 2004) . WAN-urile pot fi rănite la începutul cursului mai multor tulburări neurodegenerative, inclusiv bolile Alzheimer, Parkinson și Huntington și scleroza laterală amiotrofică (Chan-Palay și Asan, 1989; Zarow și colab., 2003; Benarroch și colab., 2009). Astfel, se pare că, la fel ca starea de veghe, WAN-urile sunt sensibile la diverse perturbări metabolice.

Sirtuinele sunt recunoscute ca fiind integrate în numeroase adaptări metabolice în diverse tipuri de celule. Regulatorul de informație silențios 2 (SIR2) a fost descris în drojdie ca o durată de viață extinsă (Gotta și colab., 1997). SIRT1, cel mai apropiat ortolog de mamifer de drojdia SIR2, funcționează ca o deacetilază dependentă de nicotinamidă adenină dinucleotidică pentru ținte histonice și non-histonice (Imai și colab., 2000). În calitate de regulator transcripțional sensibil la nivel metabolic, SIRT1 servește la protejarea celulelor de dishomeostazie metabolică, prin inițierea unei game largi de răspunsuri adaptive la perturbațiile nutrienților și redox (Boily și colab., 2008). Activarea SIRT1 a receptorului-γ coactivator-1α activat cu proliferatorul peroxizomului îmbunătățește biogeneza mitocondrială, optimizează raportul suprafață/volum mitocondrial pentru a reduce producția de specii reactive de oxigen și montează o apărare antioxidantă (Nemoto și colab., 2005; Aquilano și colab., 2010). SIRT1 promovează homeostazia energetică prin modificări de deacetilare a factorilor de transcripție FOXO (Nie și colab., 2009). Autofagia, o sursă importantă de energie în neuroni, este, de asemenea, reglementată de SIRT1 (Salminen și Kaarniranta, 2009; Kume și colab., 2010). Dishomeostaza severă metabolică sau redox poate suprima activitatea SIRT1 (Zee și colab., 2010).

În această serie de studii, am examinat populațiile de WAN-uri pentru prezența SIRT1, găsind SIRT1 prezent în nucleele WAN-urilor. Am explorat apoi rolul SIRT1 în veghe și în integritatea rețelelor WAN. Pierderea condiționată a SIRT1 la șoarecii adulți tineri are ca rezultat un fenotip asemănător senescenței în WAN, inclusiv pierderea enzimelor cheie neurotransmițătoare sau neuropeptidă, pierderea dendritelor și axonilor și a acumulării accelerate de lipofuscină (agregate de proteine ​​și lipide oxidate ireversibil). Pierderea progresivă a acumulării nucleare SIRT1 și lipofuscină are loc în timpul îmbătrânirii normale în WAN. Concluzionăm că SIRT1 protejează rețelele WAN și este esențial pentru starea de veghe normală. Pierderea legată de vârstă a SIRT1 contribuie probabil la o sensibilitate crescută la procesele neurodegenerative.

Materiale și metode

Studiile au fost efectuate la Universitatea din Pennsylvania cu aprobarea Comitetului instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor și au fost conforme cu Institutul Național de Sănătate revizuit al Biroului Politicii de bunăstare a animalelor de laborator. Șoarecii au fost adăpostiți în cuști de patru până la cinci, cu hrană și apă disponibile ad libitum. Au fost utilizate trei seturi de șoareci: șoareci masculi C57BL/6J de tip sălbatic (cu vârste cuprinse între 2, 12 și 24 de luni), șoareci transgenici SIRT1 [tip sălbatic (WT), +/− și -/- colegi de gunoi] pe un fundal (Vârsta de 6-8 luni) care au fost generate așa cum s-a descris anterior (Boily și colab., 2008) și B6; 129 - Șoareci Sirt1 tm1Ygu/J cu o ștergere condiționată a exonului 4 din gena SIRT1 (SIRT1 flx/flx) cu șoareci WT de aceeași tulpină de fond, B6; 129F1/J (6-8 luni) (Cheng și colab., 2003).

Knockdown SIRT1 condiționat al întregului creier.

Vectorii virali adeno-asociați (AAV) au fost proiectați pentru distribuția pe scară largă a cre-recombinazei în creierul șoarecelui adult, așa cum a fost descris anterior și validat (Cearley și Wolfe, 2007). Practic, un promotor de citomegalovirus (CMV) și transgena cre-recombinază au fost încorporați într-un genom recombinant AAV2, ambalat încrucișat fie într-un vector AAV1, fie AAV9. Universitatea din Pennsylvania Vector Core a realizat proiectarea, ambalarea, purificarea și măsurarea titrurilor vectoriale. Pentru a examina efectele pierderii SIRT1 la șoarecele adult, șoarecii SIRT1 flx/flx și martorii au fost anesteziați cu ketamină/xilazină (80 și respectiv 20 mg/kg, ip, respectiv) și injectați cu AAV2/1 (10 nl,> 2 13 GC/ml) intracerebroventricular (n = 4 SIRT1 flx/flx și 4 controale) sau AAV2/9 (3-5 nl,> 2 13 GC/ml) care vizează creierul central rostral (bregma, -4,3 mm; dorsoventral, 2,7 mm; mediolateral, 0 mm) și pons dorsal bilateral (bregma, −5,4; dorsoventral, 3,5 mm; mediolateral, 1 mm), referindu-se dorsoventral 0 mm la dură la locul injectării (n = 8 SIRT1 flx/flx și 6 controale).

Hibridizare in situ.
Implantarea de electrozi pentru înregistrarea stării comportamentale.

Șoarecii au fost implantați cu electrozi de argint ai mușchiului craniului și gâtului pentru înregistrări ale somnului cu electrozi electromiografici bilaterali frontali și occipitali electroencefalografici și nucali, așa cum s-a detaliat anterior (Veasey și colab., 2000). La două săptămâni după operație, fiecare șoarece a fost conectat la cabluri de înregistrare contraponderate cu un comutator pentru înregistrarea semnalelor electromiografice digitale digitalizate și rectificate în mișcare (Veasey și colab., 2000). Șoarecii au primit 1 săptămână pentru a se adapta la cablurile de conectare, susținute de capacitatea de a sta complet în poziție verticală pe membrele posterioare și de a manevra rapid toate colțurile coliviei. Înregistrările au fost colectate în următoarele 2 săptămâni.

Protocoale și analize ale stării comportamentale.
Imunohistochimie.

Pentru a analiza colocalizarea SIRT1 în neuronii de veghe, două până la patru secțiuni pe șoarece pentru fiecare nucleu (acoperind rostrocaudal) au fost realizate cu microscopie confocală (Leica SP-5, AOBS) oferind o serie z de imagini confocale de 1 μm, evitând partea de sus iar la fund 3 μm din fiecare secțiune. Toți neuronii marcați cu nuclee complete au fost analizați pentru SIRT1 cu software-ul NIH ImageJ. Utilizarea unei serii 1: 6 de secțiuni de 40 μm a asigurat numărarea fiecărui neuron cu un nucleu vizualizat o singură dată. Procentul mediu de WAN-uri marcate cu SIRT1 în 100-500 de neuroni per nucleu per șoarece a fost comparat folosind ANOVA bidirecțională între șoareci de tip sălbatic pentru cei șase nuclei, așa cum s-a detaliat anterior (Zhu și colab., 2007). Pentru a caracteriza apoptoza, am examinat poli (ADP-riboză) -polimerază-1 (PARP-1) și caspază-3 scindată în neuroni marcați TH, folosind anticorpi și protocoale descrise recent (Zhu și colab., 2007). Atât PARP-1, cât și caspaza-3 scindată au fost analizate ca ANOVA bidirecțională pentru nucleu și genotip.

Pentru a determina dacă absența transgenică a SIRT1 are ca rezultat pierderea WAN-urilor, am efectuat un număr imparțial de celule în locus ceruleus, folosind metoda disectorului optic/Cavalieri (Nurcombe și colab., 2001). Analiza a fost realizată utilizând software-ul NIH ImageJ (disponibil la http://rsb.info.nih.gov/ij; dezvoltat de Wayne Rasband, National Institutes of Health, Bethesda, MD). Variația în diametrul nuclear (nucleele SIRT1 -/- sunt mai mari) și neregularitățile induse de deficiența SIRT1 în somate (vacuole masive) au împiedicat utilizarea factorului de corecție Abercrombie. Toate secțiunile dintr-o serie 1: 3 (șase până la opt nuclee pe șoarece) au fost anti-tirozin hidroxilază marcate cu substrat Vector SG și contracolorate cu Nissl, așa cum s-a descris anterior (Zhu și colab., 2007). Coordonatele x, y ale cutiei conțineau dimensiunile coronale întregi ale LC, iar dimensiunile z au fost definite cu contrast diferențial de interferență pentru a include de la 3 la 10 μm de la capac (rezoluția mișcării Z, 0,1 μm). Numărul de celule pe cutie calculat în medie pe șoarece a fost raportat pentru n = 4-5 pe genotip cu> 800 de celule numărate pe șoarece (cu investigatorii orbi de genotip). Numărurile pe secțiune au fost analizate ca probe asociate pe baza poziției relative a bregmei, utilizând un test t asociat.

Pentru a evalua modificările morfologiei WAN, am analizat densitatea dendritei și zona de ramificare a transgenicelor SIRT1 și a controalelor utilizând software-ul NIH ImageJ. Suprafața totală acoperită de dendrite LC mediale către corpurile celulare a fost măsurată în planul bidimensional folosind o grilă suprapusă cu gradații de 800 μm 2. Complexitatea ramificării dendritei a fost estimată prin numărul mediu de segmente de dendrită LC pe unitate de rețea pe aria totală numărată, în care un segment este porțiunea unei dendrite care acoperă o unitate de rețea (800 μm 2). Datele au fost analizate folosind teste t asociate cu perechi potrivite cu poziția relativă a bregmei.

Pentru a examina neuronii catecolaminergici pentru evidența granulelor de lipofuscină, au fost folosite tehnici ultrastructurale și confocale de microscopie cu lumină complementară (Xu și colab., 2008; Jung și colab., 2010). Șoarecii la 2, 12 și 24 de luni au fost perfuzați cu acroleină, iar secțiunile cerebrale au fost procesate așa cum s-a descris recent (Zhu și colab., 2007). Secțiunile de semitină au fost realizate fără marcarea tirozinei hidroxilazei pentru a interfera cu analiza citoplasmatică. Neuronii LC au fost identificați prin dimensiune (20-25 μm diametru) și poziție (medială și ventrală) în raport cu neuronii trigemeni mezencefalici mari și respectiv cu ventriculul. Microscopia cu lumină a fost efectuată pe secțiuni cu grosimea de 0,3 μm folosind 0,5% albastru de toluidină (Zhu și colab., 2007) pentru a estima procentul de neuroni cu agregate de lipofuscină, definit prin mărime și densitate (Jung și colab., 2010). Autofluorescența a fost detectată folosind un microscop confocal SP-5 AOBS Leica. Deși vizibilă cu toate laserele, excitația de 580 nm a arătat un semnal extrem de intens asociat cu filtrarea bandpass la 605-700 nm.

PCR cantitativ în timp real.
Western blot.

Imunobloturile au fost utilizate pentru a furniza semiquantificare pentru nivelurile de SIRT1 la șoareci tineri (2 luni) și bătrâni (24 de luni) și pentru enzime de sinteză a neurotransmițătorilor în colegii SIRT1 -/- și SIRT1 +/+. Disecțiile țesuturilor au fost obținute ca mai sus, dar au fost omogenizate pe gheață în tampon de liză cu inhibitori de protează antipaină, aprotinină, leupeptină și pepstatină (Sigma-Aldrich). Douăzeci de micrograme de proteine ​​totale, măsurate cu testul Pierce micro-BCA pe supernatante centrifugate, au fost rulate individual pe șoarece și nucleu pe geluri SDS-PAGE (10% Tris-HCI; Bio-Rad). Gelurile au fost transferate umed pe membrane de difluorură de poliviniliden și procesate pentru detectarea TH (61 kDa), ChAT (83 kDa) și SIRT1 (120 kDa) la 1: 100 folosind protocolul de detectare Odiseea cu markerul de greutate moleculară LI-COR. Densitățile medii integrate normalizate la 20 μg de proteine ​​au fost analizate cu teste t nepereche.

Rezultate

SIRT1 nuclear este evident în toate subseturile de neuroni activi de veghe

Pentru a localiza proteina SIRT1 în neuronii de veghe adulți și pentru a relaționa descoperirile cu alte populații neuronale de veghe (colinergice, histaminergice, dopaminergice și serotoninergice), am examinat în continuare imunoreactivitatea SIRT1 în populațiile stabilite de WAN. Pentru a demonstra specificitatea imunomarcării SIRT1, au fost studiați șoareci cu absență transgenică de SIRT1 (n = 5), coechipieri de tip sălbatic (n = 5) și șoareci SIRT1 +/− (n = 3). La colegii de tip sălbatic, SIRT1 nuclear a fost evident în marea majoritate a neuronilor colinergici ai creierului bazal lateral, dopaminergic VPAG, histaminergic hipotalamic posterior, LH orexinergic, LC noradrenergic, pedunculopontin (PPT) și tegmentum laterodorsal (LDT se chbranergic și neuronic prezentat și rezumat în Fig. 1B - D). Grupurile de veghe colinergice ale creierului medial (sept medial și bandă diagonală verticală) au avut imunoreactivitate SIRT1 minimă. Procentele de neuroni imunoreactivi SIRT1 în fiecare populație WAN sunt rezumate în Figura 1D.

Starea de veghe este afectată la șoarecii SIRT1 nul și heterozigoți

Enzime de sinteză a neurotransmițătorului WAN și orexină la șoareci cu deficit de SIRT1. A, Reducerea procentuală a copiilor de ARNm pentru enzimele neurotransmițătorului WAN și prepro-orexin: ChAT, prepro-orexin (orexin), dopamină β-hidroxilază (DBH), TH și l-triptofan (L-trypto). B, Top, reprezentativ TH și ChAT benzi occidentale din locus ceruleus și laterodorsal tegmentum din SIRT1 -/- și SIRT1 +/+ littermates. În partea de jos, histograma a integrat densitățile normalizate la 20 μg de proteine; medie ± SEM. C, Anti-TH (DAB, albastru) în LC la șoareci SIRT1 +/+ și SIRT1 -/- (sus) și anti-orexină A (Orex) în LH la șoareci SIRT1 +/+ și SIRT1 -/- (DAB, albastru), contracolorat cu roșu neutru. Bara de scalare, 50 μm. Opt, tract optic; mt, tract mamilotalamic.

AAV CMV cre-recombinaza din creier reduce în mod eficient neuronul de veghe SIRT1 la șoarecii SIRT1 flx/flx

Efecte asupra deficienței SIRT1 asupra morfologiei neuronului de veghe. A, Proiecții orxinergice (nichel, negru) în regiunea dendritelor LC (DAB, maro) la șoareci SIRT1 +/+ și SIRT1 -/-. Bara de scalare, 50 μm. B, Dendrite LC la șoareci WT cre-injectați și SIRT1 floxed cre-injectați. Sus, dendritele marcate cu Locus ceruleus TH la șoarecele WT cre-injectat (stânga) și la șoarecele SIRT1 floxat cre-injectat (dreapta). Bara de scalare, 25 μm. Imunoreactivitate neuronală SIRT1 (DAB, albastru închis) în WT și etichetare glială slabă la șoareci cu floxed SIRT. Două panouri inferioare arată dendrite LC - TH în WT (stânga) și mouse SIRT1 flox - cre (dreapta) cu vacuole mari (săgeți). Bara de scalare, 25 μm.

Ultrastructura neuronilor LC a fost examinată la șoarecii SIRT1 floxed și controlați AAV cre-injectați. În secțiunile de semitină, neuronii LC au fost identificați prin mărime și poziție față de neuronii etichetați TH + și mediali către nucleul mezencefalic mare al neuronilor nervului trigemen. Au fost observate diferențe izbitoare cu creșteri marcate atât în ​​lizozomi, cât și în agregate de lipofuscină (fig. 6A, B). Agregatele rare de lipofuscină au fost evidente la șoarecii tratați cu control, în timp ce numeroase agregate au fost prezente în aceleași populații WAN identificate cu extindere nucleară și vacuolizare dendritică și citoplasmatică la șoareci floxed SIRT1 (LC, VPAG, PPT și LDT). Agregatele au prezentat emisii maxime între 605 și 700 nm, cu dimensiuni de până la 6 μm (Fig. 6B). Citoplasma LC la șoarecii cu flox SIRT1 a arătat o densitate citoplasmatică omogenă care nu a fost observată la șoarecii injectați de control.

Agregatele de lipofuscină în neuronii activi la veghe la șoarecii cu deficit de SIRT1. A, Secțiunile de 0,3 μm colorate cu albastru de toluidină din LC evidențiază diferențele în densitatea citoplasmei la șoarecii SIRT1 floxed cre-injectați. Corpurile mari neregulate și dense sunt în concordanță cu corpurile lipofuscinei (așa cum este evidențiat cu săgeata și se inserează la mărire mai mare). B, Imaginea confocală utilizând excitația laserului la 580 nm și spectrul de emisii la 605-700 nm arată acumularea de agregate de autofluorescență în neuroni LC cu nuclee colorate cu 4 ′, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (albastru).