Jingjing Wang

și Institutul iHuman, Universitatea ShanghaiTech, Shanghai 201210, Republica Populară Chineză,

inactivării

b Școala de științe și tehnologie a vieții, Universitatea ShanghaiTech, Shanghai 201210, Republica Populară Chineză,

c Centrul CAS de Excelență în Știința Celulelor Moleculare, Institutul de Biochimie și Biologie Celulară din Shanghai, Academia Chineză de Științe, Shanghai, Republica Populară Chineză,

d Universitatea Academiei de Științe din China, Beijing 100049, Republica Populară Chineză,

Meng Wu

și Institutul iHuman, Universitatea ShanghaiTech, Shanghai 201210, Republica Populară Chineză,

b Școala de științe și tehnologie a vieții, Universitatea ShanghaiTech, Shanghai 201210, Republica Populară Chineză,

Lijie Wu

și Institutul iHuman, Universitatea ShanghaiTech, Shanghai 201210, Republica Populară Chineză,

Yueming Xu

și Institutul iHuman, Universitatea ShanghaiTech, Shanghai 201210, Republica Populară Chineză,

Fei Li

și Institutul iHuman, Universitatea ShanghaiTech, Shanghai 201210, Republica Populară Chineză,

Yiran Wu

și Institutul iHuman, Universitatea ShanghaiTech, Shanghai 201210, Republica Populară Chineză,

Petr Popov

și Institutul de Știință și Tehnologie Skolkovo, Moscova, Federația Rusă,

Lin Wang

f Institutul Shanghai pentru studii imunochimice avansate, Universitatea ShanghaiTech, Shanghai 201210, Republica Populară Chineză,

Fang Bai

b Școala de științe și tehnologie a vieții, Universitatea ShanghaiTech, Shanghai 201210, Republica Populară Chineză,

f Institutul Shanghai pentru studii imunochimice avansate, Universitatea ShanghaiTech, Shanghai 201210, Republica Populară Chineză,

Suwen Zhao

și iHuman Institute, ShanghaiTech University, Shanghai 201210, Republica Populară Chineză,

b Școala de științe și tehnologie a vieții, Universitatea ShanghaiTech, Shanghai 201210, Republica Populară Chineză,

Zhi-Jie Liu

și Institutul iHuman, Universitatea ShanghaiTech, Shanghai 201210, Republica Populară Chineză,

b Școala de științe și tehnologie a vieții, Universitatea ShanghaiTech, Shanghai 201210, Republica Populară Chineză,

Tian Hua

și iHuman Institute, ShanghaiTech University, Shanghai 201210, Republica Populară Chineză,

Date asociate

Referință PDB: receptor muscarinic M4, 6kp6

Abstract

1. Introducere

Receptorii acetilcolinei muscarinici (mAchRs) sunt proteine ​​membranare integrale care aparțin receptorilor cuplați la proteina G clasa A (GPCR) și sunt activați de neurotransmițătorul acetilcolină (Ach; ​​Fredriksson și colab., 2003 ▸). Dintre cele cinci subtipuri de receptori muscarinici, subtipurile M1, M3 și M5 se împerechează cu proteina G Gq/11, activând fosfolipaza C și crescând Ca 2+ citosolic, în timp ce subtipurile M2 și M4 se împerechează cu Gi/o, mediază inhibarea adenililului ciclază (Hulme și colab., 1990). Fiecare subtip mAchR are, de asemenea, o distribuție unică în sistemul nervos periferic sau central din corpul uman și sunt ținte atractive pentru tratamentul diferitelor afecțiuni fiziopatologice, inclusiv boala pulmonară obstructivă cronică (BPOC), vezica hiperactivă și sindromul Sjögren (Eglen, 2012 ▸; Eglen și colab., 1996 ▸).

Secvența ridicată și asemănările structurale dintre subtipurile mAchR fac proiectarea selectivă a ligandului destul de dificilă, ceea ce împiedică modularea precisă a mAchR pentru beneficii terapeutice. În periferie, M4 este exprimat în diferite terminații nervoase prejuncționale, acționând pentru a inhiba transmisiile parasimpatice și simpatice, în timp ce în sistemul nervos central (SNC) M4 este distribuit în corpul striat și co-localizat cu receptori de dopamină pe neuronii proiecți striatali . M4 joacă, de asemenea, un rol important în diferite boli ale tulburărilor motorii, cum ar fi boala Parkinson și distonia (Bernard și colab., 1992 ▸; Eskow Jaunarajs și colab., 2015 (; Ztaou și colab., 2016 (). Majoritatea antagoniștilor muscarinici, cum ar fi atropina și tiotropiul, care este un medicament comercial utilizat în prezent pentru tratamentul BPOC (Kato și colab., 2006 ()), nu sunt selectivi. Tropicamida antagonistă selectivă M4 slabă este utilizată pentru a dilata pupila pentru examinări oculare sau alte proceduri de diagnostic (Lam și colab., 2010 (; Yazdani și colab., 2018 (). Au fost rezolvate mai multe structuri ale receptorilor de acetilcolină muscarinică, așa cum se arată în Tabelul 1 ▸. Cele mai multe dintre ele se află în stări inactive cu antagoniști neselectivi sau agoniști inversi.

tabelul 1

mAChRStructure statePDB codeResolution (Å) LigandReference
M1Inactiv 5cxv 2.7 Tiotropium Thal și colab. (2016 ▸)
Activ 6oij 3.3IperoxoMaeda și colab. (2019 ▸)
M2 Inactiv 3uon 3.0QNB † Haga și colab. (2012 ▸)
5zkc 2.3 NMS ‡ Suno și colab. (2018 ▸)
5yc8 2.5 NMS Suno și colab. (2018 ▸)
5zkb 2,95 AF-DX 384 Suno și colab. (2018 ▸)
5zk8 3.0 NMS Suno și colab. (2018)
5zk3 2.6QNBSuno și colab. (2018)
Activ 4mqt 3.7Iperoxo, LY2119620 Kruse și colab. (2013 ▸)
4mq 3.5 Iperoxo Kruse și colab. (2013 ▸)
6oik 3.6Iperoxo, LY2119620Maeda și colab. (2019 ▸)
M3 Inactiv 4daj 3.4 TiotropiumKruse și colab. (2012 ▸)
4in14 3,57TiotropiumKruse și colab. (2012 ▸)
4in15 2.8Tiotropium Kruse și colab. (2012 ▸)
4in16 3.7NMS Kruse și colab. (2012 ▸)
5zhp 3.16o (BS46) Liu și colab. (2018 ▸)
M4Inactiv 5dsg 2.6TiotropiumThal și colab. (2016 ▸)

Este bine stabilit că activarea GPCR-urilor de clasă A este inițiată prin legarea ligandului, ceea ce induce modificări conformaționale ale helicilor transmembranare (TM). La activare, una dintre cele mai evidente trăsături este că partea citoplasmatică a TM6 se leagă de fasciculul transmembranar. Mai multe reziduuri conservate sau unice participă la procesul de activare. În primul rând, lanțul lateral al comutatorului de comutare W 6.48 (superscripturile indică numerotarea Ballesteros - Weinstein pentru GPCR; Ballesteros și Weinstein, 1995 ▸) în TM6 suferă o schimbare conformațională care dezlănțuie o serie de mișcări conformaționale ale receptorului. În consecință, reziduul de la 3,46 rupe contactul cu reziduul la 6,37 și formează un nou contact cu rotitul Y 7,53 în motivul NPxxY extrem de conservat al TM7. Se arată că capetele citoplasmatice ale TM3 și TM6 se separă datorită ruperii unei punți de sare între R 3.50 la sfârșitul TM3 (care face parte din motivul DRY conservat) și E 6.30 la sfârșitul TM6.

Structurile cristaline de înaltă rezoluție au arătat că GPCR-urile inactive din clasa A pot adăposti un situs de legare conservat pentru ioni Na + în centrul domeniului lor transmembranar (Fenalti și colab., 2014 ▸; Miller-Gallacher și colab., 2014 ▸; Zhang și colab. . al., 2012 ▸). Ionul Na + este coordonat de o punte de sare la D 2.50, împreună cu patru interacțiuni polare suplimentare cu lanțuri laterale de receptori și molecule de apă în structurile cristaline de înaltă rezoluție. De exemplu, ionul Na + din receptorul de adenozină A2A uman (A2AAR) este coordonat de două reziduuri foarte conservate, D 2.50 și S 3.39 și de trei molecule de apă (Liu și colab., 2012 (). Se constată că ionii Na + reduc selectiv afinitatea agoniștilor, dar nu și a antagoniștilor, ceea ce este în concordanță cu stabilizarea structurală a stării inactive de către ioni (Suno și colab., 2018 (). Cu toate acestea, acest buzunar de legare a ionului Na + este prăbușit în receptorii activi. Mutațiile din jurul situsului de legare a ionilor de Na + au un impact major asupra funcției receptorului în majoritatea GPCR-urilor de clasă A, fie eliminând complet cuplarea proteinei G, fie rezultând semnalizarea constitutivă independentă de ligand sau orientată pe cale (Suno și colab., 2018 ▸; Fenalti și colab., 2014 ▸; Huang și colab., 2015 ▸).

Pentru a identifica potențiali noi antagoniști selectivi pentru M4, ne-am propus să adoptăm o abordare diferită prin crearea unui M4 inactiv indus de mutația concepută rațional N449 7.49 R, care este implicată în buzunarul potențial de legare a Na + din domeniile transmembranare, pentru a stabiliza proteina. Cu încă cinci mutații pentru a ajuta la exprimarea și randamentul proteinelor M4, am determinat în continuare structura cristalină a receptorului M4 inactivat. Prin analiza comparativă a structurii noastre cristaline și a M4 legat de tiotropiu (intrarea PDB 5dsg; Thal și colab., 2016 () și teste funcționale, structura M4 mutantă se arată că este într-o stare inactivă. Screeningul virtual al unei biblioteci de liganzi focalizați folosind structura noastră a arătat că antagoniștii sunt mult mai preferați decât agoniștii și că mutația N449 7.49 R este elementul cheie în prevenirea activării M4. Mai mult, mutația inactivată a fost atât de eficientă încât un ligand co-purificator, strâns legat a fost prins în situl ortosteric.

2. Proceduri experimentale

2.1. Construcție, exprimare și purificare a proteinelor

M4 de tip sălbatic conține o a treia buclă intracelulară lungă, probabil slab ordonată (ICL3), care este o provocare pentru cristalizare. Pentru a atenua această problemă, a fost generată o construcție de proteină de fuziune M4-PGS (Pyrococcus abyssi glicogen sintaza; intrarea PDB 2bfw; Horcajada și colab., 2006 ▸) (Yin și colab., 2016 ()) utilizând PCR suprapus cu șase mutații: I93 2,65 T, G150 4,43 A, I187 ECL2 A, S219 5,62 Y, N449 7,49 R și T459 8,49 E. Constructul a fost donat într-un vector pFastBac1 modificat conținând o etichetă epitop FLAG N-terminală urmată de o etichetă 10 × His. Construcția a inclus un loc de scindare HRV 3C între S21 și S22 în capătul N-terminal. Reziduurile 228-389 din ICL3 au fost înlocuite cu PGS. Proteina M4-PGS modificată a fost exprimată în celule de insecte Super 3 Spodoptera frugiperda (Sf9) utilizând sistemul de expresie Bac-to-Bac Baculovirus (Invitrogen). Celulele Sf9 Super 3 au fost infectate la o densitate celulară de 2-2,5 × 106 celule pe milimetru cu stoc viral cu titru ridicat la o multiplicitate de infecție (MOI) de 5,0. Celulele au fost recoltate prin centrifugare timp de 48 de ore după infecție și depozitate la -80 ° C pentru utilizare ulterioară.

2.2. Cristalizarea în fază cubidică lipidică

Cristalizarea a fost efectuată folosind metoda fazei cubice lipidice (LCP) (Caffrey & Cherezov, 2009 (). M4-PGS concentrat a fost amestecat cu monooleină cu 10% (greutate/greutate) colesterol (Sigma) într-un raport de 2: 3 (greutate) folosind metoda reconstituirii seringii. Amestecul LCP a fost distribuit în picături de 35 nl pe plăci de sticlă și suprapus cu soluție precipitantă de 800 nl folosind un robot NT8 (Formulatrix). Experimentele de cristalizare au fost efectuate în plăci sandwich din sticlă cu 96 de godeuri (dimensiuni moleculare), care au fost ulterior depozitate într-un Rock Imager (Formulatrix) la 20 ° C. Cristalele de M4-PGS au fost obținute din condiții de precipitare constând din hidrogen fosfat de diamoniu 300 mM, 22-26% PEG 300, 0,1 M HEPES sodiu pH 7,8 și au atins o dimensiune completă de 20-30 µm în 4-5 zile, după cum se arată în Fig. Suplimentare. S1.

2.3. Colectarea datelor și determinarea structurii

Datele de difracție cu raze X au fost colectate pe linia fasciculului 41XU la SPring-8 folosind un detector EIGER X 16M (lungimea de undă a razelor X 1.0000 Å). Imaginile de difracție au fost procesate utilizând XDS (Kabsch, 2010) și scalate cu utilități din suita CCP4 (Winn și colab., 2011). Structura a fost rezolvată prin înlocuirea moleculară cu Phaser (McCoy și colab., 2007 folosind) folosind structura M4 - tiotropium (intrarea PDB 5dsg; Thal și colab., 2016 ▸) și structura domeniului PGS (intrarea PDB 2bfw; Horcajada et al., 2006 ▸) ca modele separate pentru proteinele de fuziune M4 și PGS. Rafinarea, reconstruirea și determinarea structurii au fost efectuate folosind Phenix (Liebschner și colab., 2019 (), BUSTER (Smart și colab., 2012 () și Coot (Emsley și colab., 2010 (). Structura a fost completată cu lucrări R și valori libere R de 0,231 și respectiv 0,264. Statisticile de rafinare sunt rezumate în Tabelul 2 ▸ .

masa 2

Valorile dintre paranteze sunt pentru shell-ul cu cea mai mare rezoluție.