Xiang Xiao

o Școală de Inginerie Alimentară și Biologică, Universitatea Jiangsu, Zhenjiang 212013, PR China. E-mail: nc.ude.sju@2102hxz; Fax: + 86-511-88797201; Tel: + 86-511-88797202

Xiaowei Zhang

o Școală de Inginerie Alimentară și Biologică, Universitatea Jiangsu, Zhenjiang 212013, PR China. E-mail: nc.ude.sju@2102hxz; Fax: + 86-511-88797201; Tel: + 86-511-88797202

Caiqin Zhang

o Școală de Inginerie Alimentară și Biologică, Universitatea Jiangsu, Zhenjiang 212013, PR China. E-mail: nc.ude.sju@2102hxz; Fax: + 86-511-88797201; Tel: + 86-511-88797202

Jie Li

o Școală de Inginerie Alimentară și Biologică, Universitatea Jiangsu, Zhenjiang 212013, PR China. E-mail: nc.ude.sju@2102hxz; Fax: + 86-511-88797201; Tel: + 86-511-88797202

Yansheng Zhao

o Școală de Inginerie Alimentară și Biologică, Universitatea Jiangsu, Zhenjiang 212013, PR China. E-mail: nc.ude.sju@2102hxz; Fax: + 86-511-88797201; Tel: + 86-511-88797202

Ying Zhu

o Școală de Inginerie Alimentară și Biologică, Universitatea Jiangsu, Zhenjiang 212013, PR China. E-mail: nc.ude.sju@2102hxz; Fax: + 86-511-88797201; Tel: + 86-511-88797202

Jiayan Zhang

o Școală de Inginerie Alimentară și Biologică, Universitatea Jiangsu, Zhenjiang 212013, PR China. E-mail: nc.ude.sju@2102hxz; Fax: + 86-511-88797201; Tel: + 86-511-88797202

Xinghua Zhou

o Școală de Inginerie Alimentară și Biologică, Universitatea Jiangsu, Zhenjiang 212013, PR China. E-mail: nc.ude.sju@2102hxz; Fax: + 86-511-88797201; Tel: + 86-511-88797202

Date asociate

Abstract

Bisfenolul A (BPA) este un perturbator endocrin tipic. Bisfenolul S (BPS) a fost utilizat pe scară largă ca înlocuitor pentru diverse materiale plastice datorită aplicării limitate a BPA. Cu toate acestea, nu înseamnă că BPS este un înlocuitor sigur din cauza lipsei unei evaluări eficiente a BPS. În acest studiu, modelul clinic al Caenorhabditis elegans (C. elegans) a fost utilizat pentru a studia efectele BPS asupra comportamentului de locomoție, creșterea, reproducerea, durata de viață și sistemul antioxidant. Studiul nostru a constatat că C. elegans expus la 0,01 μM BPS ar fi putut inhiba în mod semnificativ comportamentul și creșterea locomoției, precum și sistemele reproductive și antioxidante deteriorate și durata de viață. Este interesant de observat că, în studiile de expunere multi-generaționale, am constatat că BPS prezintă genotoxicitate complexă. Odată cu transmiterea către descendenți, BPS a arătat o inhibare mai semnificativă a loviturilor capului nematodului, în timp ce efectul asupra corpului se îndoaie și lungimea corpului a fost slăbit treptat. Efectul BPS asupra dimensiunii puietului prezintă reguli diferite în funcție de concentrații diferite și de descendenți. Prin urmare, siguranța BPS necesită în continuare evaluări suplimentare, în special genotoxicitatea multi-generațională.

1. Introducere

Bisfenolul A (BPA), un produs chimic care afectează endocrinul, a fost utilizat pe scară largă în sinteza policarbonatelor și rășinii epoxidice.1-3 BPA este suspectată să afecteze o varietate de funcții fiziologice și să fie asociată cu multe boli umane, cum ar fi diabetul, obezitate, tulburări de reproducere, boli cardiovasculare, malformații congenitale și cancer de sân.4-6 Întrucât dovezi în creștere au arătat efectele negative ale BPA asupra sănătății umane, s-a solicitat eliminarea din produsele de consum.7 Încă din 2009, Canada a fost prima care a interzis utilizarea BPA în produsele pentru bebeluși și bebeluși. Statele Unite (2010), Uniunea Europeană (2011) și China (2011) au urmat exemplul. Franța a început chiar să interzică utilizarea bisfenolului A în materialele de ambalare a alimentelor în 2015-8-10

Studiile au arătat că BPS are proprietăți de estrogen, antiandrogen și hormon anti-tiroidian, care pot afecta în mod negativ sistemul reproductiv, sistemul endocrin și sistemul nervos al C. elegans și al oamenilor și pot provoca stres oxidativ.7 Ullah și colab. a arătat că BPS a cauzat o creștere semnificativă a speciilor reactive de oxigen și peroxidarea lipidelor la testicul de șobolan, în timp ce activitatea enzimei antioxidante și conținutul de proteine ​​au fost semnificativ reduse.26 În mod similar, concentrațiile de testosteron în plasmă și testicul sunt, de asemenea, reduse. Împreună cu modificarea activității sistemului antioxidant și inducerea fragmentării ADN in vitro, BPS a dus la o scădere a producției zilnice de spermă și la deteriorarea semnificativă a ADN-ului in vivo.27,28 Studii recente au arătat că BPS ar putea provoca toxicitate asupra dezvoltării, dezechilibru hormonal și reproducere eșec la peștii zebra adulți.29,30 Expunerea embrionilor F1 la BPS a dus la o eclozare mai scăzută și la rate crescute de malformație comparativ cu cei fără expunere la BPS. sinaptogeneza timpurie și reglarea necorespunzătoare a creierului mai târziu în dezvoltare.32

Odată cu creșterea utilizării BPS, ființele umane au fost expuse în mod constant la un mediu cu BPS, care se dovedește a fi nebeneficient. Există multe indicații că BPS a devenit o „substituție regretabilă”. În comparație cu BPA, BPS are o stabilitate termică mai mare, o permeabilitate mai puternică a pielii și o absorbție mai bună și poate provoca o povară mai mare asupra corpului uman.22,33-35 În prezent, toxicologia BPS nu a fost studiată complet înainte de aplicare, astfel încât siguranța BPS a primit din ce în ce mai multă atenție, în special efectul de toxicitate scăzută al BPS. În acest studiu, BPS a fost expus la C. elegans pentru a studia efectele sale asupra comportamentului de locomoție, creștere, reproducere, durată de viață și stres oxidativ. Efectele genotoxice ale BPS au fost studiate prin expunere multi-generațională. Comparativ cu alte organisme model, C. elegans are avantajele dimensiunilor mici, capacității reproductive puternice, cultivării ușoare și costului redus. elegans este unul dintre modelele clasice de organisme în evaluarea toxicologică, care este sensibil la compușii exogeni. Obiectivul studiului actual este de a evalua mai cuprinzător toxicitatea BPS.

2. Materiale și metode

2.1. Reactivi și tulpini

BPS (puritate ≥ 98%) a fost achiziționat de la Sigma-Aldrich. BPS a fost dizolvat în etanol absolut și s-au obținut diferite soluții originale de BPS. Soluțiile originale BPS au fost diluate la 0,001, 0,01, 0,1, 1, 10 și 100 μM cu tampon M9 înainte de expunere. Toate concentrațiile absolute de etanol au fost 0,1% în soluțiile finale de BPS. C. elegans expuși la 0,1% etanol absolut în tampon M9 au servit drept martor, cunoscut sub numele de doză netoxică de etanol absolut.

Nematodele utilizate în prezentul studiu au fost N2 de tip sălbatic, obținute inițial de la Centrul Genetic Caenorhabditis (CGC). Nematodele au fost menținute pe plăci cu mediu de creștere a nematodelor (NGM) însămânțate cu Escherichia coli OP50 la 20 ° C așa cum este descris în ref. 37. Nematodele Gravid au fost lizate cu un amestec de albire (1 M NaOH, 10% NaHOCl) pentru a obține o populație sincronizată în funcție de vârstă de larve L1. C. elegans a fost expus la BPS din larvele L4 timp de 24 de ore. Pe durata expunerii, soluțiile BPS au fost stabile. Deși nu putem garanta absorbția adecvată a SPB de către nematode, studiul anterior a demonstrat că această cale de expunere pentru administrarea medicamentului a fost eficientă în nematode. dismutază (SOD) și specii de oxigen reactiv intestinal (ROS) ca puncte finale.

2.2. Letalitate

Conform proiectului experimental, BPS a fost dizolvat în etanol absolut pentru a prepara soluția originală la concentrații de 0,25, 0,5, 1, 1,5 și 2 M și apoi a fost diluat cu mediu lichid S pentru a obține concentrațiile finale de BPS de 0,25, 0,5, 1, 1,5 și 2 mM; concentrația finală de etanol în soluția de BPS a fost de 0,1%. Mediul lichid S cu etanol absolut 0,1% a servit drept martor. Deoarece concentrația ridicată de soluție de BPS a fost dificil de diluat, prepararea concentrației ridicate de soluție de BPS a fost asistată de încălzirea cu ultrasunete și baie de apă. O alicotă de 200 μl de soluție de testat pentru BPS a fost adăugată la fiecare godeu al plăcilor cu 96 de godeuri, care au fost ulterior încărcate cu 30 de nematode pentru fiecare concentrație. C. elegans a fost expus de la larvele L4 până în ziua 1, iar cele inactive au fost punctate la microscopul disecant. Nematodele au fost considerate moarte dacă nu au răspuns la un stimul folosind un fir metalic mic.38 Letalitatea nematodelor a fost evaluată prin procentul de supraviețuire al C. elegans. Au fost examinate trei replici per experiment.

2.3. Comportamentul de locomoție

Comportamentul de locomoție a fost evaluat atât prin lovirea capului, cât și prin îndoirea corpului. Pentru a testa thrash-ul capului, nematodele examinate au fost expuse la BPS de la larvele L4 până în ziua 1. Thrash-ul capului, definit ca o schimbare în direcția de îndoire la mijlocul corpului, a fost numărat timp de 1 min. Îndoirea corpului a fost luată în considerare ca o schimbare a direcției părții nematodelor corespunzătoare bulbului posterior al faringelui de-a lungul axei y, presupunând că nematodul se mișca de-a lungul axei x și a fost numărat timp de 20 s. - Au fost examinate 41 de nematode pentru fiecare experiment.

2.4. Analize de modificare a creșterii

Creșterea nematodelor a fost evaluată de lungimea corpului. C. elegans a fost expus la BPS de la larvele L4 până în ziua 1. Au fost făcute fotografii ale nematodelor în ziua 1 a maturității, iar lungimea corpului fiecărui nematod individual a fost analizată folosind software-ul Image J.40 Testul a fost efectuat la de cel puțin 3 ori.

2.5. Testele de reproducere

C. elegans a fost expus la BPS de la larvele L4 până în ziua 1 și apoi transferat individual pe o placă proaspătă în fiecare zi până la încetarea reproducerii. Descendenții lui C. elegans au fost numărați în etapa L3. Testul a fost efectuat de cel puțin 3 ori.42-44

2.6. Testele duratei de viață

Analiza duratei de viață a fost efectuată în același mod pentru toți nematodele la 20 ° C. Nematodele examinate au fost transferate zilnic în noi plăci NGM din ziua 1 până în ziua 4 după ce nematodele au fost expuse acut la BPS. Nematodele ar fi transferate la fiecare 2 zile în plăci noi de NGM din ziua 5. Probele supraviețuitoare de C. elegans au fost numărate zilnic (începând din prima zi a maturității) până când toți nematodele au murit. Probele de C. elegans care nu s-au mișcat când au fost ușor împinse (cu o sârmă de platină) au fost marcate ca moarte. Nematodele care suferă de trapa internă (un defect în depunerea ouălor) și cele care s-au târât de pe placa NGM nu au fost incluse în numărul de durate de viață. 42,45-47 Testele de durată de viață au fost efectuate de cel puțin 3 ori.

2.7. Analiza radicalilor liberi oxidativi intracelulari

Pentru a cuantifica dacă tratamentul BPS examinat a activat daunele oxidative, producția ROS a fost testată. ROS intracelular a fost măsurat folosind diacetat de 2 ', 7'-diclorodihidrofluoresceină (H2DCFDA). DCF-DA non-fluorescent este un colorant permeabil la celule libere, care este ușor convertit în fluorescent 2 ′, 7-diclorofluoresceină (DCF) datorită interacțiunii cu peroxidul intracelular (H2O2). Nematodii expuși la BPS din larva L4 până în ziua 1 au fost transferați în tampon M9 conținând 1 M CM-H2DCFDA pentru a pre-incuba timp de 3 ore la 20 ° C. Nivelul ROS al fiecărui nematod testat a fost detectat utilizând un cititor de microplăci cu fluorescență multifuncțională. Lungimile de undă de excitație și de emisie au fost setate la 485 nm și respectiv 535 nm. Unitatea nivelului ROS este definită ca intensitatea relativă a fluorescenței pe 50 de nematode testate.48 Testul a fost efectuat de cel puțin 3 ori.

2.8. Analiza superoxidului dismutază totală intracelulară

Pentru a cuantifica în continuare dacă tratamentul BPS examinat a activat deteriorarea oxidativă, s-a determinat producția de SOD. Sistemul de reacție xantină și xantină oxidază produce radicali anionici superoxizi (O2 -), care oxidează hidroxilamina formând nitrit, care este roșu-violet sub acțiunea unui dezvoltator de culoare. SOD poate inhiba radicalii anionici superoxizi și reduce formarea de nitriți. Nematodii examinați expuși la BPS din larva L4 până în ziua 1 au fost perturbați ultrasunet și au reacționat cu trusa. După sfârșitul reacției, absorbanța a fost măsurată la o lungime de undă de 550 nm.49 Testul a fost efectuat de cel puțin 3 ori.

2.9. analize statistice

Toate datele au fost exprimate ca medii ± eroare standard a mediei (SEM). Graficele au fost generate folosind GraphPad Primer 7; analiza statistică a fost efectuată utilizând software-ul SPSS 19.0. Analiza unidirecțională a varianței a fost utilizată pentru comparație între grupurile de control și grupurile expuse. Nivelurile de probabilitate de 0,05 și 0,01 au fost considerate semnificative statistic.

3. Rezultate

3.1. LC50 al expunerii acute la BPS la C. elegans

Pentru a investiga efectele toxice ale BPS, LC50 a fost testat prin expunerea acută a BPS la C. elegans timp de 24 de ore. Tabelul 1 prezintă supraviețuirea după expunerea acută la diferite concentrații de BPS. Calculul a fost efectuat folosind modulul PROBIT din software-ul SPSS. Analiza datelor a arătat Sig = 0,000 –1 și transformat în 545,59 mg L –1 .

tabelul 1

Concentrație/mMTotalSupravieţuire
03030
0,253030
0,53026
13022
1.53018
23013

3.2. Efectul BPS asupra comportamentului de locomoție al C. elegans prin expunere acută

Pentru a investiga efectele BPS asupra comportamentului de locomoție al C. elegans prin expunere acută, am analizat efectele BPS asupra loviturilor capului și a îndoirilor corporale ale nematodelor (Fig. 1A și B; date brute, ESI, Tabelul S1 †). BPS ar putea în mod semnificativ (p Fig. 1C (date brute, ESI, Tabelul S2 †) afișează efectul diferitelor concentrații de BPS asupra lungimii corpului C. elegans prin expunere acută. Comparativ cu martorul, lungimea corpului a fost semnificativ (p Fig. 1D; date brute, ESI, tabelul S2 †) Dimensiunea puietului a fost semnificativ (p Fig. 2 (date brute, ESI, tabelul S2 †) Durata de viață a C. elegans a fost semnificativ inhibată în grupurile de expunere de la 0,01 μM la 100 μM. Durata de viață a controlului a fost de 24 de zile, iar durata de viață a fost redusă la 21 de zile când concentrația de BPS era de 0,01 μM. Comparativ cu controlul, durata de viață a fost redusă cu 12,50%. ΜM, durata de viață a nematodelor a scăzut cel mai mult, care a fost redus cu 15,27% comparativ cu martorul.

efectele

Există o relație complexă între creșterea normală și homeostazia hormonului tiroidian, iar distrugerea homeostaziei hormonului tiroidian ar putea afecta creșterea normală și metabolismul vertebratelor.53,63 Am constatat că lungimea corpului C. elegans a fost semnificativ inhibată atunci când concentrația de BPS a fost ≥0,01 μM, care poate fi legată de interferența BPS cu homeostazia hormonului tiroidian. Studiile anterioare au demonstrat că BPA a afectat negativ dezvoltarea post-embrionară prin perturbarea semnalizării hormonului tiroidian la vertebrate.64 Zhang și colab. a arătat că BPS, similar cu BPA, poate inhiba, de asemenea, creșterea și dezvoltarea C. elegans prin interferarea cu calea de semnalizare a semnalizării hormonului tiroidian65.

5. Concluzie

Din câte știm, cercetarea noastră este prima care folosește C. elegans pentru evaluarea siguranței BPS și prima care evaluează efectele genotoxice ale expunerilor multiple la BPS. Studiul nostru demonstrează că BPS ar putea avea un impact negativ asupra comportamentului de locomoție, creșterea, reproducerea, durata de viață și sistemul antioxidant al C. elegans. Este demn de remarcat faptul că, în experimentul de expunere continuă multi-generație, BPS ar putea avea în continuare un efect negativ asupra C. elegans. BPS poate să nu fie un substitut sigur pentru BPA, care poate avea efecte toxice similare cu BPA. Siguranța BPS necesită o evaluare suplimentară, în special efectele potențiale genotoxice.

Conflicte de interes

Autorii declară că nu există conflicte de interese.