ZHEN - PING WANG

1 AGRO Montpellier, UMR 1083 „Științe pentru oenologie și viticultură”, locul 2 P.Viala, F - 34060 Montpellier Cedex 1, Franța

2 Universitatea Ningxia din China, Yinchuan, 750021 Ningxia, China

ALAIN DELOIRE

1 AGRO Montpellier, UMR 1083 „Științe pentru oenologie și viticultură”, locul 2 P.Viala, F - 34060 Montpellier Cedex 1, Franța

ALAIN CARBONNEAU

1 AGRO Montpellier, UMR 1083 „Științe pentru Lenologie și Viticultură”, locul 2 P.Viala, F - 34060 Montpellier Cedex 1, Franța

BRIGITTE FEDERSPIEL

1 AGRO Montpellier, UMR 1083 „Științe pentru oenologie și viticultură”, locul 2 P.Viala, F - 34060 Montpellier Cedex 1, Franța

FRANÇOIS LOPEZ

1 AGRO Montpellier, UMR 1083 „Științe pentru oenologie și viticultură”, locul 2 P.Viala, F - 34060 Montpellier Cedex 1, Franța

Date asociate

Abstract

INTRODUCERE

În ultimele două decenii, după o creștere inițială a interesului pentru mecanismul de încărcare a floemelor în frunze, un număr de oameni de știință și-au îndreptat atenția asupra regiunilor de scufundare a plantei și asupra studiului căii și mecanismelor de descărcare a floemelor. Acum este bine acceptat faptul că regiunile de scufundare ale plantelor exercită o influență considerabilă în determinarea modelului de distribuție fotoasimilat în plante (Ho, 1988; Patrick, 1990, 1997). Descărcarea floemelor a fost definită ca o serie de etape de transport pe care solutele le fac de la lumenul elementului de sită la locurile de utilizare în celulele de chiuvetă ale destinatarului (Oparka, 1990). Este necesar să se investigheze mecanismele descărcării floemelor, astfel încât să se poată determina efectul factorilor de mediu asupra acumulării zahărului în organele de chiuvetă.

În urma transportului pe distanțe lungi în floem, ieșirea fotoasimilărilor din elementele de sită este primul pas dintr-o serie complexă de pași pe distanțe scurte în organele chiuvetei (Oparka, 1990). Unele tehnici au fost descrise pentru studiul specific al descărcării floemului. De exemplu, metoda „strat de semințe goale” sau „gol - ovule” a fost utilizată pentru studiul descărcării floemelor în straturi de semințe (Thorne și Rainbird, 1983; Wolswinkel și Ammerlaan, 1983; Gifford și Thorne, 1986). „Tehnica de descărcare a capcanei” a fost utilizată pentru studiul descărcării floemelor în tuberculi de cartof în creștere (Oparka și Prior, 1987) și mere (Lü și colab., 1999). Aceste metode au dezavantajele amputării floemului și a rănirii țesutului organului de chiuvetă și îngreunează găsirea unei poziții adecvate pentru a se apropia de punctul de descărcare a floemului. „Tehnica discului tisular” a fost utilizată pentru a studia descărcarea fotoasimilată și acumularea și metabolismul zahărului în roșii (Damon și colab., 1988), căpșuni (Ofosu - Anim și Yamaki, 1994) și boabe de struguri (Findlay și colab., 1987). Această metodă poate răni, de asemenea, floema și țesutul înconjurător și nu produce rezultate reproductibile.

O tehnică de identificare izotopică a fost de asemenea utilizată pentru a studia descărcarea floemelor (Thorne și Rainbird, 1983; Wolswinkel și Ammerlaan, 1983; Xia, 1999). Această metodă nu numai că poate modifica mediul în creștere al plantei, dar tehnica este greoaie, costisitoare și necesită disponibilitatea de personal cu înaltă calificare. Prin urmare, am considerat că este important să găsim o nouă tehnică care să ajute la cuantificarea descărcării floemului de zahăr în boabele de struguri (Vitis vinifera L.).

Boabele de struguri prezintă un model dublu sigmoid de dezvoltare, cu două faze distincte de creștere separate printr-o fază de întârziere (Coombe, 1992; Robinson și Davies, 2000). Faza de maturare în maturarea boabelor de struguri are loc în a doua perioadă de creștere și rezultă din expansiunea, fără multiplicare, a celulelor pericarpiene (Ojeda și colab., 2001). Veraison după faza de întârziere este definit ca începutul maturării boabelor și al acumulării zahărului. Această etapă se caracterizează prin înmuierea fructelor de pădure și acumularea de antociani în soiurile de struguri roșii (Coombe, 1992). Acumularea zahărului are loc în timpul fazei de maturare și începe imediat după înmuiere.

În această lucrare, este descrisă o metodă nouă care folosește o cupă de fructe de pădure într-un sistem experimental in vivo pentru a studia descărcarea floemului de zahăr în boabele de struguri coapte. Metoda poate fi, de asemenea, utilizată pentru a studia efectul diferiților factori interni și externi asupra acumulării zahărului în boabele de struguri.

MATERIALE ȘI METODE

Materialul vegetal și condițiile de creștere

Toate experimentele au fost efectuate pe viță de vie Syrah de 12 ani (Vitis vinifera L.), altoite pe portaltoi Fercal, dresate pe lira (denumirea oficială pentru un tip de sistem de antrenare a viței de vie), plantate în ghivece de 70 l în experimentul Ecotron sistem (AGRO-Montpellier, Franța). Rândurile de viță de vie au fost aranjate în orientare nord - sud. Substratul horticol a fost un amestec de perlit și nisip (9: 1 în volum). Fertilizarea și irigarea au fost asigurate de un sistem de irigare prin picurare. Starea apei plantelor a fost controlată de potențialul apei frunzei (Ψb) (Scholander și colab., 1965; Carbonneau, 1998). Ψb a vițelor de control a fost 0 ≥ Ψb ≥ –0 · 2 MPa și –0 · 5 ≥ Ψb ≥ –0 · 6 MPa pentru viile stresate cu apă.

Pregătirea sistemului experimental in vivo a cupei cu fructe de pădure

Experimentul a fost realizat între maturare și maturare. Tulpinile primare bine dezvoltate cu ciorchini de struguri au fost alese din zece viță de vie individuale; o treime din fructe de pădure au fost tăiate pentru a facilita instalarea cupei de fructe de pădure. Cupele cu boabe au fost instalate în centrul ciorchinilor de struguri și s-a ales o boabe aproape de tulpină pentru cupa cu boabe. Părțile de cupă ale configurației cupă-cupă au fost pregătite prin tăierea seringilor din polipropilenă de 20 ml la o înălțime de 2 cm de la gura de ieșire a seringii; capacitatea totală a cupei a fost de 10 ml. Gura de ieșire a seringii a fost conectată la un tub din teflon (TT în Fig. 1) prevăzut cu o supapă (V în Fig. 1) pentru a permite golirea cupei. Cupa a fost umplută cu tampon cu ajutorul unei țevi de injecție (IP în Fig. 1). Suprafața cupei a fost acoperită cu un material burete acoperit cu aluminiu (ACSM în Fig. 1) pentru a proteja cupa de fructe de pădure de lumină și pentru a menține temperatura la 24-30 ° C.

vivo

FIG. 1. Aranjament experimental al sistemului „berry - cup” pentru studiul descărcării floemului de zahăr. ACSM, material burete acoperit cu aluminiu; BF, soluție tampon; C, cupă; DVB, fascicul vascular dorsal; FPS, tulpină primară de rodire; GC, ciorchine de struguri; IP, țeavă de injecție; V, supapă; PF, Parafilm; RBS, pielea de fructe rămasă; TT, tub de teflon.

O mică incizie încrucișată (2 mm lungime) a fost făcută cu un bisturiu pe rămășița stilară, care este punctul de legătură final al fasciculelor vasculare dorsale. Incizia a fost făcută pentru a nu deteriora țesutul pulpar. Pielea de fructe de pădure a fost apoi complet îndepărtată de rămășița stilară cu pensete și foarfece. S-au evaluat diferite soluții tampon pentru a determina tamponul care seamănă cel mai mult cu pH-ul natural și puterea ionică a boabelor de struguri. Tamponul selectat în final a constat din 5 mm 2 (N - morfolino) acid etansulfonic (MES), 2 mm CaCl2, 100 mM d - manitol și 0,2% (g/v) polivinilpirolidonă (PVP), pH 5,5, altfel denumit „tampon MES standard”. Această soluție tampon a fost adăugată într-o ceașcă pregătită, urmată imediat de boabele decojite. Partea superioară a cupei cu boabe a fost apoi sigilată cu Parafilm (PF în Fig. 1). Dacă este necesar, soluția tampon ar putea fi completată prin conducta de injecție (IP în Fig. 1). Pentru a schimba soluțiile tampon, supapa de pe tubul de teflon a fost deschisă și întregul conținut a fost drenat într-o eprubetă. După închiderea supapei, tamponul proaspăt a fost introdus prin conducta de injecție. Soluția tampon ar putea fi înlocuită în maximum 30 s.

Determinarea timpului experimental de colectare

Pentru a determina cât de repede soluția tampon a devenit saturată cu zahăr, au fost preparate 18 cupe de fructe de pădure și împărțite în șase grupuri de trei. Soluția tampon a celor trei cupe de fructe de pădure din primul grup a fost drenată în eprubete după 10 minute și, după 20, 30, 40, 50 și 60 de minute pentru grupele a doua până la a șasea, respectiv. Cele 18 probe au fost apoi congelate la –80 ° C înainte de analiză.

Determinarea cineticii de eflux a zaharurilor in vivo

Pentru a determina cinetica de eflux a zahărului într-o boabă decojită in vivo, soluția tampon a fost înlocuită la fiecare 20 de minute cu soluție tampon proaspătă. Fiecare soluție tampon drenată a constituit o probă. Pentru orice cupă de fructe de pădure, numărul maxim de modificări ale tamponului a fost de șapte, însumând un total de șapte probe pentru fiecare cupă de fructe de pădure într-o perioadă experimentală de 140 de minute. Deoarece în acest experiment au fost preparate trei cupe de fructe de pădure, numărul total de probe a fost de 21. Probele (adică soluțiile tampon scurse) au fost înghețate la –80 ° C înainte de analiză. Acest experiment a fost repetat de trei ori

Pregătirea și tratamentul inhibitorilor metabolici

Variația procentului de descărcare a floemului de zahăr a fost calculată utilizând următoarea expresie:

unde ΔS este modificarea procentului de descărcare a floemului de zahăr; S0 este cantitatea de floem de zahăr descărcat în primele 30 de minute și Sn este cantitatea de floare de zahăr descărcată după n colecții tampon.

Analiza zahărului

Probele colectate au fost decongelate la temperatura camerei (20 ° C) și ajustate la 10 ml cu apă distilată. O alicotă de 50 alil a fost utilizată pentru a determina concentrațiile de zaharoză, d-glucoză și d-fructoză printr-o metodă de set enzimatic (Boehringer Mannheim, Darmstadt, Germania) folosind un spectrofotometru.

Pentru a urmări creșterea boabelor am cântărit probe de 50 de boabe de la populație (mai multe repetări). Cantitatea de descărcare a floemului de zahăr a fost exprimată în termeni de greutate pe gram de boabe proaspete. Nu putem cântări fructele de pădure folosite pentru „cupa de fructe de pădure”, așa că am măsurat diametrul acestora și am cântărit fructele de pădure din populația cu un diametru similar (există o corelație între diametrul fructelor de pădure și greutatea proaspătă; R 2 = 0 · 98).

Efectul stresului apei asupra descărcării zahărului floarei

REZULTATE SI DISCUTII

Sistem experimental pentru studierea descărcării floemelor de zahăr în boabele de struguri coapte

Pentru a investiga în mod fiabil descărcarea floemului de zahăr în boabele de struguri, este esențial să se stabilească un sistem experimental care să nu cauzeze vătămări nici floemului, nici pulpei. De asemenea, este important să se reducă distanța dintre floem și soluția tampon (Thorne, 1985; Ho, 1988).

La fructele de padure mature, pielea poate fi îndepărtată cu ușurință, expunând astfel fasciculele vasculare dorsale. Siturile de descărcare a floemului de zahăr sunt, prin urmare, ușor accesibile prin tampon, care poate modula fluxul de zahăr în floem. În plus, fotoasimilatele descărcate pot fi transportate cu ușurință în soluția tampon din cupa cu fructe de pădure. Proiectarea cupei cu fructe de pădure (Fig. 1) este de așa natură încât operațiunile de colectare și schimbare a soluției tampon sunt realizate ușor și rapid.

Determinarea timpului experimental de colectare

Acumularea de zahăr în soluția tampon a crescut peste 50 de minute, după care soluția a devenit saturată, dovadă fiind nivelarea curbei concentrației zahărului (Fig. 2). Astfel, pentru rezultate fiabile, s-au ales timpi de colectare de 20 sau 30 min în funcție de experimentul individual.

FIG. 2. Conținutul de zahăr tampon în funcție de timpul de prelevare. Soluția tampon a cupei de fructe de pădure devine saturată după 50 de minute. Rezultatele prezentate sunt valorile medii (n = 3 fructe de pădure replicate - cupe) ale efluxului de zahăr (µg g –1 fructe de pădure) din fructele de coajă decojite în soluția tampon.

Cinetica de eflux a zaharurilor dintr-o boabă de struguri in vivo

S-a demonstrat că glucoza și fructoza erau principalele zaharuri din soluția de descărcare a floemului. De asemenea, s-a demonstrat anterior că zahărul descărcat din floem se acumulează în vacuol prin sistemul apoplastic (Gifford și Thorne, 1986; Dreier și colab., 1998). În acest studiu, au fost identificate două faze distincte în cursul timpului de eflux: o scădere rapidă în primele 60 de minute, care, în unele perioade, a prezentat semne de stabilizare după 60 de minute (Fig. 3). Prima fază (0-60 min) este caracterizată prin purjarea apoplastică, iar a doua fază (60-160 min) se caracterizează prin echilibrarea conținutului de zahăr între apoplast și soluția tampon. Sfârșitul purjării apoplastice a fost, de asemenea, însoțit de o creștere tranzitorie a efluxului de zahăr. A doua porțiune a graficului (după săgeată) prezentată în Fig. 3 reprezintă descărcarea floemului în raport cu fotosinteza (relația chiuvetă - sursă), cinetica efluxului a fost determinată în experimentele ulterioare după o purjare apoplastică de 60 de minute (trei modificări ale tamponului, fiecare după 20 de minute).

FIG. 3. Eflux de zaharoză, glucoză și fructoză dintr-o boabă decojită peste 160 min. În primele 60 de minute (săgeată), scăderea efluxului de zahăr corespunde purjării apoplastice. Ulterior, efluxul de zahăr reprezintă descărcarea floemului de zahăr a boabelor de struguri. Rezultatele prezentate sunt valorile medii (n = 3 fructe de pădure replicate - cupe) ale efluxului de zahăr (µg g –1 fructe de pădure) din fructele de coajă decojite în soluția tampon.

Efectul NaF și PCMB asupra descărcării zahărului de boabe de struguri

Fluorura de sodiu (NaF) este un inhibitor al fosfatazei transportului respirator de electroni. Incorporarea a 7,5 m m NaF în soluția tampon inhibă semnificativ descărcarea floemului de zahăr în boabele de struguri (Fig. 4). Aceste rezultate arată, de asemenea, că NaF poate acționa rapid asupra floemului pentru a inhiba producția de energie și că continuă să exercite acest efect inhibitor până la 60 de minute după ce a fost îndepărtat din soluția tampon MES. Aceste descoperiri susțin observația că descărcarea floemului de zahăr este un proces care necesită energie în coacerea boabelor de struguri (Thorne, 1985; Xia, 1999).

FIG. 4. Efectul NaF și PCMB asupra descărcării zahărului în boabe de struguri. ΔS este variația procentuală a descărcării floemului de zahăr. Probele au fost prelevate între 1000 h și 1300 h. Săgețile indică locul în care NaF și PCMB au fost incluse în soluția tampon. Acest grafic arată că NaF și PCMB acționează rapid în inhibarea descărcării zahărului floarei. Rezultatele prezentate sunt valorile medii (n = 3 fructe de pădure replicate - cupe).

PCMB este un compus care modifică grupurile de cisteină. Este liposolubil și modifică grupările tiol atât la suprafață, cât și în membrana plasmatică a țesutului rădăcinii (Wilkinson și Duncan, 1993), a fost folosit anterior pentru a inhiba activitatea enzimei (Wilkinson și Duncan, 1993; Wu și colab., 2000 ).

Figura 4 arată că 2,5 m m PCMB inhibă semnificativ descărcarea floemului de zahăr în boabele de struguri și că continuă să exercite acest efect inhibitor până la 60 de minute după ce a fost îndepărtat din soluția tampon MES. Aceste rezultate demonstrează că descărcarea zahărului floarei este un proces care implică un transportor de zahăr și intervenția enzimelor (Fillon și colab., 1999; Patrick și Offler, 1996). Inhibarea transportorului de zahăr produs de PCMB nu a fost inversată prin imersie în soluție tampon MES proaspătă timp de 60 de minute.

Efectul stresului apei asupra descărcării zahărului floarei

Stresul hidric poate afecta rata de fotosinteză a plantelor, conductanța stomatală, conținutul de acid abscisic și potențialul osmotic; poate afecta și translocația fotoasimilată (Rodrigues și colab., 1993; Winkel și Rambal, 1993; Clifford, 1998; Flexas și colab., 1998, 1999; Yakushiji, 1998; Escalona și colab., 1999; Kobashi, 2000; Peterlunger și colab.) al. al., 2000). În timpul maturării, stresul hidric moderat întârzie creșterea secundară a lăstarilor fără a afecta în mod deosebit activitatea fotosintetică (Carbonneau și Deloire, 2001), favorizând astfel redistribuirea zahărului în fructe de pădure și în organele perene. Cu toate acestea, stresul sever al apei poate inhiba acumularea zahărului în boabele de struguri. Descărcarea floemului de zahăr este primul pas în acumularea zahărului în organul de chiuvetă (Thorne, 1985; Oparka, 1990; Patrick, 1990, 1997). Figura Figura 5 arată că boabele de viță-de-vie supuse stresului de apă (echivalent cu aproximativ Ψb ≈ –0 · 5 MPa) au acumulat mai puțin zahăr decât vițele martor (Ψb ≈ –0 · 2 MPa); acest efect a fost observat în principal după 1300 ore. Pentru orice volum dat de fructe de pădure, concentrația de zahăr din strugurii supuși stresului de apă este mai mică decât cea a martorului. Această constatare coincide cu observațiile anterioare referitoare la efectul stresului apei asupra fotosintezei viței de vie (datele neprezentate) și demonstrează în continuare adecvarea sistemului de cupă de fructe de pădure pentru a studia efectele factorilor de mediu sau inhibiția chimică asupra acumulării zahărului la maturare. boabe de struguri.

FIG. 5. Efectul stresului apei asupra descărcării zahărului în boabele de struguri la 82 de zile după anteze. Stresul de apă aplicat viței de vie pare să inhibe descărcarea floemului de zahăr în boabele de struguri în timpul zilei, în principal după 1300 de ore. în raport cu o reducere semnificativă a activității de fotosinteză. Rezultatele prezentate sunt valorile medii (n = 3 fructe de pădure replicate - cupe) ale efluxului de zahăr (µg g –1 fructe de pădure) din fructele de coajă decojite în soluția tampon.

CONCLUZIE

Sistemul experimental in vivo de cupă cu fructe de pădure este o tehnică utilă pentru a studia descărcarea floemului de zahăr și acumularea de zahăr în boabele de struguri coapte. Conținutul de zahăr din soluția tampon este o măsură realistă a descărcării floemului după 60 de minute de purjare apoplastică. Ulterior, soluția tampon devine saturată cu zahăr numai după aprox. 50 min. Astfel, perioada optimă de timp dintre modificările tamponului a fost considerată a fi de 20 sau 30 de minute (în funcție de tipul de experiment). Acest sistem experimental poate fi utilizat nu numai pentru a studia mecanismul descărcării floemului de zahăr, ci și pentru a studia efectul factorilor de mediu sau al inhibării chimice asupra acumulării zahărului în boabele de struguri coapte. Descărcarea floemului de zahăr în boabele de struguri coapte se dovedește a fi prin rețeaua apoplastică și că procesul necesită un transportor de zahăr, intervenția enzimelor și o sursă de energie. Această tehnică de cupă cu fructe de pădure este folosită în prezent pentru a investiga descărcarea zahărului în raport atât cu starea hidrică a viței de vie (alimentarea cu apă), cât și cu interceptarea razelor solare (cererea de apă).

MULȚUMIRI

Autorii îi mulțumesc lui Mary Kelly (Facultatea de Farmacie, Montpellier, Franța) pentru asistența în limba engleză în acest manuscris și pentru corectura textului. Mulțumim, de asemenea, lui Christian Bedes pentru asistență tehnică în podgorie.

Material suplimentar

Note

Primit: 31 ianuarie 2003; Retur pentru revizuire: 28 aprilie 2003; Acceptat: 10 iunie 2003 Publicat electronic: 7 august 2003