• Găsiți acest autor pe Google Scholar
  • Găsiți acest autor pe PubMed
  • Căutați acest autor pe acest site
  • Înregistrare ORCID pentru João M.N. Duarte
  • Pentru corespondență: [email protected]

Abstract

Introducere

Funcția creierului necesită furnizarea continuă de glucoză (Sonnay și colab., 2017), care este asigurată de o rețea de detectare a glucozei în mai multe regiuni ale creierului (Pozo & Claret, 2018). Hipotalamusul este esențial în sensul central al glucozei, pe lângă controlul altor funcții de bază ale vieții, cum ar fi comportamentul de hrănire, termoreglare, somn sau răspuns la frică (Pozo & Claret, 2018; Timper & Brüning, 2017). Diferitele nuclee hipotalamice sunt implicate în reglarea metabolismului periferic pentru menținerea homeostaziei glucozei (figura 1), și anume nucleul arcuat (ARC), hipotalamusul lateral (LH), nucleul ventromedial (VMN), nucleul dorsomedial (DMN) și nucleul paraventricular. (PVN) (Yeo & Heisler, 2012). ARC și VMN, precum și trunchiul cerebral și structurile corticolimbice, conțin neuroni sensibili la glucoză (Pozo & Claret, 2018): niveluri ridicate de glucoză depolarizează neuronii excitați de glucoză prin glucokinază (GK) și închiderea mediată de ATP a K + sensibil la ATP și o concentrație scăzută de glucoză depolarizează neuronii inhibați de glucoză și anume prin închiderea canalelor Cl - dependente de AMPK.

studiu

Reprezentarea schematică a activării nucleilor hipotalamici ca răspuns la glucoză. Abrevieri: PVN, nucleu paraventricular; DMN, nucleu dorsomedial; ARC, nucleu arcuat; LH, hipotalamus lateral; VMN, nucleu ventromedial; 3V, al treilea ventricul.

Cheia controlului apetitului, consumului de energie și homeostaziei glucozei este reglarea hormonală a sistemului melanocortin, care constă din două populații neuronale funcționale antagoniste din ARC (Pozo & Claret, 2018; Timper & Brüning, 2017): un subset de neuroni exprimă neuropeptidele orexigenice (stimulatoare ale apetitului) peptida asociată agouti (AgRP) și neuropeptida Y (NPY), al doilea subset exprimă peptidele anorexigenice (suprimarea apetitului) pro-opiomelanocortină (POMC) și transcriptul reglementat de cocaină și amfetamină) Aceste semnale sunt apoi integrate de neuroni secundari în alte nuclee hipotalamice, și anume PVN, VMN, DMN și LH, precum și în zone extrahipotalamice (Timper & Brüning, 2017). Neuronii ARC primesc, de asemenea, feedback de la alți nuclei hipotalamici, rezultând un răspuns fin reglat la controlul consumului de alimente (Waterson și Horvath, 2015).

Sindromul metabolic și obezitatea sunt asociate cu disfuncție hipotalamică prin mecanisme care includ neuroinflamarea și rezistența ulterioară la insulină și leptină a neuronilor, care perturbă detectarea indicilor metabolici și promovează în continuare aportul de alimente și creșterea în greutate corporală (Timper & Brüning, 2017). Inflamația hipotalamică este de fapt un eveniment timpuriu în dezvoltarea sindromului metabolic la supraalimentare, iar șoarecii expuși la o dietă bogată în grăsimi prezintă un răspuns inflamator într-o zi, care se propune să joace un rol important în procesul neurotegenerativ hipotalamic ulterior (de ex. Thaler și colab., 2012). Prin urmare, am investigat în continuare impactul expunerii pe termen scurt a dietelor bogate în grăsimi și bogate în zaharoză (HFHSD) asupra răspunsului hipotalamic detectat fMRI la glucoză.

Pe scurt, scopul acestei lucrări este de două ori: (i) dezvoltarea unei paradigme pentru evaluarea neinvazivă a funcționării hipotalamice la șoareci; (ii) cartografierea disfuncției hipotalamice după alimentarea pe termen scurt cu conținut ridicat de grăsimi și zahăr ridicat.

Material si metode

Animale

Toate procedurile pe animale au fost aprobate de Comitetul Malmö/Lund pentru etica experimentelor pe animale (numărul permisului 994/2018) și sunt raportate în conformitate cu liniile directoare ARRIVE (Animal Research: Reporting In Vivo Experiments, inițiativa NC3Rs, Marea Britanie). Șoarecii masculi C57BL/6J au fost obținuți de la Taconic (Ry, Danemarca) la vârsta de 8 săptămâni și li s-a permis să se aclimatizeze la unitatea animală timp de o săptămână. Șoarecii au fost adăpostiți în grupuri de 4-5 persoane într-un ciclu de lumină-întuneric de 12 ore, cu luminile aprinse la 07:00, temperatura camerei la 21-23 ° C, umiditatea la 55-60% și accesul la apă de la robinet și la anunț libitum. Controalele au fost hrănite cu o dietă cu conținut scăzut de grăsimi cu 10% kcal din grăsimi, 20% kcal din proteine ​​și 70% kcal din carbohidrați (D12450J, Research Diets, New Brunswick, NJ, SUA). Șoarecii expuși la HFHSD au fost hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi cu 60% kcal din grăsimi, 20% kcal din proteine ​​și 20% kcal din carbohidrați (D12492, Research Diets) și au fost, de asemenea, suplimentați cu o zaharoză de 20% (g/v) soluție pe lângă apa de la robinet. Mărimea eșantionului pentru acest studiu a fost estimată cu metoda ecuației resurselor (Festing & Altman, 2002).

Test de toleranță la glucoză (GTT)

Animalele au fost postite timp de 6-8 ore începând cu ora 7:00 și apoi au primit o încărcătură de glucoză i.p. (2 g/kg; preparat ca soluție 20% (greutate/volum) în soluție salină sterilă, BRAUN, Melsungen, Germania). Glicemia a fost monitorizată cu un glucometru (Accu-check Aviva, Roche, Stockholm, Suedia) din probe de sânge de tip 1-uL de coadă înainte de încărcarea glucozei și apoi la 15, 30, 60, 90 și 120 de minute (Soares și colab., 2018). O probă de sânge de 20 µL a fost colectată din vena safenă pentru cuantificarea insulinei în post (trusa ELISA # 10-1247-01 de la Mercodia, Uppsala, Suedia).

Experimente RMN

În ziua scanării, accesul la alimente a fost încheiat la ora 8:00, iar experimentele au avut loc de la 14:00 la 16:00.

Șoarecii au fost anesteziați cu izofluran prin inducție la 3,5% și menținerea la 2% vaporizată într-un amestec 1: 2 O2: N2O gazos. O linie PE50 (Warner Instruments, Hamden, CT-SUA) a fost introdusă în traheea șoarecelui pentru ventilație mecanică și o canulă a fost plasată i.p pentru glucoză sau infuzie de vehicul. Apoi șoarecii au fost poziționați pe patul compatibil MR cu o bară de dinți și două bare de urechi pentru fixarea capului stereotaxic. Mouse-ul a fost apoi montat într-o mască de construcție a casei care a conectat linia traheală la ventilatorul mecanic compatibil MR (MRI-1, CWE, Ardmore, PA, SUA). Când respirația a fost asistată de ventilație mecanică, șoarecii au primit un i.p. injectarea a 0,1 g/kg de bromură de pancuroniu (Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germania) diluată în soluție salină. Rata de ventilație a fost menținută la 90 de respirații pe minut, cu un volum de 1,9-2,2 ml și o rată de inspirație de 50%. Nivelul de izofluran a fost apoi redus la 0,7% (Sonnay și colab., 2018), iar șoarecii au fost apoi introduși în scanerul RMN. Temperatura corpului a fost monitorizată continuu cu o sondă de temperatură rectală (SA Instruments, Stony Brook, NY, SUA) și menținută la 36-37 ° C cu un sistem de circulație a apei calde. Rata de respirație a fost confirmată și de sistemul de monitorizare SA Instruments.

Experimente simulate în afara scanerului au fost efectuate la 2 șoareci pentru a determina profilul glicemic tipic în timpul paradigmei fMRI indusă de glucoză. Glucoza a fost determinată din probe de sânge de tip coadă.

analiza datelor fMRI

Imaginile EPI au fost reconstituite și corectate pentru mișcare folosind SPM12 (Statistical Parametric Mapping, Londra, Marea Britanie), iar semnalul mediu din regiunile de interes predefinite (ROI) din hipotalamus au fost extrase (Sonnay și colab., 2016). Și anume, hipotalamusul a fost separat în patru ROI diferite: nucleul dorsomedial (DMN), nucleul paraventricular (PVN), nucleul arcuat (ARC) și în cele din urmă hipotalamusul lateral (LH) plus nucleul ventromedial (VMN), din care semnalul mediu a fost extras. Semnalele de la LH și VMN au fost analizate ca un singur ROI din cauza lipsei de contrast asupra imaginilor anatomice și funcționale (LH + VMN). Pentru fiecare experiment, semnalul mediu a fost extras din cele patru ROI utilizând setul de instrumente SPM MarsBar (Brett și colab., 2002) și s-a normalizat la semnalul mediu în timpul celor 2 minute înainte de perfuzia cu glucoză (semnal de bază).

Imunodetectarea activării neuronale induse de glucoză

Șoarecii ținuți în dietă martor (n = 8) sau HFHSD (n = 8) timp de 7 zile au fost postiti ca mai sus, anesteziați cu 1,5-2% izofluran și apoi li s-au administrat 2,6 g/kg glucoză ip. După 20 de minute, jumătate din animalele au fost sacrificate prin decapitare, creierul a fost îndepărtat rapid și hipotalamusul a fost disecat, înghețat în N2 (l) și apoi extras pentru Western Blot ca anterior (Soares și colab., 2019). Animalele rămase au fost sacrificate prin perfuzie cardiacă cu soluție salină tamponată cu fosfat rece (PBS; în mmol/L: 137 NaCI, 2,7 KCl, 1,5 KH2PO4, 8,1 Na2HPO4, pH 7,4) și apoi 4% para-formaldehidă (PFA) rece în soluție salină (Duarte și colab., 2012).

Analiza Western blot a fost efectuată conform detaliilor anterioare (Lizarbe, Soares și colab., 2019) folosind anticorpi împotriva proteinei de legare a elementelor de răspuns cAMP (CREB; clona LB9, produsă la șoarece, # ab178322, AbCam, Cambridge, Marea Britanie; RRID: AB_2827810 ), phospho-CREB (Ser133) conjugat cu AlexaFluor488 (produs la iepure, # 06-519-AF488, Milipore, Temecula, CA, SUA; RRID: AB_310153), c-fos (produs la iepure, # SAB2100833, Sigma-Aldrich; RRID: AB_10600287) și β-actină conjugată cu peroxidază de hrean (produsă la șoarece, # A3854, Sigma-Aldrich; RRID: AB_262011). Anticorpii secundari au fost conjugați cu peroxidază de hrean: IgG anti-iepure de capră (# ab6721, AbCam; RRID: AB_955447); IgG anti-șoarece de capră, # ab6789, AbCam; RRID: AB_955439).

Creierele pentru microscopie au fost procesate așa cum s-a descris anterior (Duarte și colab., 2012). Pe scurt, creierele au fost fixate în formaldehidă tamponată cu fosfat (Histolab, Askim, Suedia) și apoi stocate la 4 ° C într-o soluție de zaharoză 30% în PBS. Imunomarcarea a fost efectuată pe felii de creier coronal secționate cu criostat de 20 μm. Feliile au fost incubate timp de 1 oră la temperatura camerei cu tampon de blocare (PBS conținând 5% ser normal de capră, 1% BSA și 0,3% Triton X-100) și apoi peste noapte la 4 ° C cu anticorpul conjugat AlexaFluor488 împotriva fosforului-CREB (1:50 în tampon de blocare). După spălare în PBS, feliile au fost montate cu ProLong Glass Antifade (Invitrogen) și examinate sub un microscop confocal Nikon A1RHD cu un obiectiv 20x Plan Apo, NA 0,75 (Nikon Instruments, Tokyo, Japonia). Imaginile au fost achiziționate cu elemente NIS, versiunea: 5.20.01 (Laboratory Imaging, Nikon). Imaginile au fost procesate pentru numărarea nucleelor ​​în ImageJ (NIH, Bethesda, MD, SUA).

Statistici

(A) Localizarea regiunilor hipotalamice analizate suprapuse pe imaginile ponderate T2 dintr-un creier de șoarece: PVN, nucleu paraventricular; DMN, nucleu dorsomedial; ARC, nucleu arcuat; LH, hipotalamus lateral; VMN, nucleu ventromedial. Dat fiind contrastul insuficient pentru a distinge VMN și LH, voxelurile lor au fost analizate împreună ca LH + VMN. PVN, DMN și ARC au fost definite ca fiind voxelurile din vecinătatea celui de-al treilea ventricul. (B) contrast tipic ponderat T2 * în feliile GE-EPI care cuprind hipotalamusul. (C) Răspunsul fMRI BOLD indus de glucoză în hipotalamusul a 4 șoareci nu este observabil într-un ROI de dimensiuni similare plasat în cortex (prezentat ca medie ± SEM). Insectele arată urmele de la fiecare șoarece. Infuzia de glucoză timp de 3 minute (2,6 g/kg) este indicată de bara orizontală. (D) Nivelurile de glucoză din sânge înainte (pre) și după (post) experimentul fMRI (stânga) și în 2 experimente în condiții identice, dar în afara scanerului.

Confirmând o perfuzie eficientă, glicemia măsurată din tipul cozii a crescut de la 11,5 ± 1,6 mmol/L înainte de experimentul fMRI la 27,2 ± 2,1 mmol/L la sfârșitul scanării (interval de 2-3 ori mai mare; P = 0,002 ). Această creștere a glicemiei la i.p. administrarea este probabil liniară în timpul celor 15 minute de experiment, după cum este reprodus în două teste pe bancă (figura 2D).

O derivație continuă a semnalului BOLD (± 1% la 15 minute) a fost observată pe creierul șoarecelui (figura 2C). Aceasta a fost de o magnitudine mult mai mică decât scăderea semnalului după administrarea glucozei și a fost observată și în hipotalamus la perfuzie salină (figura 3A). Prin urmare, s-ar putea ca o mică parte din răspunsul hipotalamic indus de glucoză estimat să includă o derivare a semnalului independentă de glucoză.

Activarea neuronală indusă de glucoză descrisă de fosforilarea CREB și niveluri crescute de c-fos în hipotalamus. Reduceri asociate cu HFHSD ale numărului de nuclee pCREB-pozitive au fost observate în ARC, VMN și DMN (A). Imunoblotarea a confirmat fosforilarea CREB redusă (B) și nivelurile reduse de c-phos (C) în hipotalamusul șoarecilor alimentați cu HFHSD (bare roșii/triunghiuri) față de martori (bare albastre/cercuri). Rezultatele sunt medii ± SEM de n = 3-4 și sunt reprezentate grafic prezentând fiecare punct de date experimental. * P AgRP agept-related peptide AMPK AMP-protein protein kinase ARC arcuate nucleu BOLD sânge nivel oxigen dependent CART cocaină și amfetamină transcript reglementat CREB cAMP răspuns element-legare proteină DMN nucleu dorsomedial RMN funcțional imagistică prin rezonanță magnetică FOV câmp vizual LH lateral hipotalamus MC4R melanocortină 4 NPY neuropeptidă Y POMC pro-opiomelanocortină PVN nucleu paraventricular T2D tip 2 diabet TE ecou timp TR timp de repetare VMN nucleu ventromedial VOI volum de interes.