ABSTRACT

IMPORTANŢĂ Recunoașterea apariției bolilor la animale sălbatice este un eveniment rar. Aici, pentru prima dată, identificăm și caracterizăm un virus al tulburării canine (CDV), a doua cauză cea mai frecventă de deces al bolilor infecțioase la câinii domestici și o boală virală de importanță globală în carnivorele comune și pe cale de dispariție, ca etiologie a bolii neurologice. și encefalită fatală la tigrii Amur sălbatici, pe cale de dispariție. Am stabilit că în 2010 CDV a fost ucis direct sau indirect

distemper

1% din tigrii Amur. Localizarea cazurilor pozitive într-o zonă geografică extinsă sugerează că CDV este larg distribuit în gama tigru. Interacțiunile între specii sunt în creștere pe măsură ce populațiile umane cresc și se extind în habitate sălbatice. Identificarea rezervoarelor de animale pentru CDV și identificarea tulpinilor CDV care sunt transmisibile către și printre speciile faunei sălbatice, inclusiv tigrii Amur și leopardii Amur simpatrici în pericol critic (Panthera pardus orientalis), este esențială pentru ghidarea eforturilor de conservare și atenuare.

Observare

Țesuturile colectate în timpul procedurilor de necropsie de la cinci tigri adulți, liberi, care au murit în mod natural sau au fost distruse în RFE în 2001, 2004 sau 2010 au fost disponibile pentru histopatologie, colorare IHC, hibridizare in situ (ISH) și transcripție inversă-PCR ( Testarea RT-PCR). Țesutul cerebral, critic în evaluarea infecției cu CDV, a fost disponibil de la doi tigri (Pt2004 și Pt2010-3); plămânul, un sit principal al replicării CDV, a fost disponibil de la toți tigrii.

Prelucrarea histologică a țesuturilor fixate în formalină a fost efectuată folosind metode de rutină. Cinci până la optsprezece din douăzeci și două de tipuri de țesuturi diferite (țesut adipos, glandă suprarenală, arteră, creier, inimă, rinichi, intestin gros, ficat, plămân, ganglion limfatic, ovar, pancreas, nerv periferic, glandă salivară, mușchi scheletic, splină, stomac, intestin subțire, testicul, limbă, trahee sau vezică urinară) au fost disponibile de la fiecare animal pentru examinare histologică. Microscopia cu câmp luminos a fost efectuată folosind un microscop Leica DM2500 (Leica Microsystems Wetzlar GmbH, Wetzlar, Germania).

IHC pentru antigenul virusului tulburător canin a fost efectuat utilizând un anticorp monoclonal primar anti-CDV IgG1 monoclonal de suprafață, așa cum s-a descris anterior și a inclus martori pozitivi și negativi (5). Microscopia cu câmp luminos a fost efectuată așa cum s-a descris mai sus.

Pentru ISH, sondele pentru o regiune nucleotidică de 600 bp a genei fosfoproteinei (P) a virusului distemperului canin au fost proiectate de Panomics (Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA). Această regiune corespunde nucleotidelor 1926-2526 ale genomului CDV (acces GenBank nr. AF378705). ISH folosind colorarea Fast Red a fost efectuată folosind kitul Panomics QuantiGene View RNA pentru secțiuni încorporate în parafină fixate în formalină conform protocolului producătorului (produsul QV0050, QuantiGene ViewRNA FFPE; Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA,) și așa cum a fost descris anterior (7). Secțiunile au fost contracolorate cu hematoxilină. Secțiunile duplicate au fost rulate fără sondă ca un control negativ. Microscopia cu câmp luminos a fost efectuată așa cum s-a descris mai sus.

Pentru a determina relațiile filogenetice ale CDV-urilor tigru între ele și cu alți virusuri și morbillivirusuri CDV, s-au aliniat secvențe de nucleotide pentru genele P și H de la tigri și tulpini CDV reprezentative (GenBank, Centrul Național pentru Informații despre Biotehnologie; http: // www .ncbi.nlm.nih.gov) (software Geneious Pro 5.1.7; Biomatters Ltd., Auckland, Noua Zeelandă). Identitățile perechi au fost obținute prin analiza PAUP pentru a crea o matrice de comparație în perechi la distanță P (plugin PAUP în Geneious Pro). Analiza bayesiană a fost efectuată utilizând pluginul MrBayes 3.1 în Geneious Pro folosind variația ratei distribuite gamma și un model de substituție HKY85 (8). Primii 25% dintr-o lungime a lanțului de 1.100.000 au fost aruncați ca arsuri și 4 lanțuri încălzite au fost rulate cu o frecvență de sub-eșantionare de 200. Virusul Rinderpest (nr. De acces AF132934) a fost folosit ca un grup excesiv. Copacii au fost finalizați și etichetați (software FigTree v1.3.1 [Andrew Rambaut, Institutul de Biologie Evolutivă, Universitatea din Edinburgh, 2006 - 2009; http://tree.bio.ed.ac.uk/]). Au fost calculate valorile probabilității posterioare.

Între ianuarie și iunie 2010, trei tigri Amur adulți (Panthera tigris altaica) (Pt2010-1, Pt2010-2 și Pt2010-3) au intrat în sate din RFE (Fig. 1A și B). Fiecare a fost ucis (Pt2010-1 și Pt2010-3) sau a murit în mod natural (Pt-2010-2) după ce a prezentat un comportament neurologic anormal (dezorientare, lipsă de răspuns la stimulare și/sau neînfricare neagresivă). Înainte de 2010, alți doi tigri Amur liberi (Pt2001 și Pt2004) au fost capturați și au murit după ce au prezentat un comportament neurologic similar (Fig. 1A și B). Patru din cei cinci tigri au fost slăbiți sau au prezentat o pierdere extremă în greutate în momentul decesului (Fig. 1B).

Distribuția geografică (A) și informațiile istorice (B) pentru tigrii din Extremul Orient rus care au murit sau au fost uciși din cauza comportamentului neurologic anormal în 2001, 2004 sau 2010. (C) Tiger Pt2010-3: hematoxilină-și-eozină- secțiunea colorată a creierului cu incluziuni virale eozinofile intranucleare neuronale (săgeată). (D) Tiger Pt2010-3: colorare imunohistochimică pozitivă a neuronilor cu anticorp primar monoclonal IgG la antigenul proteinei învelișului viral CDV (săgeți) (colorare rapidă roșie). (E și F) Hibridizare pozitivă in situ (roșu rapid) a sondelor la secvența genei CDV P în neuronii infectați cu CDV în tigru Pt2004 (E) și tigru Pt2010-3 (F). Bară = 50 µm în toate imaginile.

Țesutul cerebral a fost disponibil din Pt2010-3 și Pt2004 (histologia și IHC pentru acestea din urmă au fost raportate anterior [5], iar țesutul a fost reprocesat și revizuit pentru acest articol). Leziunile histologice din creier au fost identice și au constat în encefalită virală nesupurativă cu demielinizare severă. Au fost observate, de asemenea, incluziuni virale nucleare și celule gliale puternic eozinofile și colorare imunohistochimică pozitivă în aceste tipuri de celule pentru o componentă a plicului CDV (Fig. 1C și respectiv D). Constatările au fost severe și au fost suficiente pentru a duce la comportamentul neurologic observat clinic în ambele cazuri și la moartea naturală în Pt2004 (5). S-a observat depleție limfoidă ușoară sau moderată în ganglionii limfatici ai Pt2010-1 și, respectiv, Pt2001, iar depleția limfoidă moderată a fost observată în spline din Pt-2001, Pt2004 și Pt2010-1. ARN-ul viral intralesional a fost confirmat în ambele creiere de tigru folosind ISH la un segment de 600-bp al genei CDV P (Fig. 1E și F). Incluziunile virale, colorarea IHC sau ISH în concordanță cu infecția cu CDV nu au fost observate în țesuturile neuronale, inclusiv în țesuturile pulmonare sau limfoide, de la niciunul dintre tigri (date neprezentate). Boli infecțioase transmisibile concomitente nu au fost observate.

ARN-ul extras din țesuturile selectate cu parafină fixate în formalină (FFPE) a fost analizat prin RT-PCR pentru morbillivirus și genele fosfoproteinei CDV și P folosind mai multe seturi de primer. Rezultate pozitive au fost obținute la 3 din 5 tigri: Pt2004 (descriere histologică și IHC raportată anterior [5]), Pt2010-2 și Pt-2010-3. Produsele genei CDV P variind în mărime de la 114 pb la 430 pb și un produs genetic H 291-pb au fost recuperate din creierele Pt2004 și Pt2010-3. În Pt2010-2, țesutul ganglionar a fost pozitiv pentru un fragment de 114-pb din gena CDV P și a fost negativ pentru gena H. Motivele posibile pentru eșecul recuperării secvenței genei H de la acest tigru includ degradarea ARN datorită autolizei și/sau reticulării datorită fixării formalinei și/sau fixării prelungite a formalinei înainte de RT-PCR. Pe lângă posibilitatea unor adevărate negative, aceste complicații ar fi putut împiedica identificarea cazurilor pozitive în rândul celor doi tigri rămași (Pt2001 și Pt2010-1) sau a țesuturilor suplimentare în cazurile pozitive. Neavând acces la creier, țesutul țintă optim la acești tigri neurologici, poate explica, de asemenea, eșecul identificării unor tigri pozitivi suplimentari.

Secvențele de produse genice din Pt2004, Pt2010-2 și Pt2010-3 au fost aliniate cu secvențe de morbillivirusuri reprezentative, secvențe CDV și una cu alta. Alinierile de morbillivirusuri și tulpini de CDV au fost distribuite așa cum era de așteptat în clade virale și grupuri de distribuție geografică pentru Asia, Africa, Europa și America de Nord. Segmentele genei H din Pt2004 și Pt2010-3 au fost 99,3% identice între ele (Fig. 2B). Analiza filogenetică a segregat secvențele genei H și P tigru în tulpinile asemănătoare arctice (Fig. 2A, filogenia genei H; filogenia genei P nu este prezentată). Analiza matricială la distanță BLASTn și PAUP a arătat segmente genetice CDV H tigru având identitatea cea mai apropiată (97,9%) de tulpina CDV asemănătoare Arcticului 18133 (9) și o tulpină de focă Baikal (Phoca siberica) (10) (Fig. 2B). Rezultatele noastre indică faptul că tigrul CDV este o tulpină asemănătoare Arcticii asemănătoare cu cele din Groenlanda (11), China (12), Rusia (10) și Statele Unite (9).

(A) Arborele filogenetic bayesian al alinierii nucleotidelor genei H de la tigrii Pt2004 și Pt2010-3 și secvențe CDV reprezentative obținute de la GenBank. Secvențele au fost aliniate utilizând software-ul Geneious Pro. Probabilitățile bayesiene posterioare de ramificare demonstrează robustețea grupurilor individuale. (B) Analiza matricială la distanță a secvențelor genei CDV H. Identități perechi de secvențe de nucleotide și aminoacizi (boldface) între diferite tulpini de CDV au fost obținute prin GenBank și generate dintr-o matrice de distanță pereche calculată utilizând software-ul PAUP.

CDV este a doua cauză cea mai frecventă de deces prin boli infecțioase la câinii domestici și este o boală virală semnificativă de importanță globală în carnivorele sălbatice comune și pe cale de dispariție (15). Este un agent patogen multihost și interacțiunile cu și transmiterea bolii de la specii abundente de rezervoare de animale sălbatice, cum ar fi câinii raton (Nyctereutes procyonoides) sau câinii domestici, sunt probabil la fel de importante, dacă nu chiar mai importante, pentru transmiterea bolii și efectul populației decât infecția. numai printre tigri datorită numărului scăzut de tigri și densității populației (16). În RFE, se pare că se știe puțin despre distribuția și tulpinile de CDV care circulă la câinii domestici și la animale sălbatice. Cu toate acestea, identificarea cazurilor CDV pozitive de tigru separate de 200 km până la 300 km sugerează o distribuție largă pentru tulpina CDV asemănătoare Arcticii care infectează și ucide tigrii Amur.

Ratele mici de vaccinare și infecție cu CDV sunt prezente la câinii domestici din Rusia, iar transmiterea directă a CDV de la câinii infectați, nevaccinați la tigri este o preocupare semnificativă, deoarece se știe că tigrii Amur întâlnesc și ucid câini domestici (17). Într-un sondaj, doar 16% dintre câinii din sat au fost vaccinați împotriva CDV și 58% dintre câinii nevaccinați au fost seropozitivi pentru anticorpi la virus, indicând o expunere endemică ridicată (18). În același raport, 15% din tigrii sălbatici (n = 40) eșantionați între 2000 și 2004 au fost seropozitivi pentru anticorpii CDV, fără tigri seropozitivi detectați înainte de 2000 (n = 27) (18); atât Pt2004, cât și Pt2010-3 au fost seropozitive pentru anticorpii la CDV (1: 256; neutralizare a virusului [VN] ≥ 1: 4 valoare prag pozitivă) două (5) și trei (date neprezentate), respectiv, luni, înainte de decesul lor.

Studiul nostru este primul care confirmă și caracterizează genetic un CDV care ucide tigrii Amur sălbatici, pe cale de dispariție, în RFE. Rezultatele noastre indică faptul că CDV-ul tigru este o tulpină asemănătoare Arcticii, similară cu CDV la focile Baikal din Rusia și câinii domestici. Raportul nostru ilustrează importanța monitorizării pe termen lung a vieții sălbatice și a supravegherii sănătății în identificarea amenințărilor emergente la speciile pe cale de dispariție. De asemenea, arată cum prin aceste eforturi ni se oferă ocazia de a dezvolta și implementa activități de atenuare, inclusiv identificarea speciilor de rezervoare CDV și luarea în considerare și evaluarea strategiilor de vaccinare, pentru a reduce riscul de boală la tigrii Amur și la leopardii Amur (Panthera pardus orientalis) în pericol critic ).

Numere de accesare secvență nucleotidică. Secvențele genei Tiger CDV P și H au fost depuse în GenBank (numere de acces KC579363 [Pt2004; gena H], KC579361 [Pt2004; gena P] și KC579362 [Pt2010-3; gena H]). Numerele de acces pentru secvențele derivate din tigru și toate celelalte secvențe sunt prezentate în figuri.

MULȚUMIRI

Finanțarea a fost asigurată cu generozitate de Fundația Dunemere.

Mulțumim lui Melissa Miller și Judy St. Leger pentru țesuturile CDV cu control pozitiv și John Goodrich, Kathy Quigley, Charles Leathers, Alfred Ngbokoli, Daniel Friedman, Damien Joly, Enkhtuvshin Shiilegdamba, Kate Jenks și Jamie Phillips pentru materiale, sfaturi și suport logistic. Mulțumiri speciale se adresează Carol Oddoux, colegilor noștri ruși și personalului de teren care au participat la echipele de necropsie și lui Séamus Maclennan și Martin Gilbert pentru revizuirea manuscrisului.

NOTĂ DE PICIOASĂ

    • Primit la 30 mai 2013
    • Acceptat la 9 iulie 2013
    • Publicat la 13 august 2013

Acesta este un articol cu ​​acces liber distribuit în conformitate cu termenii licenței Creative Commons Attribution-Noncommercial-ShareAlike 3.0 Unported, care permite utilizarea, distribuția și reproducerea necomercială fără restricții în orice mediu, furnizat de autorul original și sursa sunt creditate.