Laborator cheie de fiziologie și biochimie animală, Colegiul de Medicină Veterinară,

acid

Universitatea agricolă din Nanjing, Nanjing, (China)

Tel. (+86) 25-8439 6763, Fax (+86) 25-8439 8669, E-mail [email protected]

Articole similare pentru „”

  • Facebook
  • Stare de nervozitate
  • LinkedIn
  • E-mail

Abstract

Autorii). Editat de S. Karger AG, Basel

Introducere

Obezitatea este una dintre cele mai mari amenințări la adresa sănătății umane, iar problema tot mai mare a obezității este asociată cu morbidități multiple [1], incluzând un risc crescut de diabet, boli cardiovasculare, hipertensiune arterială, boli de inimă și boli ale ficatului gras [2-5]. Aceste boli afectează milioane de persoane care trebuie să-și controleze cu atenție nivelul glicemiei pentru a preveni complicațiile legate de diabet [6, 7]. Biologia obezității este foarte complexă, iar mecanismele care leagă obezitatea de diferite boli sunt slab înțelese [2]. O atenție deosebită s-a concentrat asupra utilizării diferiților compuși bioactivi pentru controlul obezității [8], în timp ce majoritatea acestor studii investighează efectele factorilor asociați metabolismului lipidic asupra controlului acumulării de grăsimi la animale și oameni [7, 9-12]. Recent, a crescut îngrijorarea cu privire la obezitatea asociată cu metabolismul glucozei [13-15].

(-) - Acidul hidroxicitric (HCA) este principalul ingredient activ prezent în coaja de fructe Garcinia Cambogia [16-18]. Studiile anterioare au raportat că (-) - HCA crește pierderea în greutate [19, 20], promovează cheltuielile de energie [21-23], crește rata de sinteză a glicogenului [24] și suprimă de novo sinteza acizilor grași [25-27]. Recent, laboratorul nostru a constatat că (-) - tratamentul HCA a promovat sinteza proteinelor și a sporit cheltuielile de energie la șobolanii masculi [28]. În plus, am constatat, de asemenea, că (-) - HCA a inhibat sinteza acizilor grași prin reducerea aportului de acetil-CoA prin intermediul promovarea ciclului acidului citric și inhibarea expresiei enzimei malice dependente de NADP la puii broiler [29]. Mai mult, studiile anterioare au arătat că (-) - HCA este un puternic inhibitor competitiv al ATP-citrat liază [25, 26, 30-32], o enzimă citosolică (extra-mitocondrială) care catalizează clivajul citratului la oxaloacetat și acetil -CoA, care în cele din urmă limitează disponibilitatea unităților de acetil-CoA necesare pentru sinteza și lipogeneza acizilor grași la animale și oameni [21, 33].

(-) - HCA este similar din punct de vedere structural cu citratul. Citratul este un regulator alosteric pentru o serie de enzime care sunt implicate în metabolismul carbohidraților și grăsimilor, cum ar fi fosfofructokinaza (enzima care reglează glicoliza) [33] și acetil-CoA carboxilaza (enzima care reglează sinteza acizilor grași) [34]. S-a raportat că (-) - HCA are o afinitate mult mai mare față de citratul liază decât cea de citrat [22, 35]. Astfel, (-) - suplimentarea HCA este de așteptat să modifice căile metabolice. Deși unele studii au arătat (-) - HCA posedă activitate anti-obezitate [36, 37] și activitate anti-diabetică [38, 39], sunt disponibile puține informații cu privire la faptul dacă (-) - HCA afectează acumularea de grăsimi la puii broiler prin reglare asupra metabolismului energetic.

Spre deosebire de speciile de mamifere, ficatul este cel mai important organ al de novo sinteza acizilor grași [35, 40] și metabolismul energetic [41] la păsările de curte. Prin urmare, prezentul studiu a fost realizat pentru a investiga efectele (-) - HCA asupra metabolismului lipidic și a metabolismului energetic în hepatocitele primare de pui cultivate, care vor oferi informații utile pentru înțelegerea ulterioară a mecanismelor biochimice asociate cu reglarea acumulării de grăsime prin (- ) - HCA la puiul de pui.

Materiale și metode

Reactivi

Acidul (-) - hidroxicitric (HCA) a fost obținut din standardul de referință USP (SUA). Toate kiturile ELISA de pui au fost achiziționate de la Shanghai Hengyuan Biological Technology Co. (China). Medium 199 a fost achiziționat de la Hyclone Laboratories (Grand Island, NY, SUA); MTT, transferină, tripsină, penicilină și streptomicină au fost achiziționate de la Sigma (SUA). Glutamina și HEPES au fost obținute de la Amresco (Solon, OH, SUA); Kitul de reactivi TRIZOL a fost achiziționat de la Invitrogen (CA, SUA). Transcriptaza inversă M-MLV, inhibitorul RNazei și amestecul de dNTP au fost obținute de la Promega (Madison, SUA) și SYBR Green PCR Master Mix provin de la Roche (Basel, Elveția). Trusa de testare a trigliceridelor și trusa de testare a colorării roșii de ulei au fost cumpărate de la Jian Chen Biotechnology Institution (Nanjing, China).

Izolarea hepatocitelor

Cultura primară a hepatocitelor de pui

Hepatocitele primare de pui au fost semințe în monostraturi în plăci de cultură din plastic cu 6 godeuri sau 96 godeuri (Corning, SUA) cu o densitate de 2 × 106 celule pe godeu în 2 ml sau 1 × 105 celule pe godeu în 100 µL ser- mediu M199 gratuit. S-au adăugat suplimente: incluzând 5 mg/ml transferină, 2 mM glutamină și 1,75 mM HEPES. Mediul de cultură conținea, de asemenea, 100 UI/ml penicilină și 100 μg/ml streptomicină. Hepatocitele au fost incubate la 37 ° C într-o atmosferă de 95% aer și 5% CO2. După 24 de ore de aclimatizare la mediul de cultură, celulele au fost cultivate timp de 24 de ore în mediu roșu fenol și fără FBS M199.

Analiza viabilității celulare

Celulele au fost însămânțate pe plăci cu 96 de godeuri la 1 × 105 celule per godeu și tratate cu 0, 1, 10 sau 50 uM (-) - HCA timp de 1, 3, 6, 12 sau 24 de ore înainte de adăugarea soluției MTT. La fiecare godeu s-au adăugat douăzeci de microlitri de 5 mg/ml MTT. Patru ore mai târziu, mediul de cultură a fost îndepărtat și cristalele formazan albastre formate au fost dizolvate în 150 uL DMSO. Densitatea optică a formazanului generat din MTT a fost măsurată la 490 nm folosind un cititor de microplăci model 550 (Bio-Rad, California, SUA).

Evaluarea ratei mortalității celulare prin testul Lactat dehidrogenazei (LDH)

Celulele au fost crescute în plăci cu 96 de godeuri (1 × 105 celule per godeu) și tratate cu 0, 1, 10 sau 50 uM la 1 × 105 celule per godeu cu 100 culturi de mediu de culturi L pentru 1, 3, 6, 12 sau 24 h. Rata mortalității celulelor a fost evaluată prin cuantificarea eliberării lactatului dehidrogenazei (LDH). Conținutul de LDH a fost determinat folosind kitul de testare a citotoxicității LDH (catalog #: C0016, Beyotine Biotechnology, China), iar procentul mortalității celulelor a fost calculat după cum urmează: [(eliberare experimentală - eliberare spontană)/(eliberare maximă - eliberare spontană)] × 100. Eliberarea spontană și eliberarea maximă au fost obținute prin incubarea celulelor singure sau respectiv cu o soluție 0,1% Triton x-100.

Analiza consumului de glucoză

Celulele au fost crescute în plăci cu 96 de godeuri (1 × 105 celule per godeu) și tratate cu 0, 1, 10 sau 50 uM (-) - HCA timp de 1, 3, 6, 12 sau 24 de ore. După incubare, s-au colectat 10 uL de mediu din fiecare godeu și concentrația de glucoză a fost măsurată cu un kit colorimetric de testare a glucozei (catalog nr .: F006) conform instrucțiunilor producătorului (Instituția de biotehnologie Jian Chen, Nanjing, China). Consumul de glucoză a fost calculat ca: concentrația mediului de cultură non-celular - concentrația mediului de cultură celular.

Măsurarea respirației celulare mitocondriale

Rata consumului de oxigen mitocondrial (OCR) a fost măsurată folosind un analizor Seahorse XF și 96 (Seahorse Bioscience). Pe scurt, hepatocitele de pui au fost cultivate în microplacă de cultură celulară XF e 96 (5 × 105 celule pe godeu) și tratate cu 0, 1, 10 sau 50 uM (-) - HCA timp de 24 de ore. Oligomicina (1 µM), FCCP (2- [2- [4- (trifluormetoxi) fenil] hidraziniliden] - propanedinitril) (1 µM) și rotenona (0,5 µM) combinate cu antimicină (0,5 µM) au fost injectate secvențial prin porturi în cartușele Seahorse Flux Park, așa cum sa raportat anterior. În primul rând, a fost măsurată rata consumului de oxigen bazal (respirația bazală). Oligomicina a inhibat activitatea ATP sintază, care a inhibat în consecință fluxul de electroni și a dezvăluit starea eficienței cuplării. FCCP a decuplat lanțul respirator și a dezvăluit capacitatea maximă de reducere a oxigenului. Capacitatea respiratorie de rezervă a fost calculată prin scăderea respirației bazale din respirația maximă. În cele din urmă, rotenona combinată cu antimicina A a fost injectată pentru a inhiba fluxul de electroni prin complexele I și III; rata consumului rămas de oxigen s-a datorat în primul rând respirației non-mitocondriale.

Măsurarea conținutului de trigliceride

Celulele au fost cultivate în plăci cu 6 godeuri (2 × 106 celule per godeu) și tratate cu 0, 1, 10 sau 50 uM (-) - HCA timp de 1, 3, 6, 12 sau 24 de ore. Celulele au fost recoltate și conținutul de trigliceride (TG) (catalog nr .: A100-1) a fost analizat folosind un kit de testare comercială de la Jian Chen Biotechnology Institution (Nanjing, China) și datele au fost normalizate la concentrația de proteine ​​determinată folosind testul BCA . kit (Beyotime Biotechnology, China).

Ulei de roșu O colorare

Celulele au fost cultivate în plăci cu 6 godeuri (2 × 106 celule per godeu) și tratate cu 0, 1, 10 sau 50 uM (-) - HCA timp de 1, 3, 6, 12 sau 24 de ore. Colorarea cu ulei roșu O a fost efectuată conform metodelor descrise anterior [44]. Pe scurt, celulele au fost fixate cu 10% formalină tamponată timp de cel puțin 30 de minute. Celulele au fost apoi incubate cu 60% izopropanol timp de 15 min la temperatura camerei și colorate cu soluție roșie de ulei O pentru încă 15 min. Celulele au fost spălate de 4 ori cu apă deionizată și apoi lăsate să se usuce la aer. Pentru a normaliza numărul celulei, celula a fost colorată cu hematoxilină timp de 5 minute după colorarea cu ulei roșu O. Diapozitivele au fost fotografiate cu un microscop optic (Olympus BX53; Tokyo, Japonia). Douăzeci de fotografii au fost selectate aleatoriu din fiecare grup și zece câmpuri vizuale independente ale fiecărei fotografii au fost utilizate pentru a analiza numărul și aria picăturilor de lipide utilizând software-ul Image-pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD, SUA).

Determinarea nivelurilor de ARNm ale genei factorilor legați de metabolismul lipidic prin RT-PCR cantitativă în timp real (qPCR)

tabelul 1.

Secvența primară de gene vizate și β-actină

Măsurarea conținutului de glicogen

Celulele au fost cultivate în plăci cu 6 godeuri (2 × 106 celule pe godeu) și tratate cu 0, 1, 10 sau 50 uM (-) - HCA timp de 24 de ore. Celulele au fost recoltate și conținutul de glicogen (catalog nr .: A043) a fost măsurat folosind kituri comerciale conform protocoalelor producătorilor (Instituția de biotehnologie Jiancheng, Nanjing, China). Datele au fost normalizate la conținutul de proteine ​​din probă, determinat de un kit de testare BCA.

Măsurarea conținutului cheie în proteine ​​ale enzimei metabolice a glucozei

Celulele au fost cultivate în plăci cu 6 godeuri (2 × 106 celule pe godeu) și tratate cu 0, 1, 10 sau 50 uM (-) - HCA timp de 24 de ore. Celulele au fost recoltate și întrerupte ultrasunet în gheață și apoi centrifugate la 3000 rpm timp de 20 minute la 4 ° C. Supernatanții au fost colectați, concentrațiile de proteine ​​ale glicogen fosforilazei (GP) (catalog nr .: E-75175), glicogen sintază (GS) (catalog nr .: E-75174), glucokinază (GK) (catalog nr .: E-76111), fosfofructokinază-1 (PFK-1) (catalog nr .: E-76131), piruvat kinază (PK) (catalog nr .: E-76565), piruvat dehidrogenază (PDH, E1) (catalog nr .: E-76118), citrat sintază CS ) (catalog nr .: E-75165), aconitază (ACO) (catalog nr .: E-75144) și fosfoenolpiruvat carboxicinază (PEPCK) (catalog nr .: E-75117) au fost măsurate folosind kituri ELISA conform protocoalelor producătorilor (Shanghai Hengyuan Biological Technology Co., China). Conținutul de proteine ​​enzimatice a fost normalizat la concentrația totală de proteine ​​din probă.

Măsurarea activității succinat dehidrogenazei și malat dehidrogenazei

Celulele au fost cultivate în plăci cu 6 godeuri (2 × 106 celule pe godeu) și tratate cu 0, 1, 10 sau 50 uM (-) - HCA timp de 24 de ore. Celulele au fost recoltate și activitățile succinat dehidrogenazei (SDH) (catalog nr .: A022), malat dehidrogenazei (MDH) (catalog nr .: A021) au fost măsurate folosind kituri comerciale conform protocoalelor producătorilor (Jiancheng Biotechnology Institution, Nanjing, China ). Activitatea enzimelor a fost normalizată la conținutul de proteine ​​din probă și exprimată ca proteină U/mg.

Determinarea conținutului de citrat de ATP (ACLY) și de acetil-CoA

Cuantificarea mitocondriilor

Celulele au fost cultivate în plăci cu 6 godeuri (2 × 106 celule per godeu) și tratate cu 0, 1, 10 sau 50 uM (-) - HCA timp de 48 de ore. Celulele au fost fixate în fosfat de sodiu 0,1 M (pH 7,4) conținând 2,5% glutaraldehidă, centrifugate la 3000 rpm timp de 4 minute și clătite în același tampon și fixate în 1% tetroxid de osmiu în tampon Millonig. Probele de celule au fost apoi prelucrate prin tehnici standard pentru microscopia electronică de transmisie (TEM). Secțiunile ultra-subțiri au fost colorate cu acetat de uranil și citrat de plumb și vizualizate într-un microscop electronic cu transmisie H-7650 (Hitachi Company, Japonia). Numărul mitocondriilor a fost numărat în cincisprezece celule independente din treizeci de fotografii selectate aleator în fiecare grup. Rezultatele au fost tabelate ca număr mediu de mitocondrii pe celulă pentru toate grupurile de tratament, iar metoda utilizată în acest studiu a fost modificată din shen și colab. [46].

Evaluarea activităților complexe I și complexe V ale lanțului respirator mitocondrial

Celulele au fost cultivate în plăci cu 6 godeuri (2 × 106 celule pe godeu) și tratate cu 0, 1, 10 sau 50 uM (-) - HCA timp de 24 de ore. Celulele au fost recoltate și întrerupte ultrasunet în gheață și apoi centrifugate la 3000 rpm timp de 20 minute la 4 ° C. Supernatanții au fost colectați. Concentrația de proteine ​​a NADH dehidrogenazei (catalog nr .: E-75714) și ATP sintază (catalog nr .: E-75448) a fost măsurată folosind kituri ELISA conform protocoalelor producătorilor (Shanghai Hengyuan Biological Technology Co., China). Conținutul de proteine ​​NADH dehidrogenază și ATP sintază au fost utilizate pentru a reprezenta activitatea complexului I și complexului V al lanțului respirator mitocondrial.

Analiza datelor și statisticile

Datele au fost analizate cu ANOVA unidirecțional și exprimate ca medii ± eroarea standard a mediei (SEM). Diferențele de tratament au fost supuse testelor de comparație multiple ale unui Duncan. Diferențele au fost considerate semnificative la P 0,05) (Fig. 1A). Mai mult, celulele ratei mortalității nu au fost afectate de tratamentul (-) - HCA în comparație cu grupul de control în perioade diferite de timp (P > 0,05) (Fig. 1B). Consumul de glucoză a crescut semnificativ în grupurile tratate cu 1-50 µM (-) - HCA decât în ​​grupul martor de la 1 la 24 de ore (P 0,05). FAS Nivelul ARNm a scăzut în grupurile tratate cu 1-50 µM (-) - HCA de la 12 la 24 de ore în comparație cu grupul martor (P 0,05) (Fig. 5D). Nu a existat un răspuns vizibil la tratamentul (-) - HCA în CPT-I nivelul ARNm (P > 0,05) (Fig. 5E), în timp ce PPARα Nivelul ARNm a crescut semnificativ în grupurile tratate cu 10 µM sau 50 µM (-) - HCA decât cele din grupul de control în perioada experimentală de la 1 la 12 ore (P 0,05) (Fig. 8A). Conținutul de glicogen a fost semnificativ mai mare în grupul tratat cu 10 µM (-) - HCA decât în ​​grupul martor (P 0,05).

FIG. 10.

Micrografii electronice și numărul mitocondriilor din hepatocitele primare de pui tratate cu (-) - HCAA: micrografii electronice; B: Numărul de mitocondrii. După incubare, probele de celule au fost prelucrate prin tehnici standard pentru transmiterea microscopiei electronice și s-au observat secțiuni ultra-subțiri cu mărire × 2500. Treizeci de fotografii au fost selectate aleatoriu din fiecare grup, iar numărul mitocondriilor a fost numărat în 15 celule independente din fiecare fotografie. Rezultatele sunt afișate ca numărul mediu de mitocondrii per celulă în toate grupurile de tratament.

Efectul (-) - HCA asupra activităților complexe I și V complexe ale lanțului respirator mitocondrial la hepatocite primare de pui cultivate

Așa cum se arată în FIG. 11A, 1-50 µM (-) - HCA a crescut semnificativ conținutul de proteine ​​NADH dehidrogenază în comparație cu grupul martor la hepatocitele de pui primare cultivate (P