Laboratorul de Afiliere al Metabolismului, Departamentul de Medicină Internă, Facultatea de Medicină, Universitatea din Geneva, Geneva, Elveția

administrarea

Laboratorul de Afiliere al Metabolismului, Departamentul de Medicină Internă, Facultatea de Medicină, Universitatea din Geneva, Geneva, Elveția

Laboratorul de Afiliere al Metabolismului, Departamentul de Medicină Internă, Facultatea de Medicină, Universitatea din Geneva, Geneva, Elveția

Laborator de bază pentru spectrometrie de masă de afiliere, Queen's Medical Research Institute, Edinburgh, Regatul Unit

Laboratorul de Afiliere al Metabolismului, Departamentul de Medicină Internă, Facultatea de Medicină, Universitatea din Geneva, Geneva, Elveția

Divizia de Afiliere a Toxicologiei Moleculare și a Sistemelor, Departamentul de Științe Farmaceutice, Universitatea din Basel, Basel, Elveția

Laboratorul de Afiliere al Metabolismului, Departamentul de Medicină Internă, Facultatea de Medicină, Universitatea din Geneva, Geneva, Elveția

  • Christelle Veyrat-Durebex,
  • Nicolas Deblon,
  • Aurélie Caillon,
  • Ruth Andrew,
  • Jordi Altirriba,
  • Alex Odermatt,
  • Françoise Rohner-Jeanrenaud

Cifre

Abstract

Citare: Veyrat-Durebex C, Deblon N, Caillon A, Andrew R, Altirriba J, Odermatt A și colab. (2012) Administrarea centrală a glucocorticoizilor promovează creșterea în greutate și creșterea expresiei de 11β-hidroxisteroid dehidrogenază tip 1 în țesutul adipos alb. PLoS ONE 7 (3): e34002. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0034002

Editor: Silvana Gaetani, Universitatea Sapienza din Roma, Italia

Primit: 12 iulie 2011; Admis: 24 februarie 2012; Publicat: 30 martie 2012

Finanțarea: Această lucrare a fost susținută de granturile Fundației Naționale Științifice Elvețiene nr. 3100AO-105889 către FR-J și nr. 310000-112279 către AO, precum și prin grantul EUFP6 LSHM-CT-2003-503041 către FR-J. Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Pe de altă parte, 11β-HSD2, exprimat în principal în țesuturile țintă ale aldosteronului, cum ar fi nefronul distal și colonul, este o 11β-dehidrogenază cu afinitate mare care catalizează inactivarea rapidă a GC. Interesant, 11β-HSD2 a fost recent raportat a fi exprimat în adipocite și fracția vasculară stromatică a țesutului adipos al șobolanilor obezi și al oamenilor [21], [22], sugerând că această enzimă ar putea juca un rol important în inactivarea și disponibilitatea GC intracelulară. pentru GR în acest țesut [23].

Metode

Declarație de etică

Toate procedurile au fost efectuate în conformitate și aprobate de Comitetul etic instituțional pentru îngrijirea animalelor din Geneva și de biroul veterinar cantonal (ID experiment 1034/3025/2).

Animale

Șobolanii masculi Wistar (200-225 g) și SD (200-225 g) au fost achiziționați de la Charles River (L’Arbresle, Franța) și adăpostiți la temperatură controlată (23 ° C) și iluminare (lumină aprinsă: 0700-1900 h) . Li sa permis accesul gratuit la apă și la o dietă standard de laborator (RMI, Hersteller, Essex, Marea Britanie) (14,7% proteine, 2,6% grăsimi, 68,0% carbohidrați). Greutatea corporală și aportul de alimente au fost înregistrate dimineața (0830-0930 h).

Infuzie intracerebroventriculară (icv) de dexametazonă

Infuzie periferică (sc) de dexametazonă

După o săptămână de adaptare, șobolanii SD au fost adăpostiți individual și supuși procedurilor chirurgicale. Au fost anesteziați pe scurt cu izofluran și minipompe osmotice (Alzet®, model 1003D) eliberând fie vehiculul (0,9% NaCl) (grup de control, n = 8), fie 5 µg/zi dexametazonă (n = 9) au fost implantate subcutanat timp de două zile . Șobolanii au fost sacrificați prin anestezie cu izofluran și decapitare rapidă între 0900 și 1200 h. Probele de sânge și țesuturile au fost colectate așa cum s-a descris mai sus.

Calorimetrie indirectă (LabMaster)

S-au măsurat diferiți parametri metabolici, activitatea spontană, precum și comportamentele alimentare și de băut folosind un sistem de calorimetrie indirectă LabMaster cu 12 cuști (TSE Systems GmbH, Berlin, Germania) al instalației de bază pentru fenotiparea animalelor mici (CMU, Universitatea din Geneva, Geneva), sub temperatură controlată (22 ± 1 ° C) și iluminare (ciclu 12-lumină-întuneric). Sistemul de calorimetrie este un circuit deschis care determină consumul de O2 (ml/h/kg), producția de CO2 (ml/h/kg), rata de schimb respiratorie (RER = VCO2/VO2, unde V este volumul) și căldura produsă de animal (kcal/h/kg). Detectarea localizării și mișcărilor animalelor se efectuează cu perechi de senzori în infraroșu dispuse în benzi pentru activitate orizontală, discriminând mișcările ambulatorii și fine. LabMaster constă, de asemenea, dintr-o combinație de senzori de alimentare și băuturi foarte sensibili pentru măsurători online automatizate. Înainte de înregistrare, animalelor li s-a permis o perioadă de aclimatizare de 14 zile în cuștile de antrenament. Măsurătorile au fost efectuate pe parcursul celor 48 de ore de perfuzie salină sau dexametazonă.

Compozitia corpului

Un analizor de rezonanță magnetică nucleară cantitativă EchoMRI-700 (Echo Medical Systems, Houston, TX) a fost utilizat pentru a măsura grăsimea totală și masa corporală slabă la sfârșitul tratamentelor. În plus, diferite depozite de țesut adipos alb (inghinale, epididimale, perirenale și mezenterice) au fost disecate cu atenție și cântărite după sacrificiu.

Măsurători plasmatice

Lipidele totale ale țesutului adipos și conținutul de TG hepatic

Procesarea țesuturilor și RT-PCR în timp real

Western blot

Țesuturile congelate au fost omogenizate mecanic în tampon RIPA rece ca gheața (100 mM Tris, 2% NP40, 0,2% SDS, 0,3 M NaCl și 1% deoxicolat de sodiu, pH 7,5) conținând inhibitori de protează (Complete Mini, Roche Diagnostics). Proteinele au fost separate prin electroforeză pe gel de poliacrilamidă SDS-10%. După o perioadă de blocare (lapte 5% TBS între 0,1%, 1 oră), pete obținute după transfer pe membrane de nitroceluloză au fost incubate cu anti-PEPCK de casă purificat [35], anti-11β-HSD1 (Chemicon International Inc., Billerica, MA), anti-C/EBPα, anti-C/EBPβ (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA), anti-C/EBPβ fosforilat pe ser 105 (PC/EBPβ) (Cell Signaling Technology, Inc., Beverly, MA) și anticorpi anti-actinici (Chemicon International Inc.) peste noapte la 4 ° C. Anticorpii împotriva 11β-HSD1 și PEPCK au fost furnizați cu amabilitate de Dr. Karen E. Chapman (Queen's Medical Research Institute, Edinburgh, Marea Britanie) și Dr. Ildiko Szanto (Medical Center Universitaire, Geneva, Elveția), respectiv. Detectarea a fost efectuată utilizând anticorpi secundari conjugați cu peroxidază de hrean (BIO-RAD Laboratories, Hercules, CA) și un sistem de detecție îmbunătățit de chemiluminescență (ECL) (Amersham Biosciences). Rezultatele au fost apoi cuantificate folosind ChemiDoc ™ XRS de la BIO-RAD și software-ul Quantity One ™.

Analize statistice

Rezultatele sunt exprimate ca medii ± SEM. Testul Levene a fost utilizat pentru a verifica egalitatea varianței între grupuri (SPSS Inc., Chicago, IL). Pentru a evalua efectele tratamentului, compararea grupurilor a fost efectuată folosind teste parametrice (testul t Student) și non-parametrice (testul Mann-Whitney) atunci când testele de normalitate și varianță egală au eșuat. Efectul timpului a fost analizat folosind măsuri repetate unidirecționale ANOVA (Student-Newman-Keuls). Modele de regresie liniară au fost utilizate pentru a prezice corelațiile dintre nivelurile de expresie ale enzimelor, folosind valorile controlului și ale grupurilor tratate. Semnificația statistică a fost stabilită la P Figura 1. Aportul de alimente, creșterea în greutate corporală, nivelurile plasmatice de corticosteron, insulină și leptină la șobolanii Wistar.

Infuzie centrală (icv) de dexametazonă timp de 3 zile. A) Rezultatele sunt exprimate ca alimente ingerate (în grame) în ultimele două zile de perfuzie cu icv. B) Rezultatele reprezintă creșterea în greutate corporală (în grame) măsurată după 2 și 3 zile de perfuzie cu icv. C la E) Niveluri plasmatice de corticosteron, insulină și leptină. Media ± SEM de n = 7 șobolani per grup. * P Tabelul 1. Efectele tratamentului cu dexametazonă asupra parametrilor metabolici.

În țesutul adipos alb epididim (eWAT), ales pentru a reprezenta un tampon de grăsime intraperitoneală, nici expresia mARN (Fig. 2A), nici proteina (Fig. 2B) a 11β-HSD1 nu a fost modificată prin tratamentul cu dexametazonă. Cu toate acestea, expresia enzimelor lipogene, cum ar fi lipoprotein lipaza (LPL), acetylCoA carboxilaza (ACC) și acizii grași sintaza (FAS), precum și a rezistenței au fost semnificativ crescute. În WAT inghinal (iWAT), ales pentru a reprezenta un tampon de grăsime subcutanat, o creștere marcată a mARN-ului 11β-HSD1 (de 4 ori) (P = 0,034) (Fig. 2C), fără modificări în expresia proteinelor (Fig. 2D ) a fost observată în grupul tratat cu dexametazonă. Acest lucru a fost însoțit de expresia crescută a H6PDH (P = 0,037), FAS (P = 0,008) și rezistină (P = 0,045) (Fig. 2C). De remarcat, expresia ARNm a enzimelor implicate în lipoliză și utilizarea lipidelor, cum ar fi lipaza hormonală sensibilă (HSL) și carnitina palmitoiltransferază tip 1 (CPT1), a fost semnificativ redusă (P = 0,017 și respectiv P = 0,004). Atât în ​​depozitele de grăsime intraperitoneale, cât și în cele subcutanate, expresia 11β-HSD2 și GR nu a fost afectată de perfuzia centrală de dexametazonă.

Efectul perfuziei centrale (icv) de dexametazonă timp de 3 zile în țesut adipos alb epididimal (eWAT) și inghinal (iWAT). A și C) Rezultatele sunt exprimate ca procent din expresia relativă a ARNm comparativ cu cea obținută la șobolanii martor (100%). Analiza a fost efectuată în duplicat și rezultatele au fost normalizate cu expresia RPS29. Media ± SEM de n = 7 șobolani per grup. * P Figura 3. Aportul alimentar, creșterea în greutate corporală, nivelurile plasmatice de corticosteron, insulină și leptină, precum și parametrii metabolici și activitatea locomotorie a șobolanilor SD.

Efectele perfuziei centrale (icv) cu dexametazonă timp de 2 zile. A) Rezultatele sunt exprimate ca alimente ingerate (în grame) în fiecare zi de perfuzie cu icv. B) Rezultatele reprezintă creșterea în greutate corporală (în grame) măsurată după 1 și 2 zile de perfuzie cu icv. C) Nivelurile plasmatice de corticosteron, insulină și leptină. D) Compoziția corpului (% din grăsime și masa slabă) obținută folosind EchoMRI700 (. E) Greutatea (g/100 g BW) a țesutului adipos alb inghinal (iWAT), epididimal (eWAT), mezenteric (mWAT) și perirenal (prWAT) și a țesutului adipos maro (BAT). F) Rezultatele sunt exprimate ca procent din expresia relativă a ARNm comparativ cu cea obținută la șobolanii martor (100%) și normalizată cu expresia ciclofilinei A. Media ± SEM de n = 6-8 șobolani per grup. G) Aportul alimentar, coeficientul respirator (RER), activitatea totală, VO2 și producția de căldură (H) măsurată utilizând calorimetrie indirectă (LabMaster). Valorile sunt medii ± SE de 5 animale pe grup. † P 2 = 0,507, P = 0,004) (Fig. 4C). Așa cum s-a observat la șobolanii Wistar, 11β-HSD1 a fost mult mai mult exprimat în eWAT decât în ​​iWAT (Ct de 21,99 ± 0,30 și respectiv 24,62 ± 0,39; P = 0,0001). În ambele depozite, nici expresia ARNm a 11β-HSD2, nici cea a GR nu au fost modificate prin perfuzie cu dexametazona.

Efectele perfuziei centrale (icv) de dexametazonă timp de 2 zile în țesutul adipos epididimal (eWAT) și inghinal (iWAT). A și C) Rezultatele sunt exprimate ca procent din expresia relativă a ARNm comparativ cu cea obținută la șobolanii martor (100%). Analiza a fost efectuată în duplicat și rezultatele sunt normalizate cu expresia RPS29. Media ± SEM de n = 7-8 șobolani per grup. * P 2 = 0,692, P = 0,001). Expresia proteinei 11β-HSD1 a avut, de asemenea, tendința de a scădea (Fig. 5B). În plus, expresia mARN-ului PEPCK a fost redusă la șobolanii tratați cu dexametazonă (P = 0,016) (Fig. 5A) și a existat o corelație semnificativă între expresia PEPCK și 11β-HSD1 în acest țesut (r 2 = 0,353, P = 0,032). Nivelurile de proteine ​​PEPCK au fost, totuși, nealterate prin perfuzia centrală de dexametazonă (Fig. 5C).

Efectele perfuziei centrale (icv) cu dexametazonă timp de 2 zile. A) Rezultatele sunt exprimate ca procent din expresia relativă a ARNm comparativ cu cea obținută la șobolanii martor (100%). Analiza a fost efectuată în duplicat și rezultatele au fost normalizate cu expresia GAPDH. Media ± SEM de n = 7-8 șobolani per grup. * P 2 = 0,905, P = 0,001). La calcularea raportului de expresie genică C/EBPα la C/EBPβ, s-a obținut aproape de trei ori, deși nu s-a obținut o creștere semnificativă la animalele tratate cu dexametazonă (Fig. 6A). În ceea ce privește expresia proteinelor măsurată prin analiza Western blot, s-a observat o creștere de 1,6 ori a C/EBPα în grupul tratat cu dexametazonă (Fig. 6B). În acest grup, ambele expresii C/EBPβ și P-C/EBPβ au crescut în mod similar cu 1,86 ori. Raportul rezultat între C/EBPα și C/EBPβ a fost nealterat prin perfuzie de dexametazonă la nivel de proteină.

Efectele perfuziei centrale (icv) cu dexametazonă timp de 2 zile. A și C) Rezultatele sunt exprimate ca procent din expresia relativă a ARNm comparativ cu cea obținută la șobolanii martor (100%). Analiza a fost efectuată în duplicat și rezultatele au fost normalizate cu expresia RPS29, β-actină și GAPDH. Media ± SEM de n = 7-8 șobolani per grup. B) Western blots reprezentative de C/EBPα, C/EBPβ și C/EBPβ-ser 105 fosforilate (n = 5 per grup). Cuantificarea a fost efectuată utilizând ChemiDoc ™ XRS și software-ul Quantity One ™. * P Figura 7. Aportul alimentar, creșterea în greutate corporală, corticosteronul, insulina, nivelurile de leptină, 11β-HSD1 și expresia mARN-ului rezistinei la șobolani SD.