Abstract

Introducere

Mai mulți factori de risc joacă roluri esențiale în dezvoltarea CAN, inclusiv hiperglicemie cronică, durata diabetului, hipertensiune arterială, hiperlipidemie, inflamație cronică, stres oxidativ și, mai recent, variabilitatea glucozei (1,2,4,9). În timp ce progresia CAN este prevenită cu un control strâns al glucozei în diabetul de tip 1 (2.9) și posibil cu intervenții combinate multifactoriale în diabetul de tip 2 (10), până în prezent nu există terapii specifice de modificare a bolii pentru CAN. Astfel, o înțelegere mai profundă a mecanismelor care modulează dezvoltarea și progresia CAN este crucială atât pentru evaluarea riscurilor, cât și pentru intervențiile terapeutice.

aminoacizilor

Proiectare și metode de cercetare

Subiecte

Patruzeci și șapte de subiecți cu diabet zaharat de tip 1 și 10 subiecți cu control sănătos, în funcție de vârstă, au fost înrolați într-un studiu observațional longitudinal de 3 ani. Principalele criterii de incluziune pentru subiecții cu diabet au fost vârsta cuprinsă între 18 și 65 de ani; prezența diabetului de tip 1, cu o durată de minimum 5 ani a diabetului; și fără semne de complicații microvasculare sau hipertensiune arterială necontrolată la momentul inițial. Toți subiecții au avut rezultate normale ale electrocardiogramei de odihnă și rezultate normale ale testului de rulare înainte de înscrierea în studiu. Pacienții cu antecedente de boli cardiovasculare au fost excluși din studiu. Subiecții cu control sănătos au fost în funcție de vârstă cu greutatea normală, toleranța normală la glucoză și tensiunea arterială normală (TA). Patruzeci de subiecți cu diabet de tip 1 au finalizat studiul. Măsurile demografice și antropometrice au fost colectate prin chestionare și examinare fizică; s-au obținut probe de sânge și urină în repaus pentru măsurarea diferiților parametri metabolici, inclusiv HbA1c, panoul lipidic și testele funcției renale. Consiliul de examinare instituțională al Universității din Michigan a aprobat studiul și s-a obținut consimțământul informat în scris de la toți subiecții.

Evaluări CAN

Evaluările CAN standardizate au fost efectuate la toți subiecții după un post peste noapte. Subiecții au fost rugați să evite cafeina și produsele din tutun timp de 8 ore înainte de testare și să dețină orice medicament (cu excepția insulinei bazale) până la finalizarea testării CAN. Subiecții care au prezentat un episod hipoglicemiant după miezul nopții (glicemie ≤50 mg/dL [2,77 mmol/L]) înainte de testare au fost reprogramați. Înregistrările electrocardiogramei au fost obținute în decubit dorsal folosind un monitor fiziologic (Nightingale PPM2; Zoe Medical), iar datele au fost colectate în timpul unui studiu de odihnă (5 minute) și în timpul mai multor teste reflexe cardiovasculare autonome standardizate obținute prin respirație ritmată respirație, manevra Valsalva și modificări posturale). Indicii de CAN au fost derivați folosind ANX 3.1 (ANSAR Medical Technologies) așa cum s-a descris anterior (22). Toate variabilele CAN au fost evaluate pentru întreaga cohortă la momentul inițial și pentru 40 de subiecți cu diabet de tip 1 (din 47) care au finalizat studiul la 3 ani de urmărire.

CAN Măsuri de rezultat

Următoarele măsuri ale CAN au fost predefinite ca rezultate ale intereselor și analizate: SD a intervalului RR normal (SDNN), diferențele pătrate ale rădăcinii medii ale intervalelor RR succesive (RMSSD), raportul expirație-inspirație (E: I) în timpul respirației profunde, Raportul Valsalva (media a două măsuri), raportul 30:15, putere de joasă frecvență (LF) (0,04-0,15 Hz), putere de înaltă frecvență (HF) (0,15-0,4 Hz) și LF/HF în repaus și în timpul testelor reflexe cardiovasculare autonome.

Măsurători ale metabolitului

Aminoacizii au fost măsurați după purificarea și derivatizarea probelor de plasmă de 100 μL prin cromatografie de gaze - spectrometrie de masă (Agilent 6890N Cromatograf de gaz cuplat la 5973 MSD Spectrometru de masă) folosind un kit modificat EZ: faast (Phenomenex); norvalina a fost utilizată ca standard intern (16.20). Metaboliții TCA au fost extrși din 100 μl plasmă cu un amestec de metanol, cloroform și apă (8: 1: 1) conținând standarde interne marcate cu izotop 13 C pentru citrat, succinat, fumarat, malat, α-cetoglutarat, lactat și piruvat . Cromatografia lichidă - analiza spectrometriei de masă a fost efectuată pe un sistem Agilent format dintr-un modul de cromatografie lichidă ultraperformantă 1260 cuplat cu un spectrometru de masă 6520 cu quadrupol timp de zbor (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Datele au fost prelucrate folosind MassHunter Quantitative Analysis, versiunea B.07.00. Metaboliții au fost normalizați la cel mai apropiat standard intern marcat cu izotopi și cuantificați utilizând curbe de calibrare liniare (16).

Analize statistice

Verificarea integrității datelor

Variabilele metabolomice au fost examinate pentru a evidenția detectarea problematică a semnalului pe baza analizei componentelor principale - inspecția bazată pe valorile anormale la nivel de metabolit și subiect, efectul de lot și detectabilitatea. Toate variabilele au fost verificate pentru normalitate și s-a efectuat transformarea adecvată a datelor (transformare naturală a jurnalului sau o altă scară) pentru a satisface presupunerea de normalitate pentru diferitele tehnici statistice utilizate. Normalizarea și scalarea optimă a datelor au fost efectuate pentru a asigura formatul de date adecvat pentru analiza statistică ulterioară.

Plan de analiză

Diferențele în caracteristicile clinice, măsurătorile CAN, metaboliții ciclului TCA și nivelurile de aminoacizi între subiecții cu diabet de tip 1 și subiecții martor sănătoși au fost analizați utilizând testul Student t sau testul exact Fischer pentru variabilele continue și testul χ 2 pentru variabilele categorice. Corecția Bonferroni a fost aplicată pentru a ține cont de comparații multiple. Coeficientul de corelație Pearson a fost utilizat pentru a evalua relația dintre intermediarii metabolici (metaboliții ciclului TCA și aminoacizii) și parametrii CAN pentru a detecta tendințe puternice într-un context biologic care au fost confirmate cu modele de regresie ulterioare care iau în considerare efectele variabilelor clinice. Regresia liniară a fost utilizată pentru a prezice asocierea cu metaboliții inițiali și parametrii CAN inițiali și pentru a prezice măsurile CAN la urmărirea de 3 ani. Reducerea dimensiunii cu analiza componentelor principale a fost utilizată pentru a explica corelația ridicată dintre metaboliții înrudiți biologic, iar componenta principală care contabilizează cea mai mare varianță a fost utilizată pentru analize ulterioare. Toate analizele statistice au fost efectuate folosind software-ul SPSS (versiunea 24; IBM Corp.).

Disponibilitatea datelor și a resurselor

Seturile de date generate în timpul și/sau analizate în timpul studiului curent sunt disponibile de la autorul corespunzător, la cerere rezonabilă. Nu au fost generate sau analizate resurse aplicabile în timpul studiului curent.

Rezultate

Caracteristici clinice de bază, măsuri ale metabolitului și măsuri CAN la toți participanții

Tabelul 1 prezintă caracteristicile clinice inițiale ale acestei cohorte, cu o comparație a celor 47 de subiecți cu diabet de tip 1 (61% femei, 4% fumători curenți și vârsta medie ± SD 34 ± 13 ani, durata diabetului 13 ± 6 ani și HbA1c 8 ± 1,2%) și subiecții cu control sănătos în funcție de vârstă și sex. Nu au existat diferențe semnificative în caracteristicile inițiale între pacienții cu diabet de tip 1 și subiecții martor sănătoși, cu excepția glicemiei în jeun (153,7 ± 76 vs. 86,2 ± 14 mg/dL, respectiv; P = 0,007) și HbA1c, care au fost criteriile folosit pentru a defini grupul cu diabet de tip 1. Subiecții cu diabet de tip 1 au fost ușor mai grei, fără dovezi de complicații microvasculare sau macrovasculare la momentul inițial (fără retinopatie, creatinină serică normală sau microalbuminurie conform proiectului studiului). În timp ce subiecții cu control sănătos nu luau medicamente, toți subiecții cu diabet zaharat de tip 1 erau tratați cu insulină, iar dintre aceștia 24 (51%) foloseau perfuzie subcutanată continuă de insulină printr-o pompă, 7 (15%) erau tratați cu statine, 5 (11) %) au fost pe inhibitori ai ECA (în ciuda istoricului anterior de nefropatie diabetică) și niciunul nu a fost utilizat pe blocanții β. Nu au existat diferențe în măsurile CAN între subiecții cu subiecți cu diabet zaharat de tip 1 și subiecții cu control sănătos la momentul inițial (Tabelul 1).

Caracteristicile clinice ale subiecților cu diabet zaharat de tip 1 și subiecților martor sănătoși

Patruzeci de subiecți cu diabet zaharat de tip 1 au revenit la sfârșitul a 3 ani pentru măsuri CAN de urmărire și măsuri de laborator (Tabelul 1). În timpul urmăririi, nu au existat modificări semnificative ale controlului glicemic sau modificări ale TA, IMC sau controlul lipidelor. Cu toate acestea, a existat o scădere semnificativă a SDNN, indicând înrăutățirea CAN (P Vizualizați acest tabel:

  • Vizualizați în linie
  • Vizualizați fereastra pop-up

Intermediari ai ciclului TCA de bază și aminoacizi la participanții la studiu

Corelarea metaboliților cu măsuri de CAN în diabetul de tip 1 la momentul inițial și urmărirea de 3 ani

Tabelul 3 și Fig. 1 arată corelațiile Pearson între măsurătorile CAN și nivelurile inițiale ale metaboliților la participanții cu diabet de tip 1. Figura 2 arată corelațiile Pearson între nivelurile inițiale ale metabolitului și modificarea măsurătorilor CAN la momentul inițial și la urmărirea pe 3 ani a metaboliților semnificativi într-un model specific căii. După cum s-a observat, niveluri mai ridicate de fumarat de bază au fost asociate cu agravarea parametrilor CAN de bază (SDNN, r = -0,46, P = 0,003; RMSSD, r = -0,40, P = 0,01; pNN50, r = -0,45, P = 0,003). În mod similar, nivelurile de citrat de bază mai ridicate au fost asociate cu parametri CAN de bază mai slabi (RMSSD, r = -0,51, P = 0,003) (Tabelul 3). Între timp, nivelurile inferioare ale ambilor aminoacizi asparagină (SDNN, r = 0,42, P = 0,007) și glutamină (SDNN, r = 0,51, P = 0,001) au fost corelate pozitiv cu SDNN inițial. Corelația întregului panou de metaboliți și a tuturor măsurilor CAN inițiale sunt reprezentate în tabelul suplimentar 2. Rata estimată de filtrare glomerulară de bază (eGFR) și raportul microalbumină-creatinină în urină nu au nicio relație cu valoarea inițială, anul 3, sau modificarea măsurilor CAN.

Corelația între parametrii CAN inițiali și cei de 3 ani cu metaboliții de bază și componentele principale

A: Diagrama schematică a metaboliților modificați care se asociază cu parametrii CAN. Metaboliții evidențiați la ovalele roșii sunt crescute la subiecții cu diabet zaharat de tip 1 și corelați pozitiv cu SDNN inițial și RMSSD, cei la ovali plini de verde sunt scăzuți la subiecții cu diabet zaharat și corelat pozitiv cu SDNN și RMSSD la momentul inițial și la urmărire prin corelația Pearson cu parametrii CAN inițiali, reprezentați între paranteze ca (SDNN/RMSSD)], iar cei din ovalele pline de galben sunt scăzute la subiecții cu diabet zaharat și sunt corelați pozitiv cu SDNN și RMSSD la urmărire și diferența dintre SDNN și RMSSD de la linia de bază și urmărire [valorile r prin corelația Pearson la parametrii CAN de urmărire pe 3 ani, reprezentați între paranteze ca (SDNN/RMSSD)]. OAT, transfer de amino ornitină; P5CS, pirolină 5-carboxilat sintetază.

Nivelurile inițiale de glutamină și ornitină au fost, de asemenea, corelate cu SDNN la urmărirea de 3 ani (glutamină, r = 0,60, P = 0,005; ornitină, r = 0,45, P = 0,005) (Tabelul 3 și Fig. 1). Asocierea nivelurilor inițiale de glutamină cu valoarea inițială a SDNN și urmărirea pe 3 ani a rămas semnificativă chiar și după ajustarea timp de ani de diabet, antecedente de fumat, HbA1c inițial, glicemie, IMC, colesterol total, raportul urină albumină-creatinină și eGFR (P = 0,014 și respectiv P = 0,005). Cu alte cuvinte, nivelurile crescute de citrat și fumarat și scăderea nivelului de glutamină și asparagină la momentul inițial au fost asociate cu niveluri mai scăzute de SDNN la momentul inițial, indicând înrăutățirea CAN. Relația cu glutamina de bază și ornitina cu SDNN a fost menținută la urmărirea de 3 ani. Corelația întregului panou de metaboliți și măsurile CAN pe 3 ani sunt reprezentate în Tabelul suplimentar 3.

După cum s-a observat în Tabelul 3, nivelurile mai scăzute de ornitină inițială au fost asociate cu agravarea mai multor parametri CAN de la momentul inițial până la urmărirea de 3 ani (SDNN, r = 0,37, P = 0,024; RMSSD, r = 0,466, P = 0,003; HF putere, r = 0,342, P = 0,036; raport 30:15, r = 0,353, P = 0,03; raport E: I, r = 0,365, P = 0,024). Asocierea nivelurilor inițiale de ornitină cu modificarea RMSD, raportul 30:15 și raportul E: I peste 3 ani a rămas semnificativă chiar și după ajustare pentru vârstă, ani de diabet, antecedente de fumat, IMC, HbA1c inițial, glicemie, colesterol, raportul microalbumină-creatinină în urină și eGFR). Corelația întregului panou de metaboliți și modificarea măsurilor CAN sunt reprezentate în tabelul suplimentar 4.

Pentru a explica corelația strânsă dintre mulți metaboliți, am redus dimensiunile grupurilor de metaboliți similari pe baza contextului biologic folosind analiza componentelor principale. Am constatat că componenta principală reprezentând glutamină, asparagină și α-cetoglutarat (cale anaplerotică/gluconeogeneză) și componenta principală reprezentând glutamină și ornitină (sinteza ornitinei) ambele corelate pozitiv cu SDNN inițial și SDNN de 3 ani, indicând măsuri CAN înrăutățite ( Tabelul 3). În mod similar, componenta principală care reprezintă metaboliții TCA modificați citrat, α-cetoglutarat și fumarat s-au corelat negativ cu SDNN de bază. Prin urmare, modificările metabolitului asociate cu parametrii CAN sunt specifice căilor și relevă modificări sistematice ale modelelor metabolitului (Fig. 2).

Discuţie

Acesta este primul studiu care explorează asocierea dintre CAN și intermediari ai metabolismului central al carbonului (metaboliți ai ciclului TCA și aminoacizi) utilizând o abordare metabolomică țintită. În acest studiu, am demonstrat că subiecții cu diabet zaharat de tip 1 aveau perturbații inițiale la niveluri de mai mulți aminoacizi și niveluri mai mici de fumarat în plasmă comparativ cu subiecții martor sănătoși. Nivelurile de bază mai ridicate ale metaboliților ciclului TCA, cum ar fi fumarat și citrat, au fost, de asemenea, asociate cu măsuri SDNN mai scăzute în diabetul de tip 1, indicând măsuri CAN înrăutățite. Mai mult, nivelurile de glutamină inițiale mai mici asociate cu măsuri SDNN mai mici la momentul inițial și la urmărirea de 3 ani, indicând înrăutățirea măsurilor CAN după ajustarea pentru alți factori de risc tradiționali. În mod similar, nivelurile inițiale de ornitină sunt asociate cu modificări ale SDNN și RMSDD măsurate la urmărirea de 3 ani după ajustarea variabilelor clinice.

Hiperglicemia este, în general, recunoscută ca fiind factorul motor pentru majoritatea complicațiilor diabetului. În studiul nostru, asociațiile de metaboliți cu măsurile CAN au rămas neafectate de concomitent glicemia din aceeași probă și de controlul pe termen lung al glicemiei sub formă de HbA1c. Creșterea fluxului de glucoză poate duce la producerea în aval de produse finale avansate de glicație, poliol, hexozamină, protein kinază C și căi polimerazice poli (ADP-riboză). Stresul oxidativ, apoptoza și inflamația sunt, de asemenea, consecințele fluxului crescut mai sus (32). Glucotoxicitatea diabetică împreună cu acești metaboliți TCA modificați pot contribui la modificări ale proteinelor care includ glicația, carbonilarea, nitrația, cisteina S-nitrozilarea, acetilarea, sumoilarea, ADP-ribozilarea, O-GlcNAcilarea și succinilarea (33). În plus, succinatul și alți derivați TCA acționează asupra receptorilor și căilor specifice către efectul stresului oxidativ și al inflamației (34,35). Prin urmare, ciclul Krebs conservat intermediari care se asociază negativ cu măsurile CAN ar putea conduce la modificări ale proteinelor posttranslaționale modificate, legându-se de receptori, stres oxidativ și inflamație în diabetul de tip 1.

Atât SDNN, cât și RMSSD sunt indici ai variabilității ritmului cardiac în timp. Deși corelați, acești indici oferă informații despre diferite aspecte ale modulației autonome. Este larg acceptat faptul că SDNN este o măsură largă a modulației simpatice și parasimpatice a HRV, în timp ce RMSSD caracterizează în principal efectul parasimpatic (43). În CAN diabetic, interacțiunile dintre tonul și funcția simpatică/parasimpatică sunt complexe și modificările diferiților indici pot să nu fie complet sincronizate, cu modificări ale unor măsuri înainte de altele. SDNN și RMSSD sunt indicatori foarte timpurii ai CAN, iar modificările acestor indicatori preced, de obicei, formele manifeste ale CAN cu mulți ani. Având în vedere că participanții înscriși în acest studiu observațional nu au avut dovezi de complicații la momentul inițial (conform proiectului studiului) și, prin urmare, se află într-un stadiu preclinic foarte precoce al CAN, este de conceput să se observe selectivitatea în relația dintre anumiți indici HRV și metaboliți specifici. Descoperirile noastre ar putea sugera, de asemenea, mecanisme diferențiate care contribuie la modularea diferitelor aspecte ale sistemului nervos autonom în stadiile incipiente ale bolii care ar putea fi vizate.

Glutamina de bază inferioară și nivelurile de fumarat, citrat și piruvat de bază inferioare sunt legate de măsuri CAN mai slabe la momentul inițial și posibil disfuncție nervoasă autonomă. Nivelurile de ornitină sunt asociate cu agravarea măsurilor CAN la urmărire, indicând posibil o deficiență timpurie asociată cu cauzalitatea. Acest model distinct de metabolit poate sta la baza aspectelor unice ale fiziopatologiei prezenței și dezvoltării CAN. În plus, acești metaboliți ar putea servi ca biomarker pentru disfuncția autonomă la pacienții cu diabet de tip 1 și ca rezultat în studiile exploratorii de terapii pentru CAN timpuriu. Deși aceste tipare sunt foarte informative, aceste constatări trebuie confirmate într-o cohortă independentă mai mare, cu putere adecvată.

CAN este un predictor independent al progresiei bolii renale diabetice, iar pacienții cu boli renale cronice mai avansate sunt, de asemenea, mai predispuși să aibă CAN (5-7). Conform proiectului studiului, niciunul dintre pacienți nu a prezentat dovezi ale bolii renale diabetice, dovadă fiind creatinina normală și absența microalbuminuriei. De asemenea, nu au existat relații ale raportului inițial eGFR sau al raportului microalbumină-creatinină din urină cu măsurile CAN la momentul inițial sau anul 3 sau cu modificarea CAN în perioada de urmărire. Nici eGFR, nici raportul microalbumină-creatinină din urină nu au diminuat relația dintre metaboliții inițiali și măsurile CAN. Prin urmare, putem concluziona în mod rezonabil că relația acestor metaboliți și măsurile CAN este independentă de funcția renală.

Informații despre articol

Finanțarea. Această lucrare este susținută parțial de subvenții de la Centrul pentru Revizuire Științifică, Institutele Naționale de Sănătate (NIH) (P30DK081943, DK089503, DK082841, DK097153, K08HL130944 și 1R01HL102334-01) și subvenția Asociației Americane a Diabetului 1-14-MN-02 . Această lucrare a utilizat Servicii de bază susținute de grantul DK097153 al NIH către Universitatea din Michigan.

Dualitatea interesului. Nu au fost raportate potențiale conflicte de interese relevante pentru acest articol.